Расшифровка гтд: Номер таможенной декларации (ДТ,ГТД). | Растаможить груз в CПб

Содержание

Далее вы найдете оглавление. Чтобы перейти к разделу, щелкните соответствующий заголовок.

1. Введение

Задача этого проекта — изучить террористические события в мире с 1970 по 2015 год.

Основные цели:

• для выявления и выделения географических и временных моделей терроризма,
• , чтобы раскрыть основные параметры успешного теракта, и
• , чтобы пользователь мог настраивать анализ и исследовать данные наиболее интерактивным способом.

Идея проекта заключается в том, чтобы выяснить, как терроризм развился в западном мире и нужно ли нам возводить высокие стены, чтобы защитить себя от будущих угроз. Мы выбрали нашу тему более глобальной, потому что

• Он позволяет агрегировать на многих географических уровнях, включая земной шар, регионы, страны, штаты и города
• Он очень разнообразен и содержит много интересных атрибутов
• Имеются временные и географические данные

Более общую информацию о проекте вы найдете в видео ниже.

SocialData2017 из polakowo на Vimeo.

2. Набор данных

Набор данных является очень полным и содержит много информации, связанной с терроризмом. Мы загрузили весь набор данных Global Terrorism Database , доступный на домашней странице Gtd. Он содержит 156 772 теракта x 137 элементов, и занимает 142,3 МБ дискового пространства. Стоит отметить, что он почти полностью закодирован (строки / длинные числа в короткие числа).Чтобы декодировать набор данных, мы просмотрели кодовую книгу, доступную здесь. После изучения кодовой книги мы обнаружили, что некоторые столбцы являются избыточными или неактуальными, которые мы удалили. См. Соответствующий блокнот Cleaning Data для получения дополнительной информации о нашем подходе.

Мы закончили работу над 23 колонками, которые содержат как количественную, так и качественную информацию, представляющую основной интерес. После этапов декодирования, очистки, фильтрации и кодирования мы получили 156772 строки x 23 столбца, или эквивалентно 26.8 МБ дискового пространства

Вы можете скачать очищенный набор данных по этой ссылке, чтобы попробовать его самостоятельно!

2.1. Колонны

Ниже вы найдете основную информацию о столбцах, которые мы использовали в диаграммах.

Первая таблица содержит числовые данные:

Название столбца	Тип	Мин.	Максимум	NaN	Описание
год	int	1970 г.	2015 г.	Никто	Год
убито	int	0	1500	Никто	Общее количество погибших
nkilledter	int	0	500	Никто	Число погибших преступников
раненых	int	0	5500	Никто	Общее количество раненых
nwoundedter	int	0	200	Никто	Количество раненых преступников
шир.	плавать	-53.1546	74,6336	Никто	Широта (города)
лон	плавать	-176,176	179,367	Никто	Долгота (города)

Вторая таблица содержит категориальные данные:

Название столбца	Уникальный	верхний	NaN	Описание
регион	12	Ближний Восток и Северная Африка	Никто	Область, край
страна	204	Ирак	Никто	Страна
оружие тип	12	Взрывчатка / бомбы / динамит	7. 59%	Тип оружия
тип атаки	9	Бомбардировка / взрыв	3,38%	Тип атаки
targettype	22	Частные лица и собственность	2.46%	Тип цели / жертвы
gname	3216	Неизвестный	46,41%	Название группы преступников

Подсказка: каждая категориальная функция закодирована целыми числами для экономии места. Поэтому мы вводим глобальный словарь JSON с именем строк.json , содержащий карту всех целых чисел в соответствующие им строки. Процесс декодирования происходит после того, как данные были успешно загружены во внешний интерфейс, поэтому ни одна из диаграмм не должна заботиться об этом.

Возможно, вы уже заметили, что количество столбцов меньше 23. Мы ограничили объем информации, чтобы иметь возможность быстро доставлять информацию и сделать диаграммы более гибкими (= менее запаздывающими). Ниже вы найдете необязательные столбцы, которые мы пропустили.

3. Графики

Диаграммы жизненно важны для представления данных. Они используются как в исследовательском, так и в описательном анализе. Поскольку большинство агрегаций требует много времени, мы передаем их на аутсорсинг. Каждую важную задачу мы выполняем в два этапа:

1. Используйте iPython для обработки данных, например, для применения фильтров, выполнения агрегирования и т. Д.
2. На стороне клиента используйте d3.js , который облегчает создание и обработку веб-документов с данными для создания красивых интерактивных визуализаций данных.

3.1. Гистограмма

Эта гистограмма направлена ​​на изучение временных моделей терроризма с 1970 по 2015 год.

Главный вопрос, который мы решаем:

Как терроризм развивался с течением времени с точки зрения географических единиц, типов или террористических групп?

Нас интересует временной аспект развития терроризма, который затрагивает множество интересных атрибутов:

1. Географические единицы в виде регионов, стран, штатов и городов
2. Типы, такие как типы оружия, атаки и цели
3. Террористические группы

Мы реализовали следующие интересные функции:

• Выберите основную категорию (например, Регион )
• Выберите товар из выбранной категории (например, Западная Европа )
• Выберите показатель (например, Убито )
• Наведите указатель мыши на полосу, чтобы отобразить долю за год в% (например, 7% всех жертв в Западной Европе были убиты в год 1988 ).

3.2. Диаграмма рассеяния

Вторая диаграмма представляет собой диаграмму рассеяния, которая кодирует 3 числовых атрибута.

• X: Убито ,
• Y: раненых и
• Размер: Количество

Главный вопрос, который мы решаем:

Что такое

• наиболее смертоносных видов оружия,
• наиболее эффективных типов атак и
• наиболее уязвимых типов целей

в выбранной географической единице?

Мы реализовали следующие интересные функции:

• Выберите уровень агрегирования (например, Страна )
• Выберите элемент на выбранном уровне (напр.г., Германия )
• Выберите категориальную переменную (например, Тип цели )
• Выберите роль ( жертвы или террористов )
• Переключение между метриками относительных (среднее за атаку) и абсолютных (сумма)
• Наведите указатель мыши на круг, чтобы отобразить метку и количество атак.

Родственник Абсолютное

3.3. Хороплет

На диаграмме рассеяния выше есть одна большая проблема: мы можем отобразить до ~ 30 кругов, прежде чем у нас закончится место. Но что, если бы мы хотели сравнить страны? Даже на прямоугольной карте с проекцией Меркадор нам нужен какой-то зум. Чтобы решить проблему, мы решили другое, более сложное, но тоже интересное решение: нанесите на карту страны виртуальный глобус и позвольте пользователю вращать его!

Главный вопрос, который мы решаем:

Как страны сравнивают друг друга с точки зрения терроризма?

Мы реализовали следующие интересные функции:

• Выберите категорию (напр.г., Террористическая группа )
• Выберите товар из выбранной категории (например, Taliban )
• Выберите показатель (например, Убито )
• Выберите год на ползунке или медленно переместите ползунок, чтобы анимировать изменение глобального терроризма
• Нажмите на Time Machine , чтобы автоматически воспроизвести анимацию с 1970 по 2015 год …
• Перетащите земной шар, чтобы повернуть его, или щелкните страну одним щелчком мыши, чтобы перейти к ней
• Наведите указатель мыши на страну, чтобы отобразить ее название и показатель.

