Разборка коробки: Коробка передач — Сборка и разборка коробки передач

Коробка передач — Сборка и разборка коробки передач

Коробка передач — Сборка и разборка коробки передач

Сборка и разборка коробки передач

Разборка

• Установите коробку передач на стенд для разборки.
• Снимите заднюю крышку картера коробки передач и выньте задний сальник.
• Включите I и IV передачи и отверните гайку с заднего конца первичного вала и болт с заднего конца вторичного вала.
• Поставьте шестерни в коробке передач в нейтральное положение.
• Поставьте деревянный брусок между вилкой включения V передачи и ведущей шестерней V передачи.
• Выбейте штифт из вилки включения V передачи с помощью выколотки и уберите деревянный брусок.
• Поставьте съемник 5339 в проточки ступицы скользящей муфты синхронизатора V передачи и спрессуйте ступицу в сборе со скользящей муфтой синхронизатора и вилкой включения V передачи (см. рис. ).
• Снимите с первичного вала синхронизатор V передачи, шестерню, игольчатый подшипник, внутреннюю обойму подшипника и распорную втулку.
• Снимите со вторичного вала кольцо со ступенчатой проточкой.
• С помощью съемника наружного зацепления спрессуйте со вторичного вала ведомую шестерню V передачи.
• Отверните болты крепления картера коробки передач к картеру сцепления.
• Снимите фиксатор штока заднего хода и извлеките пружину и шарик фиксатора.
• Выверните фиксатор вилки включения V передачи.
• Выньте из картера шток выбора передач и поставьте два фиксатора.
• Поднимите картер коробки передач вверх вместе со штоком вилки включения V передачи.
• Выньте сухарь фиксатора штока вилки включения V передачи и пружину фиксатора.
• Действуя изнутри картера,извлеките шток вилки V передачи.
• Выбейте выколоткой штифт из гнезда вилки переключения III и IV передач.
• Установите шток вилки переключения I и II передач и шток включения заднего хода в нейтральное положение.
• Выньте шток вилки переключения III и IV передач в сборе с вилкой, извлеките сухарь фиксатора штока.
• Немного приподнимите первичный и вторичный валы и выньте ось промежуточной шестерни заднего хода.
• Выньте одновременно первичный и вторичный валы из подшипников, шток и вилку переключения 1 и II передач, при этом примите меры, чтобы не уронить шестерни вторичного вала.
• Извлеките сухари фиксаторов.
• Выньте из картера магнит и очистите его от продуктов износа деталей.

Сборка

Примечание. В запасные части картер коробки передач поставляется вместе с маслоотражателем и вторичным валом с распылителем масла.

При сборке коробки передач учтите, что если картер коробки передач имеет маслоотражатель, то следует устанавливать вторичный вал без распылителя масла (при необходимости извлечь распылитель масла, высверлив его сверлом диаметром 8 мм), и что если картер коробки передач не имеет маслоотражателя, то необходимо устанавливать вторичный вал с распылителем масла.