3.4. К-средние

K-Means — это первый алгоритм распознавания образов, который мы будем использовать для анализа. Используя K-Means, мы можем разделить террористические атаки на группы (по крайней мере, это идея), чтобы увидеть, как терроризм распространяется географически.

Главный вопрос, который мы решаем:

Террористические атаки образуют какие-то географические группы? Есть ли какие-нибудь визуальные закономерности?

Мы реализовали следующие интересные функции:

• Выберите категорию (напр.г., Террористическая группа )
• Выберите товар из выбранной категории (например, Taliban )
• Выберите показатель (например, Убито )
• Выберите переменную K, которая представляет количество групп (например, 3 )
• Наведите указатель мыши на шестиугольник / центроид, чтобы отобразить количество вложенных атак
• Каждый большой круг представляет собой центроид — центр каждой группы атак
• Шестиугольники одного цвета принадлежат одному разделу.

3,5. K-Ближайшие соседи

Второй алгоритм распознавания образов — k-Nearest Neighbours, который представляет собой алгоритм классификации и регрессии. Используя kNN, мы можем классифицировать любую точку земного шара на основе ее (k-) соседей.

Главный вопрос, который мы решаем:

Что, если бы мы знали, что где-то на земном шаре произойдет теракт, какого типа он будет?

Мы реализовали следующие интересные функции:

• Выберите тип (например,г., Тип оружия )
• Выберите количество групп ( k ) на слайдере (например, 3 )
• Вы также можете настроить k , прокручивая вверх и вниз
• Наведите указатель мыши на карту, чтобы классифицировать нижележащую точку и отобразить связанных соседей

4. Дополнительная информация

Некоторая (необязательная) информация была пропущена, чтобы уменьшить размер веб-страницы, поэтому вы можете продолжить чтение в Блокноте объяснения. Вы также можете быть заинтересованы в тестировании, для этого клонируйте репозиторий, загрузите и импортируйте данные и наслаждайтесь анализом.

Генетически закодированные датчики позволяют декодировать передачу в здоровом и больном мозге с помощью микро- и наноскопических методов.

Дисфункция нейронной коммуникации является основной причиной множества психических и неврологических расстройств. Крупные исследования генетических ассоциаций показывают, что структурные и функциональные изменения в быстрой передаче опосредуются быстродействующими передатчиками, т.е.например, глутамат и гамма-аминомасляная кислота (ГАМК) могут быть ответственными за общую патологию, лежащую в основе многих симптоматически различных когнитивных расстройств [1, 2]. Подтверждая эту точку зрения, электрофизиологические и другие функциональные исследования выявили различные аберрантные синаптические механизмы, лежащие в основе патогенеза заболеваний [3, 4]. Исследования нейромодуляции показали, что медленная передача, опосредованная медленными передатчиками, такими как ацетилхолин (ACh), моноамины и нейропептиды, участвует во множестве физиологических и патологических процессов. Точно так же нарушение регуляции медленной нейромодуляторной передачи связано с основными нарушениями мозга, включая зависимость, болезнь Альцгеймера, аутизм, сердечно-сосудистые заболевания, депрессивные расстройства и шизофрению, расстройства пищевого поведения, эпилепсию и нарушения сна [5,6,7,8,9,10] . Однако, в отличие от исследований глутаматергической и ГАМКергической нейротрансмиссии, определение синаптической регуляции и дисрегуляции нейромодуляторных передач остается сложной задачей, которая затрудняет попытки механического понимания поведения и заболеваний, связанных с нейромодуляцией.

Медленное продвижение в определении свойств передачи нейромодуляторной коммуникации в первую очередь связано с ограничениями доступных в настоящее время инструментов для мониторинга нейромодуляторных передач. Патч-зажим записи, которые могут сделать надежные повторяющиеся измерения выдающихся токовых ответов быстрой передачи, служат основным методом для исследования фундаментальных синаптических свойств глутаматергической и ГАМКергической передачи [11, 12]. Тем не менее, небольшие и быстро десенсибилизирующие нейромодуляторные ответы делают записи патч-кламп или электрофизиологию неэффективными для разграничения синаптических параметров нейромодуляторной передачи [13, 14].Другие доступные в настоящее время инструменты мониторинга нейромодуляторной передачи также не работают с этой проблемой. Например, хотя чувствительность обнаружения микродиализа, часто используемого метода, была улучшена в последние годы, плохое пространственное и временное разрешение по-прежнему ограничивает его способность оценивать динамику холинергических и моноаминергических сигналов [15, 16]. Циклическая вольтамперометрия с быстрым сканированием обеспечивает превосходную наномолярную чувствительность и миллисекундное временное разрешение, но этот подход к обнаружению сдерживается его низким пространственным разрешением и неспособностью различать норэпинефрин (NE) и дофамин (DA) [17].Недавние усилия привели к разработке флуоресцентных сенсоров ACh и моноаминов на основе резонансного переноса энергии Фёрстера и клеток [18, 19]. Однако низкая чувствительность и / или низкое разрешение этих датчиков позволяет обнаруживать только передачу размера объема, что исключает их применение в разрешении синаптических свойств нейромодуляторной передачи. Ограничения, тем не менее, вызывают большее желание разработать удобные для пользователя и широко применимые генетически закодированные сенсоры нейромедиаторов, которые позволяют проводить тканеспецифичные измерения нейромодуляторной передачи с высоким разрешением [20, 21].

Генетически закодированные сенсоры нейромодулирующего передатчика

Недавно колоссальными коллективными усилиями инструментальных инженеров и биологов было получено несколько генетически закодированных сенсоров на основе интенсивности для ACh и моноаминов (Рис. 1). Эти сенсоры состоят из конформационно чувствительного GFP с круговой перестановкой (cpGFP) и лиганд-связывающего белка, который изменяет флуоресценцию cpGFP, вызывая конформационные изменения при связывании трансмиттера (рис. 1A). Были созданы две основные группы генетически кодируемых сенсоров-трансмиттеров: сенсоры на основе рецепторов, связанных с G-белками (GPCR) и бактериальных периплазматических связывающих белков (PBP).Сенсоры на основе GPCR, в которых третья внутриклеточная петля первичных GPCR заменена на cpGFP, часто наследуют превосходную мембранную поверхностную транспортировку, сродство связывания лиганда и фармакологические свойства от своих GPCR-прародителей и часто готовы к обнаружению эндогенно высвобождаемых трансмиттеров [22]. , 23]. Однако эти сенсоры могут иметь ограниченную динамику и / или медленную кинетику из-за медленной кинетики прародителей и ограниченных конформационных изменений, связанных со связыванием лиганда [24,25,26].Поскольку PBP имеют более низкое сродство со своими лигандами, создание сенсоров на основе PBP с чувствительностью, соответствующей уровням эндогенного медиатора, может потребовать кропотливой эволюции, однако эти усилия могут привести к созданию высокопроизводительных сенсоров с быстрой кинетикой и большой динамикой [27,28,29, 30]. Транспортировка сенсоров на основе PBP через мембранную поверхность может быть менее оптимальной, но эти сенсоры обычно более пригодны для нацеленной экспрессии в других субклеточных компартментах. Таблица 1 суммирует свойства недавно разработанных генетически кодируемых сенсоров для ACh и моноаминов.