• Установите в картер сухари фиксаторов и убедитесь в их свободном перемещении.
• Заклейте шлицы первичного вала самоклеящейся лентой, чтобы не повредить рабочую кромку сальника.
• Установите шток и вилку переключения 1 и II передач на ступицу муфты синхронизатора 1 и II передач (не забудьте при этом поставить на место сухарь фиксатора).
• Вставьте одновременно в картер первичный и вторичный валы вместе со штоком и вилкой переключения 1 и II передач.
• Поверните ведомую шестерню главной передачи и вторичный вал так, чтобы конец вторичного вала вошел в подшипник.
• Немного приподнимите первичный и вторичный валы и установите ось промежуточной шестерни заднего хода.
• Вставьте в гнездо штока вилки переключения III и IV передач сухарь фиксатора.
• Установите вилку переключения III и IV передач так, чтобы ее более широкая сторона была направлена в сторону ведомой шестерни главной передачи.
• С помощью выколотки вставьте в гнездо вилки переключения III и IV передач новый штифт прорезью по оси валов.
• Наденьте на вторичный вал шайбу.
• Поставьте на место магнит и две установочные втулки.
• Установите пружины и шарики фиксаторов штоков вилок переключения 1 и II, III и IV передач, а затем поставьте два фиксатора.
• Установите пружину и шарик фиксатора вилки V передачи, затем установите шток вилки включения передачи.
• Нанесите герметик типа Loctite 518 на сопрягающиеся поверхности картера коробки передач и картера сцепления.
• Вытяните наружу шток выбора передач, отцентрируйте первичный и вторичный валы и штоки вилок переключения передач, после чего поставьте на место картер коробки передач.
• Извлеките оба фиксатора.
• Осторожно постукивая пластмассовым молотком по картеру коробки передач, введите первичный и вторичный валы в подшипники картера сцепления.
• При помощи крючка, изготовленного из подручных материалов, приподнимите ось промежуточной шестерни заднего хода (см. рисунок).
• Установите шарик, пружину и фиксатор штока вилки заднего хода.
• Наденьте на первичный вал шайбу и установите стопорное кольцо, предварительно зажав шлицевой конец вала в тисках с деревянными прокладками.
• Вверните фиксатор штока вилки включения V передачи.
• Включите IV передачу.
• Уприте поводок рычага выбора передач в скользящую муфту синхронизатора I и II передач и замерьте размер «X» (см. рисунок) между картером коробки передач и фиксатором вилки V передачи.
• В зависимости от величины «Х» (см. таблицу) поставьте между картером и фиксатором вилки V передачи регулировочную шайбу нужной толщины.
• Нанесите несколько капель герметика типа Loctite Scelbloc на шлицы вторичного вала для ведомой шестерни V передачи.
• Установите на место кольцо со ступенчатой проточкой.
• Смажьте герметикой Loctite Frenbloc шлицы ведущей шестерни V передачи.
• Установите на первичный вал распорную втулку, игольчатый подшипник и его внутреннюю обойму, ведущую шестерню V передачи и синхронизатор V передачи.
• Смажьте герметиком типа Loctite Scelbloc шлицы ступицы скользящей муфты синхронизатора V передачи и установите на первичный вал ступицу в сборе со скользящей муфтой синхронизатора и вилкой включения V передачи.
• Введите выступы блокирующего кольца синхронизатора в канавки ступицы скользящей муфты синхронизатора V передачи.
• Включите две передачи, как это выполнялось при разборке.
• Смажьте герметиком типа Loctite Frenbloc резьбу гайки первичного вала и болта вторичного вала, наверните их на задние концы валов и затяните соответственно моментом 13,5 и 7,4 кгс.м.
• Установите деревянный брусок между ведущей шестерней V передачи и вилкой включения V пе-редачи и вставьте в гнездо вилки включения V передачи с помощью оправки 5339 новый штифт, направив прорезь в сторону задней крышки.
• Установите новый задний сальник.
• Поставьте заднюю крышку коробки передач, введя трубку подвода масла в первичный вал и патрубок подачи масла в маслоподводящий канал (см.
  рисунок).
  

	Снятие штифта вилки переключения III и IV передач
Расположение установочных колец подшипников валов коробки передач
	Подъем оси промежуточной шестерни заднего хода при помощи крючка, изготовленного из подручных материалов
Установка фиксаторов

 

Измерение размера «X» между картером коробки передач и фиксатором вилки включения V передачи Размер «X», мм Толщина регулировочной шайбы, мм Более 22,25 0 (без шайбы) 22,35-22,03 0,33 22. 02-21,70 0,66

Детали привода переключения передач: 1 — рукоятка рычага переключения передач; 2 — рычаг переключения передач; 3 — замок заднего хода; 4 — кожух рычага переключения передач; 5 — тяга привода переключения передач; 6 — шток выбора передач; 7 — защитный чехол; 8 — рычаг выбора передач; 9 — вилка переключения 1 и II передач; 10 — вилка переключения III и IV передач; II — вилка включения V передачи; 12 — шток механизма включения заднего хода; 13 — фиксаторы; 14 — фиксатор вилки включения V передачи

 

Разборка коробки передач | AUTOFIZIK.RU / авторемонт

Работать удобнее вдвоем.

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ДЕЙСТВИЙ

Снимаем коробку передач.
Заворачиваем на место заливную и сливную пробки.

Снимаем муфту с подшипником и поролоновые кольца передней крышки.

Снимаем опору силового агрегата.
Снимаем выключатель света заднего хода (см. Замена выключателя света заднего хода).
Снимаем привод спидометра (см. Замена привода спидометра).

Ключом «на 12» отворачиваем три болта крепления крышки подшипника (болты установлены на герметике).

Снимаем крышку с прокладкой.

При последующей ее установке обратите внимание на совпадение масляного дренажного канала в крышке и отверстия в картере.

Поддев отверткой, вынимаем из крышки манжету первичного вала (при разборке коробки передач заменяем все манжеты независимо от их состояния).

Оправкой или подходящей по диаметру головкой запрессовываем новую манжету.

Ключом «на 13» отворачиваем и вынимаем болт крепления втулки оси шестерни заднего хода к переднему картеру.

Тонкой отверткой поддеваем и снимаем стопорное кольцо подшипника первичного вала.

Ключом «на 12» отворачиваем и снимаем сапун.

Ключом «на 12» отворачиваем десять болтов, соединяющих передний и задний картеры (два болта, проходящие через установочные втулки, длиннее остальных).

Осторожно постукивая молотком через латунную оправку, расстыковываем передний и задний картеры.

ВНИМАНИЕ
При этом нельзя наносить удары по торцу первичного вала, так как будут повреждены синхронизаторы.

Разъединяем картеры коробки передач.

Осторожно, стараясь не повредить, снимаем уплотнительную прокладку.

Вынимаем из расточки под подшипник промежуточного вала в переднем картере регулировочные прокладки (их может и не быть). В этом случае осевой зазор в подшипниках устанавливается только межкартерной уплотнительной прокладкой.

Проворачивая первичный вал, включаем передачу заднего хода (продвигаем вперед шток V передачи и заднего хода).

Ключом «на 10» отворачиваем болты крепления трех вилок переключения передач.

Ключом «на 12» отворачиваем четыре болта крепления корпуса рычага переключения передач.

Снимаем корпус рычага с прокладкой.

Ключом «на 12» отворачиваем болты крепления пластины фиксаторов штоков.

Снимаем пластину с прокладкой.

Вынимаем три пружины и три шарика фиксаторов включения передач (их можно вынуть намагниченной отверткой или перевернув коробку).

Вынимаем шток I–II передачи (чтобы не перепутать при сборке, сразу надеваем на шток вилку и крепим ее болтом).

Вынимаем шток V передачи и передачи заднего хода, надев на него соответствующую вилку.

Вынимаем шток III–IV передач. Из штока извлекаем штифт блокиратора.

Чтобы не выпали плунжеры блокиратора, вставляем в отверстия штоков трубочки, свернутые из плотной бумаги.

Ключом «на 13» отворачиваем болт крепления оси шестерни заднего хода к заднему картеру.

Щипцами раздвигаем усики стопорного кольца заднего подшипника вторичного вала и, постукивая медным молотком по заднему торцу вторичного вала,…

…вынимаем комплект валов вместе с осью и шестерней заднего хода.

Разъединяем первичный и вторичные валы.

Снимаем синхронизатор IV передачи и вынимаем 14 роликов передней опоры вторичного вала.
Шестерни, синхронизаторы и другие детали, расположенные на первичном и вторичном валах, похожи друг на друга, поэтому для облегчения последующей сборки следует аккуратно раскладывать их в порядке снятия.

Двумя тонкими отвертками или специальными щипцами разжимаем и снимаем с первичного вала стопорное…

…и пружинное кольца.

Бородком (двумя монтажными лопатками или специальным съемником) спрессовываем подшипник первичного вала.

Аналогично снимаем оба подшипника промежуточного вала.

Установив вторичный вал вертикально в тисках через мягкие прокладки,…

…снимаем стопорное…

… и пружинное кольца ступицы муфты включения III–IV передач.

Снимаем муфту в сборе с сухарями и пружинами синхронизатора.

Этот комплект лучше не разбирать, но если такая необходимость возникла, пометьте взаимное положение деталей.

ВНИМАНИЕ
Муфты включения передач не симметричны, поэтому они устанавливаются только в одном положении.

Снимаем кольцо синхронизатора…

…и шестерню III передачи вместе с пластмассовым сепаратором и роликами.

Отверткой поддеваем и снимаем стопорное кольцо…

…и два упорных полукольца.

Намагниченной отверткой вынимаем стопорный шарик полуколец.

Снимаем шестерню II передачи с подшипником.

Снимаем кольцо синхронизатора II передачи.

Снимаем стопорное кольцо.

Снимаем муфту включения I–II передач…

…и кольцо синхронизатора I передачи.

Снимаем шестерню I передачи с подшипником.
Дальнейшую разборку вторичного вала проводим с другого конца.

Поддев тонкой отверткой, снимаем стопорное…

…и пружинное кольца.

Снимаем ведущую шестерню привода спидометра…

…и вынимаем ее стопорный шарик.

Двумя монтажными лопатками или специальным съемником снимаем задний подшипник вторичного вала.

Снимаем упорную шайбу.

Вынимаем плоскогубцами штифт.

Снимаем шестерню V передачи с подшипником…

…и синхронизатором.

Снимаем дистанционное кольцо.

Специальными щипцами и отвертками снимаем пружинное кольцо и затем …

…муфту включения V передачи и заднего хода.

Снимаем кольцо синхронизатора.

Снимаем шестерню передачи заднего хода с подшипником.