A Схема генетически кодируемых сенсоров на основе G-белкового рецептора (GPCR) и бактериального периплазматического связывающего белка (PBP) для нейромодулирующих передатчиков. B Схема вирусной экспрессии, применения генетически кодированных сенсоров in vivo и ex vivo. C Схема микроскопического анализа со сверхразрешением и / или деконволюцией данных изображения, полученных с помощью генетически закодированных сенсоров. D Трехмерное пространственно-временное профилирование синаптической передачи. Обратите внимание на сбор образцов экспериментальных данных на животных, сделанный с помощью недавно опубликованного проекта [32].

Генетически закодированные сенсоры ACh включают GRAB _ACh3.0 и GRAB _ACh4.0 на основе GPCR [24, 31], а также iAChSnFR на основе PBP с зеленой и желтой флуоресцентными версиями [29] (Таблица 1).Прямое сравнение перфорации сенсоров GRAB _ACh и iAChSnFR в одном медиальном энторинальном кортикальном препарате выявило несколько ключевых различий между этими двумя семействами сенсоров [29, 32]. Хотя сенсоры GRAB _ACh давали устойчивые флуоресцентные ответы, их унаследованная медленная кинетика значительно ослабляла и задерживала высокочастотные холинергические сигналы; они были отличными детекторами бинарных холинергических сигналов [24, 31]. iAChSnFR намного лучше справлялись с отслеживанием холинергических сигналов во всем частотном диапазоне [29, 32].Хотя флуоресцентный ответ ΔF / F iAChSnFRs меньше оптимального, датчики действительно имеют большой динамический диапазон отклика для улучшения флуоресцентных ответов [29].

В настоящее время доступны два датчика норэпинефрина (NE) на основе GPCR, GRAB _NE1m и GRAB _NE1h (Таблица 1), при этом GRAB _NE1m лучше справляется с обнаружением эндогенных адренергических сигналов [33]. Мы экспрессировали iAChSnFR и GRAB _NE1m в одном и том же препарате миндалины, чтобы сравнить их способность к измерению эндогенных сигналов, и результаты показали, что GRAB _NE1m не может соперничать с iAChSnFR по скорости и величине флуоресцентного ответа [32].Тем не менее, GRAB _NE1m все еще может следовать относительно более медленной адренергической передаче ([32]; наши неопубликованные данные). Эти результаты вселяют надежду на то, что GRAB _NE1m может разрешить основные свойства передачи адренергической модуляции, даже несмотря на то, что эксперименты могут быть технически сложными из-за небольших ответов адренергической флуоресценции [32].

Существуют генетически кодируемые сенсоры серотонина (5-гидрокситриптамин или 5HT) как на основе GPCR, так и на основе PBP (таблица 1) [34, 35]. GRAB _5HT0.5 и GRAB _5HT1.0 на основе GPCR эффективно детектируют серотонинергические сигналы в популяциях клеток [34]. GRAB _5HT0.5 показал лучшие результаты при оценке эндогенных одноклеточных серотонинергических сигналов и может служить жизнеспособным инструментом для анализа свойств передачи серотонинергической модуляции, предположительно из-за его кинетики и аффинности, более близких к динамике и концентрации эндогенно высвобождаемого 5HT. [32, 34]. ISeroSnFR на основе PBP сообщил о заметных эндогенных серотонинергических сигналах в популяциях клеток [35].Однако, учитывая его относительно более низкую чувствительность (по сравнению с GRAB _5HT ) [34, 35], он ждет, чтобы увидеть, может ли сенсор обнаруживать одноклеточные и субклеточные серотонинергические сигналы.

Два семейства сенсоров дофамина на основе GPCR (3,4-дигидроксифенэтиламин или DA), человеческий D ₂ на основе дофаминового рецептора GRAB _DA [25, 36] и человеческий D ₁ на основе дофаминового рецептора dLight [ 26, 37], сконструированы (табл. 1). GRAB _DA1m , GRAB _DA1h , GRAB _DA2m и GRAB _DA2h являются зелеными версиями генетически кодируемых датчиков DA, ​​в то время как rGRAB _DA1m и rGRAB _DA1h принадлежат к первым красным версиям генетически кодируемых нейронов. датчики передатчика [25, 36].Датчики dLight также имеют несколько версий с несколько разными свойствами [26, 37]. Наиболее эффективные GRAB _DA2m и dLight ₁ зарегистрировали устойчивые дофаминергические сигналы от популяций клеток в полосатом теле [32, 36] и базальной миндалине [38], которые получают самые тяжелые дофаминергические иннервации с, вероятно, самыми большими дофаминергическими сигналами [38, 39,40]. Недавнее добавление — это красная версия D ₂ на основе дофаминового рецептора генетически кодируемого датчика DA, RdLight ₁ [41], еще больше расширяющая набор инструментов для датчиков DA.Прямое экспериментальное сравнение показало, что GRAB _DA2m вызывал несколько более выраженные одноклеточные дофаминергические ответы с лучшим отношением сигнал / шум по сравнению с dLight ₁ в том же препарате полосатого тела [32, 36]. В то время как чрезвычайно низкая базовая флуоресценция dLight ₁ часто препятствует идентификации отдельных экспрессирующих клеток, dLight ₁ , по-видимому, имеет немного более высокую селективность по сравнению с NE, чем GRAB _DA2m [26, 36]. Остается неясным, способны ли GRAB _DA2m и dLight ₁ обнаруживать умеренные одноклеточные дофаминергические сигналы в других областях мозга, таких как префронтальная кора и гиппокамп.

Новый метод анализа на основе сенсоров

Разработка генетически закодированных передающих сенсоров открывает возможности для революционных достижений в исследованиях нейромодуляции. Хотя многие исследователи используют новые датчики просто как чувствительные детекторы для отслеживания динамических нейромодулирующих сигналов, как утверждают недавние обзоры [22, 23, 42, 43], эти датчики на самом деле могут делать больше. Новые генетически закодированные нейромодуляторные сенсоры случайно испускают большое количество фотонов, причем их флуоресцентные ответы в значительной степени не зависят от уровней экспрессии [29, 32,33,34].Приятные свойства в сочетании с последними достижениями микроскопии сверхвысокого разрешения и / или деконволюции [44, 45] позволяют количественно оценить свойства передачи нейромодуляции [11], что важно для разграничения физиологии поведения и патогенеза заболеваний. [1,2,3,4].

Первоначальные эксперименты продемонстрировали, что высокопроизводительные сенсоры могут определять синаптические свойства нейромодуляторной передачи [29, 32,33,34]. К сожалению, существует значительное количество недавно опубликованных инструментов или методов «доказательства принципа», которые оказались биофизически не интерпретируемыми, методологически невоспроизводимыми и / или биологически неприменимыми [46, 47].Чтобы неукоснительно представить этот метод микроскопического анализа сверхразрешения и деконволюции на основе генетически закодированного нейромедиатора, сенсора, мы представляем его биофизическую основу, практические решения, биологическую валидацию и широкую применимость.

Биофизическая основа

С 16 по 19 века мастерство проб и неудач является основным средством улучшения микроскопических изображений. В конце 19-го века напряженная вычислительная работа Эрнста Аббе, подтвержденная экспериментами, проведенными в мастерской Carl Zeiss, продемонстрировала, что только зная точное поведение света, можно получить представление обо всех решающих факторах, влияющих на характеристики микроскопа, и контролировать их [48]. .Эта работа привела Аббе к выводу, что волновая оптика и дифракция накладывают фундаментальные ограничения на способность изображения или предел разрешения Аббе [49]. Он дает минимальное расстояние ∆ x между двумя различимыми объектами как

$$ \ Delta X _ {{\ mathrm {Abbe}}} = {\ uplambda} / \ left ({2n \ bullet {\ mathrm {Sin}}) \ alpha} \ right) \ Equiv {\ uplambda} / 2 {\ mathrm {NA}}, $$

(1)

, где n дает показатель преломления среды, в которой делается изображение, α — максимальный угол между оптической осью и всеми лучами, захваченными объективом микроскопа, а NA — числовая апертура, используемая для описания разрешения. микроскопа.

Позже многие исследователи пересмотрели концепцию предела разрешения и предположили, что в принципе совместный захват множества фотонов может увеличить разрешение за пределами дифракционного предела Аббе [50, 51]. На практике только за последние ~ 20 лет стремительный инструментальный и биологический прогресс привел к многочисленным возможным приложениям, особенно в биологии, которые обычно выходят за дифракционный предел, явление, называемое «сверхразрешением». Появился ряд инструментов визуализации с высоким разрешением, включая микроскопию сверхвысокого разрешения, микроскопию световых пластин, микроскопию структурированного освещения, конфокальную микроскопию, многофотонную микроскопию, микроскопию деконволюции и другие.Многие из них можно разделить на две основные группы: микроскопия сверхвысокого разрешения и микроскопия деконволюции, где другие трудно отнести к какой-либо из групп, поскольку они содержат свойства обоих [52, 53].

Посредством аппаратной оптимизации микроскопия сверхвысокого разрешения (например, микроскопия фотоактивированной локализации, микроскопия стохастической оптической реконструкции и микроскопия истощения стимулированного излучения) может достичь превосходного улучшения разрешения при увеличении числа фотонов, следуя уравнению

$$ \ Delta X_ {{\ mathrm {superresolution}} \, {\ mathrm {microscopy}}} \ sim \ Delta X _ {{\ mathrm {Abbe}}} \ bullet N ^ {- 1/2}, $$

(2)

, где N представляет количество обнаруженных фотонов.Такое благоприятное масштабирование разрешения позволяет микроскопии сверхвысокого разрешения принципиально превосходить классический дифракционный предел и в большинстве приложений достигать диапазона разрешения менее 100 нм с возможностью достижения разрешения ~ 10 нм или вплоть до разрешения одной молекулы [45, 52, 54]. Компромисс микроскопии сверхвысокого разрешения заключается в скорости получения изображений, особенно в приложениях для получения изображений живых существ с широким полем зрения, которые требуют высокого временного разрешения. Кроме того, микроскопические процедуры со сверхвысоким разрешением часто отбрасывают данные от скопившихся молекул с перекрывающимися изображениями, тратя зря ценную информацию изображения, частично ухудшенную из-за перекрытия.{- 1/4}, $$

(3)

Быстро расширяющееся применение деконволюционной микроскопии связано, в основном, с новыми генетическими инструментами, которые дают больше собираемых фотонов и оперативно улучшают вычислительные алгоритмы [53, 55, 56]. Учитывая, что высокопроизводительные сенсоры с генетически закодированными нейротрансмиттерами могут достигать плотной экспрессии флуорофоров и испускать большое количество фотонов при связывании передатчика, можно получить живую визуализацию высвобождения передатчика в широком поле с разрешением ~ 100-200 нм и разрешить многие фундаментальные синаптические свойства нейротрансмиссии [32].Конечно, неблагоприятное масштабирование разрешения N ^-1/4 для микроскопии с деконволюцией означает, что умеренное увеличение разрешения требует большого увеличения числа фотонов, что делает улучшение разрешения менее экономически выгодным. Комбинированные микроскопические методы деконволюции и сверхвысокого разрешения, которые могут обеспечить как высокое разрешение, так и высокую скорость визуализации, являются отличными альтернативными подходами [57, 58].

Вышеупомянутые оптические свойства предсказывают, что генетически закодированные сенсоры нейротрансмиттеров могут производить надежные измерения высвобождения нейромодулирующих передатчиков с нано- и микромасштабным пространственно-временным разрешением.Измерения могут предложить достаточно точные оценки фундаментальных синаптических свойств нейромодуляторной передачи, таких как степень диффузии передатчика, количество сайтов высвобождения, размер пула высвобождения, вероятность высвобождения, квантовый размер и скорость пополнения [11, 59]. Определение синаптических параметров создает научную основу для исследования регуляции, функции, а также краткосрочной и долгосрочной пластичности нейромодуляторной передачи и устанавливает базовый уровень нейромодуляции для тестирования и разработки лекарств.

Практические решения

Следование хорошим практическим решениям является центральным для точных измерений синаптических свойств нейромодуляторной передачи, особенно учитывая то, что многие генетически закодированные датчики еще предстоит оптимизировать, чтобы они соответствовали этой задаче. Выбор наиболее эффективных датчиков — это первый ключевой шаг. iAChSnFR, GRAB _NE1m и GRAB _5HT0.5 выявили устойчивые, но вариабельные одноклеточные ответы во всех исследованных ex vivo и in vivo нейрональных и ненейрональных тканях [29, 32,33,34], что подтверждает их применимость в разрешение трансмиссионных свойств в общих тканевых препаратах ([32]; наши неопубликованные данные).GRAB _DA2m и dLight ₁ могли бы выполнить ту же задачу в полосатом теле [25, 26, 32, 36], но не могли бы в других областях мозга ([32]; наши неопубликованные данные). Остальные датчики требуют дальнейшей оценки. Поскольку существующие генетически закодированные сенсоры нейромодулирующего передатчика разработаны очень немногими строгими исследовательскими группами, можно сделать вывод об относительной производительности сенсоров, созданных из тех же групп, на основе заявленных специфичностей сенсоров (например, чувствительности, ΔF / F, SNR и кинетики). ) (Таблица 1).

Экспрессия генетически закодированных сенсоров трансмиттера является еще одним ключевым шагом, который может быть достигнут с помощью различных подходов к экспрессии генов, включая часто используемые системы вирусной экспрессии (например, аденоассоциированный вирус (AAV), вирусы lenti и Sindbis) (рис. 1B ). Вирус Синдбис имеет наиболее эффективное время продуцирования ~ 1,5 дня, самое короткое время экспрессии ~ 8–24 ч, наибольшую полезную нагрузку до 15 т.п.н. (готовность для совместной экспрессии нескольких трансгенов) и самые высокие уровни экспрессии (предпочтительны для высоких пространственно-временных разрешений изображений) ), хотя самое короткое жизнеспособное время экспрессии ~ 3-5 дней [60,61,62].Напротив, несколько серотипов вирусов AAV широко используются из-за их минимальной токсичности, стойкого времени экспрессии ≥6 месяцев (предпочтительно для долгосрочных физиологических и поведенческих тестов) и возможности неинвазивной доставки [63, 64]. Однако небольшая полезная нагрузка трансгена до ~ 4,5–5 т.п.н., низкая эффективность продукции вируса и медленное время экспрессии ≥3 недель являются основными ограничениями вирусов AAV. Лентивирус, который имеет относительно более быстрое производство, большую полезную нагрузку до ~ 8-10 kb, более короткое время экспрессии ~ 1-2 недели и долгоживущую экспрессию в несколько месяцев [65,66,67], предлагает решение в компромисс.

Получение и анализ изображения — это два последних ключевых этапа. Учитывая преимущества низкой потребности в инструментах и ​​применимости широкоугольной визуализации живых организмов, деконволюционная микроскопия практически используется во многих биологических приложениях. Поскольку целью микроскопического анализа с деконволюцией является «переназначение» света на его исходное место, практические решения должны быть сосредоточены на коррекции дрейфа и флуктуаций изображения, минимизации фотообесцвечивания, автофлуоресценции и шума, а также оптимизации коррекции дифракции света, многие из которых применимы к микроскопии сверхвысокого разрешения и комбинированной микроскопии деконволюции-сверхвысокого разрешения.

Дрейфы и колебания изображения могут привести к значительному артефакту переназначения света. Таким образом, оптимизация системы визуализации для минимизации дрейфа и флуктуаций стоит затраченных усилий. Электрофизиологические установки, разработанные для стабильной множественной записи патч-кламп, обычно оптимизированы для смягчения экспериментального дрейфа и флуктуаций [68, 69], и их можно легко адаптировать для получения стабильных изображений живых клеток с минимальным дрейфом и флуктуациями, легко корректируемыми с помощью функция регистрации по интенсивности [32].Фотообесцвечивание и автофлуоресценция могут привести к неверной оценке реального распределения интенсивности света и привести к ошибкам в переназначении фотонов. Выполнение алгоритмов коррекции позволяет минимизировать фотообесцвечивание и автофлуоресценцию [32, 70]. Шум, случайный процесс, ответственный за деградацию изображения, возникает из двух основных источников, включая фотонный шум, обусловленный распределением Пуассона, и электронный шум гауссовой природы, которым в современных детекторах часто можно пренебречь. Поскольку шум заметно ограничивает эффективность алгоритмов деконволюции, очень желательно включать процедуры шумоподавления на различных этапах алгоритмов деконволюции.

Дифракция света через оптическую систему, которая соответствует описанию ее функции рассеяния точки (PSF), вызывает оптическое размытие, ограничивающее оптическое разрешение. Устранение размытости — ключевой процесс деконволюционной микроскопии, который использует PSF для устранения оптического искажения, чтобы «переназначить» свет на его исходное место [71]. Следовательно, получение правильного PSF путем теоретических расчетов или эмпирических измерений имеет важное значение для качества восстановленных изображений. Поскольку теоретические модели PSF применимы только к идеальным линзам и четко определенным оптическим путям, а некоторые сферические аберрации трудно предсказать теоретически, на практике предпочтительны эмпирические измерения.Для точного определения PSF оптической системы лучше всего измерять PSF в той же системе при тех же условиях, которые использовались для получения изображения. Один простой способ получить PSF — получить изображения коммерчески доступных флуоресцентных микросфер. Теоретически лучше всего подойдут самые маленькие бусинки. Однако маленькие шарики имеют меньшую интенсивность и быстрее обесцвечиваются, и поэтому на практике более крупные шарики с диаметром меньше половины разрешения работают нормально. Чтобы уменьшить шум от эмпирически измеренных PSF, можно усреднить измерения от нескольких шариков, многократных испытаний одиночных шариков и / или нескольких круговых осей одиночных шариков [32].Важно отметить, что деконволюция больших наборов данных визуализационных эпизодов нейромодуляторных передач является вычислительно-интенсивной задачей, занимающей часы, если не дни [32]. Следовательно, для выполнения этих задач целесообразно использовать оптимизированные алгоритмы анализа и алгоритмы глубокого обучения [44].

Биологическая валидация

Для решения фундаментальных биологических вопросов использовался метод анализа изображений на основе сенсоров, который обеспечивает строгую проверку его применимости. Например, генетически закодированные сенсоры нейромедиаторов, которые позволяют впервые с высоким разрешением визуализировать пространственную диффузию эндогенно высвобождаемых нейромодуляторных передатчиков [32] (рис.1C, D), был использован для решения давнего биологического вопроса о первичном нейромодуляторном способе передачи [72, 73]. Широко принятая теория нейромодуляторной передачи, предложенная три десятилетия назад, постулирует, что основным способом межклеточной нейромодуляторной коммуникации является объемная передача, которая происходит между клетками в общих регионах, а не между конкретными клетками, которые образуют прямые цепи или контакты [74, 75] . Эта модель, в частности, предполагает, что ACh и моноамины диффундируют в локальные области, воздействуя на многие различные типы близлежащих клеток, а нейропептиды распространяются еще дальше, влияя как на локальные клетки, так и на отдаленные клетки на расстоянии миллиметров [74, 76].Основа теории основана, прежде всего, на предположении, что эндогенно высвобождаемые нейромодуляторные передатчики ведут себя так же, как и экзогенно применяемые (которые более свободно диффундируют во внесинаптическом пространстве), что еще не подтверждено какими-либо прямыми экспериментальными данными [72, 73]. Генетически закодированные сенсоры нейромодуляторных передатчиков в сочетании с микроскопическим анализом деконволюции позволили впервые непосредственно визуализировать пространственную диффузию нейромодуляторных передатчиков в отдельных местах высвобождения, давая константы длины распространения пространственной диффузии ~ 0.75 мкм как для ACh, так и для моноаминов ([32]; ср. [77,78,79]) (рис. 1C, D). Техника высокоскоростной двухфотонной визуализации позже подтвердила значение эндогенно высвобождаемого ACh в интактном мозге [29]. Эти результаты показывают, что сильно ограниченная нейромодуляторная передача без объема является ключевым режимом межклеточной коммуникации.

Интересно, что тот же анализ, проведенный с генетически кодируемым датчиком глутамата, iGluSnFR [27], дал константу длины распространения ~ 0,60 мкм для глутамата (рис. 2A – C) [32, 80], немного меньшее значение, ожидаемое для отрицательно заряженный глутамат электрофоретически подвержен влиянию возбуждающих токов [81].Более того, в сочетании с новыми сенсорами нейропептидов на основе GPCR, анализ позволил провести первые измерения нейропептидергической передачи, которые выявили сравнимую константу длины распространения ~ 0,80 мкм (рис. 2D-F). Идентичные пространственные константы длины распространения для быстро- и медленно действующих нейротрансмиттеров в разных клетках подтверждают идею о том, что синапсы оптимизируют свои пре- и постсинаптические организационные элементы в наномасштабе (включая также количество высвобождаемых передатчиков, ширину синаптических щелей и расположение постсинаптических структур). рецепторы) для максимальной эффективности и точности [82,83,84].Это попытка предположить, что, подобно быстродействующим нейротрансмиттерам глутамат (например, через рецепторы NMDA) и ГАМК (например, через рецепторы ГАМК _A , содержащие субъединицу δ), нейромодуляторные передатчики могут использовать рецепторы с высоким сродством и / или кластерные высвобождения для достичь определенного объема передачи при физиологических и патологических условиях. Действительно, накапливающиеся данные свидетельствуют о том, что как быстродействующие, так и медленно действующие нейротрансмиттеры осуществляют межклеточную коммуникацию в основном посредством сильно ограниченной передачи, причем объемная передача служит дополнительным способом при определенных условиях [29, 32, 72, 80].

A Схема экспериментов по визуализации стимуляции на острых срезах миндалины мышей. Л.А. Боковая миндалина. B Трехмерное пространственно-временное профилирование ΔF / F iGluSnFR, экспрессирующего миндалевидный нейрон, на локальные электрические стимулы. Обратите внимание на один изолированный участок высвобождения, обозначенный розовой стрелкой в ​​ B . C Пиксельный график максимального ΔF / F на изолированном участке высвобождения, обозначенном розовой стрелкой в ​​ B .Подгонка точек данных на этом графике с помощью одной экспоненциальной функции затухания (розовая линия) дает расчетную константу длины распространения глутамата, равную 0,65 мкм. Обратите внимание на сбор образцов экспериментальных данных на животных, сделанный с помощью недавно опубликованного проекта [32]. D Схема экспериментов по визуализации стимуляции на острых срезах ствола мозга мышей. NTS nucleus tractus solitarius. E Трехмерное пространственно-временное профилирование ΔF / F GRAB _NP , экспрессирующего нейрон NST на локальные электрические стимулы.Обратите внимание на один изолированный участок высвобождения, указанный розовой стрелкой в ​​ E . F Пиксельный график максимального ΔF / F на изолированном участке высвобождения, обозначенном розовой стрелкой в ​​ E . Подгонка точек данных на этом графике с помощью одной экспоненциальной функции затухания (розовая линия) дает расчетную константу длины распространения нейропептида 0,91 мкм. Обратите внимание на сбор образцов экспериментальных данных на животных, сделанный с помощью недавно опубликованного проекта [32].

Несколько высокопроизводительных сенсоров с генетически закодированными нейротрансмиттерами могут надежно отслеживать относительно медленную нейромодулирующую передачу, вызванную умеренными (фактически, более физиологическими [11]) темпами стимуляции в течение длительного периода ([32]; наши неопубликованные данные) (рис.3А, Б). Используя ранее установленные модели пула пузырьков [85,86,87,88], можно сделать достаточно точные оценки фундаментальных нейромодулирующих синаптических свойств (например, размер пула высвобождения, вероятность высвобождения и скорость пополнения). Как и в случае с пространственным разрешением, временное разрешение нейромодуляторной передачи улучшается с увеличением сбора фотонов. Наш предварительный анализ показал, что наиболее эффективные сенсоры генетически кодируемых нейротрансмиттеров (например, iAChSnFR, GRAB _NE1m и GRAB _5HT0.5 ) испускают достаточное количество фотонов в ответ на выбросы эндогенных передатчиков, вызванные продолжительными сериями стимулов, что позволяет определить основные синаптические свойства нейромодулирующей передачи с микромасштабным разрешением (рис. 3C, D). Комбинирование пространственного и временного анализа может даже позволить декодировать количество сайтов высвобождения, вероятность высвобождения и количественный размер в отдельных участках высвобождения для нейромодуляторной передачи ([59]; для примера см. [29, 32]). Пилотный анализ показывает, что медленная нейромодуляторная передача имеет некоторые, но не все свойства, с быстрой глутаматергической и ГАМКергической передачей.

A Схема экспериментов по стимуляции-визуализации на препарате ex vivo мыши базолатерального миндалины (BLA). B Флуоресцентные ответы iAChSnFR, экспрессирующего нейрон миндалины, вызванные длительной серией из 1920 стимулирующих импульсов с частотой 16 Гц. Графики совокупного ( C ) и индивидуального ( D ) высвобождения в зависимости от количества стимулов позволяют оценить размер легко высвобождаемого пула, скорость пополнения, вероятность высвобождения холинергических синапсов в миндалевидном нейроне.Обратите внимание на в C прямую голубую линию ( f _(x) = 0,081 ● x + 0,0068), подогнанную к поздним точкам синей совокупной кривой с ее пересечением по оси y и наклоном, взятым в качестве пула оценка и скорость пополнения везикул, соответственно, и в D голубая кривая, представляющая средние значения синих индивидуальных выбросов, соответствующих вероятности высвобождения. Обратите внимание на сбор образцов экспериментальных данных на животных, сделанный с помощью недавно опубликованного проекта [32].

Широкая применимость

Новый метод микроскопического анализа со сверхразрешением и / или деконволюцией на основе сенсоров имеет широкое применение в различных биологических и клинических приложениях. В частности, этот метод выявил неожиданный точный контроль и точность нейромодуляторной передачи [29, 32], которые сразу же дают объяснение некоторым загадочным клиническим наблюдениям и предлагают новые методы лечения различных психических и неврологических расстройств, включая болезнь Альцгеймера.Например, единственная доступная терапия для лечения болезни Альцгеймера основана на обнаружении уменьшения высвобождения АХ и ухудшения холинергических нейронов в мозге Альцгеймера — холинергическая гипотеза [89]. В настоящее время все одобренные FDA препараты от болезни Альцгеймера прямо или косвенно ингибируют ацетилхолинэстеразу, усиливая холинергические сигналы. Эти лекарства имеют ограниченную эффективность в улучшении когнитивных функций, а после прекращения приема лекарств вызывают необратимое ускоренное ухудшение состояния [90, 91]. Тонкий пространственно-временной контроль холинергической передачи, проиллюстрированный генетически закодированными датчиками, проливает свет на эти два клинических наблюдения [29, 32].Во-первых, ингибиторы ацетилхолинэстеразы могут снизить физиологическую точность холинергической передачи (ср. [72, 73]), что объясняет ограниченное улучшение когнитивных функций. Во-вторых, длительное применение ингибиторов ацетилхолинэстеразы может гомеостатически повышать уровень ацетилхолинэстеразы у пациентов с болезнью Альцгеймера и / или подавлять высвобождение пресинаптического АХ [91], что объясняет ускоренное ухудшение после прекращения приема лекарств.

Точно так же нарушение регуляции адренергической передачи часто проявляется как ранний патологический коррелят когнитивного спада при болезни Альцгеймера [92, 93].Генетически закодированные датчики выявили удивительный набор адренергических синаптических свойств, по-видимому, предназначенных для противодействия естественной тенденции синапсов достигать точных линейных вычислений ввода-вывода ([32]; наши неопубликованные данные). Эти свойства отличают адренергическую передачу от всех других нейрональных передач, включая быструю глутаматергическую и ГАМКергическую передачу [12], а также другую медленную нейромодуляторную передачу [29, 32]. Полученные данные подчеркивают уникальный вклад адренергической передачи в тонкую настройку внимания [94], оптимизацию поведения в сложных социальных и физических средах [95] и нарушение сложных умственных задач (напр.g., рассуждение и абстрактное мышление) у пациентов с болезнью Альцгеймера [96].

Зависимость, ведущая проблема со здоровьем, которая приводит к нескольким миллионам людей каждый год, представляет собой сложное подкрепляющее поведение, проявляющееся в навязчивом употреблении психоактивных веществ, несмотря на пагубные последствия [97]. Аддиктивные расстройства связаны с первичными нарушениями дофаминергической системы, хотя не следует недооценивать значение недофаминергических систем, которое было менее изучено [8, 10, 97].Аддиктивное поведение состоит из процессов внимания, мотивации и обучения, которые, по-видимому, по-разному регулируются различными локальными субклеточными и быстрыми субсекундными дофаминергическими сигналами [98]. Основным недостатком существующей литературы является то, что до сих пор ни одно исследование не смогло зафиксировать связанную с поведением быструю клеточную и субклеточно-специфичную динамику дофаминергического сигнала. Генетически закодированные датчики DA могут (по крайней мере, в полосатом теле) квалифицировать динамику отдельных дофаминергических высвобождений с микроскопическим пространственно-временным разрешением [32] и впоследствии определять синаптические параметры и чередования, ответственные за специфические вызывающие привыкание поведенческие события.Понимание, полученное в результате исследований аддикции, должно также способствовать пониманию некоторых других связанных психических и неврологических расстройств, таких как болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, синдром Туретта, синдром дефицита внимания / гиперактивности и шизофрения [8].

Реакции на стресс и невзгоды инициируют скоординированные нейромодулирующие действия в различных областях мозга, чтобы изменить внимание, тревогу, эмоции, удовольствие, поощрение, отвращение, моторные, исполнительные и другие поведенческие процессы, а неадаптивные реакции могут привести к меланхолической и атипичной депрессии [99 , 100].Депрессия поражает примерно каждого шестого человека в течение жизни, а в настоящее время — более 300 миллионов человек во всем мире [99, 101]. Раннее клиническое наблюдение приводит к моноаминовой гипотезе депрессии, согласно которой депрессивные расстройства возникают из-за пониженного содержания моноаминов [102]. Сегодня антидепрессанты на основе моноаминов остаются первой линией терапии депрессии, однако лечение имеет медленное начало, низкую скорость ответа и низкую скорость ремиссии (около 30%), поскольку механизмы их действия остаются неуловимыми [99, 100] .Недавние достижения в области генетического профилирования, анализа цепей и разработки моделей на животных открыли многие идеи о стрессовых реакциях и депрессии, подчеркнув гетерогенные подтипы моноаминергических нейронов и цепей, участвующих в различных стрессовых и депрессивных поведенческих процессах [103, 104]. Однако ограничения электрофизиологического подхода до сих пор препятствовали попыткам функционально связать определенные изменения передачи в определенных моноаминергических нейронах и цепях с конкретными стрессовыми и депрессивными поведенческими эпизодами [104].Генетически закодированные сенсоры нейромодулирующего передатчика позволяют напрямую определять специфические синаптические изменения моноаминергической передачи на специфических моноаминергических аксональных концах специфических подтипов нейронов в специфических нейронных цепях [32]. Такой анализ должен пролить новый свет на стрессовые реакции и депрессивные расстройства.

Сон — одно из самых загадочных, но широко распространенных видов поведения животных, а расстройства сна, наиболее распространенные клинические проблемы, вызывают множество проблем со здоровьем, включая депрессию, снижение когнитивных функций, иммунную недостаточность и ожирение [105,106,107].ACh и моноамины играют сложную и центральную роль в регуляции поведения во сне и бодрствовании. В то время как в ранних исследованиях сообщалось, что нейроны в холинергических ядрах важны для инициации и поддержания бодрствования [108, 109], поздние результаты приписывают эту роль частично глутаматергическим нейронам в ядрах. До сих пор ведутся споры о том, необходимы ли холинергические нейроны для бодрствования [105]. Генетически кодируемые сенсоры ACh детектируют вызванные нейрональной активностью большие начальные и небольшие устойчивые выбросы ACh из холинергических нейронов [29, 32]; эти сенсоры позволили напрямую оценить синаптические свойства холинергической передачи в естественных циклах сна и бодрствования для определения холинергического вклада [105, 106].Coerulear нейроны не требуются для бодрствования, но имеют решающее значение для обеспечения бодрствования при определенных условиях [95]. Адренергическая передача, проиллюстрированная генетически закодированными сенсорами NE, по-видимому, действует вопреки естественной тенденции синапсов выполнять линейный вычислительный процесс ввода-вывода ([32]; наши неопубликованные данные), что идеально для тонкой настройки бодрствования и внимания [94]. Эта операция, однако, сделает адренергическую передачу уязвимой для выхода системы из строя. Адренергические синапсы, кажется, устанавливают небольшой пул выброса и крошечную скорость пополнения, чтобы гарантировать истощение нейромедиаторов после определенного количества нейрональной активности, чтобы создать аварийную точку останова ([32]; наши неопубликованные данные), которая предположительно ответственна за наблюдаемые поведенческие остановки [ 94].Очевидно, что всесторонний анализ с помощью генетически закодированных сенсоров NE должен разграничить синаптические механизмы адренергического вовлечения в циклы сна-бодрствования и нарушения сна.

Серотонинергическая и дофаминергическая роли в циклах сна и бодрствования еще менее ясны. Хотя в некоторых сообщениях предполагается, что 5HT может инициировать и поддерживать сон, в других было обнаружено, что серотонинергические нейроны способствуют бодрствованию, предположительно отражая первичные и вторичные эффекты большого разнообразия серотонинергических процессов [105, 106].Определение синаптических изменений серотонинергической передачи в естественных циклах сна и бодрствования с помощью генетически закодированных датчиков 5HT должно дать новое понимание серотонинергической роли в поведении во сне и бодрствовании [34]. DA участвует в регуляции сна и бодрствования так же, как и другие его подкрепляющие элементы (например, еда, вода и секс), потому что дофаминергическая нейрональная активность и внеклеточные уровни DA коррелируют с циркадными колебаниями и поведением, ориентированным на сон [110, 111]. Однако то, как DA регулирует и / или регулируется циркадными часами и другими регуляторами сна и бодрствования, остается неясным из-за умеренных изменений высвобождения DA и различных дофаминергических эффектов в среднем мозге, гипоталамусе и других связанных областях мозга, что подчеркивает важность декодирования. синаптические изменения дофаминергической передачи, специфичной для определенного типа и проекции клеток, на разных этапах цикла сна-бодрствования [105, 106].Конечно, учитывая умеренное высвобождение DA, связанное с циклами сна-бодрствования [106], может потребоваться следующее поколение датчиков DA с улучшенными флуоресцентными ответами для анализа синаптических дофаминергических механизмов, лежащих в основе поведения сна-бодрствования.

Таким образом, генетически закодированные сенсоры сделали экспериментальную проверку вышеупомянутых гипотез и возможностей осуществимой на различных моделях болезней. С помощью технологий плюрипотентных стволовых клеток человека (ИПСК) модели заболеваний могут быть распространены на препараты нейронов, полученные из здоровых и больных ИПСК человека [112,113,114].Новаторское исследование показало, что быстрая передача между нейронами, дифференцированными с помощью ИПСК человека, ведет себя так же, как и между нейронами грызунов, с их синаптическими свойствами, разделяющими сопоставимые числовые параметры [115]. Это вдохновило нас на экспрессию генетически закодированных сенсоров в препаратах культур холинергических и моноаминергических нейронов человека (рис. 4А), которые применимы для исследования нейромодуляторной передачи между человеческими нейронами и ненейрональными клетками [29, 32, 114]. Анализ микро- и наноскопических изображений показал, что нейромодуляторная передача в препаратах культуры нейронов человека демонстрирует прекрасную регуляцию и точность (рис.4Б – Г), напоминающую таковую в срезах мозга грызунов и препаратах in vivo [29, 32]. Эти предварительные эксперименты устанавливают индуцированную человеком нейронную систему для определения синаптических параметров нейромодуляторной передачи здорового человека, определения дефицита нейромодуляторной передачи у человека, скрининга терапевтических препаратов и генов, вызывающих болезнь —, а также разработки потенциальных методов лечения на основе трансплантации клеток, вызывающих захватывающие возможности для регенеративных и персонализированных лекарств.

A Схема дифференциации холинергических нейронов от индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC). Окрашивание CAT антихолинацетилтрансферазой (Abcam, # ab223346), окрашивание MAP2 антимикротрубочко-ассоциированным белком 2 (Abcam, # ab32454), DAPI 4 ‘, 6 — диамидино — 2 — окрашивание фенилиндольной нуклеиновой кислотой ( Sigma-Aldrich, D9542). Обратите внимание на аутентификацию hiPSC в предыдущем отчете [67]. B Визуализация флуоресцентных ответов iAChSnFR, экспрессирующего нейрон, происходящий от ИПСК человека, вызванный серией из 20 стимулирующих импульсов, доставляемых с частотой 32 Гц. C Деконволюционный микроскопический анализ трехмерного пространственно-временного профилирования ΔF / F iAChSnFR, экспрессирующего нейрон, полученный из ИПСК человека, на локальные электрические стимулы. Обратите внимание на один изолированный участок высвобождения, указанный розовой стрелкой в ​​ C . D Пространственное профилирование изолированного сайта высвобождения, указанного розовой стрелкой в ​​ C с пиксельным графиком максимального ΔF / F.Подгонка точек данных на этом графике с помощью одной экспоненциальной функции затухания (розовая линия) дает расчетную константу длины распространения ACh 0,88 мкм.

Преднамеренные титулы ГТД

Когда я начал работать с GTD пять лет назад, я был уверен, что это недостающий элемент в моей загадочной головоломке. Это была пятиступенчатая структура, которая удерживала меня от откладывания на потом и давала мне мотивацию выполнить все, на что я продолжал говорить «да».

И хотя это возможные результаты, они далеко не подразумеваются.GTD может помочь вам сосредоточиться на задаче и дать вам возможность работать над правильным следующим действием, но не без вашей дисциплины и настойчивости. И тогда это работает, только если вы полностью обдумываете задачу или проект, когда они изначально обрабатываются. Возьмем, к примеру, эти проекты:

День рождения жены

• Торт
• Настоящее время
• Тарелки и столовое серебро
• Пригласить друзей

example.com

• Полный веб-дизайн
• Определиться с хостом
• Электронная почта?
• Дата запуска?
• Торговая секция

Новый товар

• Фото для сайта
• Качество по всем линиям
• Рынок?
• Розничные торговцы
• Пресс-релиз

На первый взгляд это может показаться нормальным.У меня есть список проектов и список задач, которые связаны с каждым проектом. Но здесь вы можете увидеть вопиющую проблему; есть еще некоторая интерпретация, необходимая, чтобы решить, что каждый требует от вас делать. «Тарелки и столовое серебро» — это напоминание накрыть стол или это часть вашего списка покупок? Вы спрашиваете о добавлении адресов электронной почты на веб-сайт или настройке рассылки новостей по электронной почте? Означает ли «пресс-релиз», что его нужно написать, опубликовать или просмотреть? Конечно, некоторые детали, отсутствующие здесь, могут подразумеваться в зависимости от контекста, назначенного каждому.Если «тарелки и столовое серебро» имеет контекст @Errands, у вас есть свой ответ.

Но и сами проекты ставят под вопрос и вас. У вас есть список покупок на день рождения жены или список настроек, которые необходимо выполнить в этот день? Вы пишете код для сайта или курируете проект? Вы изучаете добавление нового продукта для своей компании или это новая вещь, которую вы изучаете лично? Опять же, отчасти это может подразумеваться из-за назначенных вами метаданных, но само название все еще отсутствует.Этот набор проектов оставляет много вопросов и требует от вас расшифровать ряд предположений, прежде чем вы сможете действовать.

Часть , почему GTD устраняет необходимость хранить информацию в нашем сознании, поскольку мы ужасно можем вспомнить ее, когда она нам нужна. Но у нас неизбежно возникает потребность помнить о нашем намерении в отношении этих проектов и задач, если мы рассматриваем их как не более чем список триггеров. Мы оставили себе завершенной только половину мышления, а вторую половину сохранили в уме, что противоречит цели, которую мы изначально намеревались достичь.Нам лучше обслуживать себя, если мы завершим процесс и укажем в названии все данные, которые нам нужны или есть для элемента.

Возникает естественный вопрос: «Как следует назвать ?» Ответ прост в принципе и сложен на практике. Эти заголовки должны рассказывать вам, что именно нужно делать, без необходимости дополнять это информацией, которую вы все еще пытаетесь запомнить. С тактической точки зрения это означает, что нужно начинать с глагола и давать столько деталей, что вы можете проснуться посреди ночи и при этом знать, что делать, когда читаете его.

• День рождения жены → Отметить день рождения жены дома
• example.com → Создайте example.com для клиента xyz
• Новинка → Запустить новую линейку свитшотов

Переименовав эти проекты, вы сразу же заметите повышение ясности и узнаете, что сделал , просто прочитав заголовок. Чтобы придать такой уровень определения, потребуется больше работы, но я могу сказать вам по опыту, что эти дополнительные несколько секунд сэкономят вам время и избавят вас от лишних хлопот, связанных с их переосмыслением каждый раз в будущем.

• Торт → Call Deli re: индивидуальный торт на день рождения жены
• Электронная почта? → Почтовый клиент xyz re: сколько учетных записей электронной почты необходимо до запуска?
• Пресс-релиз → Написать первый черновик онлайн-пресс-релиза по новой линейке толстовок

Подробно рассказать об этом — задача не из легких, но преимущества бесценны. Вместо того, чтобы видеть несколько слов, требующих интерпретации (что само по себе становится задачей), я вижу действие, которое необходимо предпринять.Устранение этого крошечного сопротивления может стать отличием продуктивной работы от прокрастинации. Не позволяйте желанию сэкономить время заранее, чтобы не делать ничего позже.

аналоговый ум в цифровом мире