Извлекаем из удлинителя заднего картера две манжеты (см. Замена манжет).
Перед сборкой проверьте состояние деталей коробки передач.
На деталях картера не допускается наличие трещин любой формы и длины. Гнезда подшипников, отверстия под штоки переключения передач и сталебаббитовая втулка удлинителя заднего картера должны быть гладкими, без забоин, следов задиров и заметного износа. Подшипники должны входить в гнезда плотно, от усилия руки или при легком постукивании через проставку. Прокладки картера должны быть целыми, без разрывов, расслоений и надломов.
Валы, оси и штоки проверяем на отсутствие трещин, заметных следов изнашивания, задиров и наволакивания металла. Это относится и к шлицевым частям валов, ответные детали должны двигаться на валах легко, без ощутимых люфтов и заеданий. Незначительные следы задиров, а также возможной коррозии (на шлицах) устраните бархатным напильником, очень мелкой шкуркой, а шейки валов отполируйте тонкой пастой ГОИ или алмазной пастой.
На зубьях шестерен и муфт синхронизаторов не допускаются сколы, следы заедания и выкрашивания, на конусах синхронизаторов также не должно быть следов заедания, сильного износа и наволакивания бронзы на сталь.
Шариковые и роликовые подшипники должны быть в безукоризненном состоянии. Их вращение должно быть легким, без заеданий, щелчков, люфта и вибраций. На дорожках качения, шариках и роликах (иглах) не допускаются усталостное выкрашивание (питтинг), заметный износ и сколы. Сепараторы шарикоподшипников не должны касаться колец, иметь трещины и разрывы. Вообще, после пробега около 100 тыс. км шариковые подшипники лучше заменить на новые, независимо от их состояния. Манжеты скользящей вилки карданного вала и манжету первичного вала также заменяем независимо от их состояния.
Перед сборкой тщательно промываем все детали в керосине или дизельном топливе, резьбовые отверстия картера обезжириваем ацетоном или растворителем для нитрокрасок. Трущиеся поверхности механизма переключения передач, сталебаббитовую втулку, манжеты и шлицы вторичного вала покрываем смазкой ШРУС-4, остальные – трансмиссионным маслом.
Подшипники и их гнезда перед сборкой следует также смазать трансмиссионным маслом.
Собираем коробку в обратной последовательности. Для обеспечения сборки бессепараторных подшипников их ролики обильно покрываем любой пластичной смазкой.
При сборке все валы устанавливаем в задний картер коробки передач одновременно. Для облегчения этой операции валы можно связать шнуром.

ВНИМАНИЕ
Толщина прокладки между картерами коробки передач определяет величину осевого зазора в подшипниках промежуточного вала. Поэтому устанавливаем ее обязательно, смазав для надежности тонким слоем герметика. Герметиком следует смазать и все другие картонные прокладки коробки передач.

Болты, соединяющие детали картера, при сборке следует обезжирить и покрыть резьбу герметиком. После установки агрегата на автомобиль не забудьте залить в коробку 1,2 л трансмиссионного масла (до уровня заливного отверстия). 

Разборка коробки передач (ремонт КПП) Нива ВАЗ 21213, 21214, 2131 lada 4×4

Сливаем масло из коробки передач, снимаем вилку и подшипник выключения сцепления (см. соответствующие разделы).

Демонтируем фланец эластичной муфты с носка вторичного вала (см. тут)…

…и выключатель фонарей заднего хода .

Механизм выбора передач можно демонтировать на автомобиле, не снимая коробки передач. Для наглядности эти операции выполняем на снятой коробке передач.

Снимаем манжету механизма выбора передач.

Устанавливаем рычаг переключения передач в нейтральное положение.

Головкой «на 10» отворачиваем три гайки крепления корпуса рычага переключения передач…

…и вынимаем механизм выбора передач.

Соединение уплотнено прокладкой.

Маркером помечаем взаимное расположение шайб и направляющей пластины механизма.

Головкой «на 10» отворачиваем две гайки крепления блокировочной пластины заднего хода, удерживая болты ключом той же размерности,…

…и снимаем блокировочную пластину.

Отвернув еще одну гайку,…

…снимаем нижнюю шайбу направляющей пластины.

Вынув одну направляющую планку с двумя пружинами,…

…снимаем направляющую пластину с нижнего конца рычага.

Снимаем верхнюю шайбу направляющей пластины.

Снимаем корпус рычага переключения передач.

Вынимаем из проточек корпуса резиновые уплотнительные кольца болтов.

Снимаем нижнюю прокладку корпуса шаровой опоры.

Снимаем фланец с защитным чехлом…

…и верхнюю прокладку корпуса.

Щипцами снимаем стопорное кольцо.

Снимаем шайбу и пружину.

Снимаем сферическую шайбу…

…и разъединяем рычаг и корпус шаровой опоры.

Устанавливаем коробку передач картером сцепления на верстак.

Головкой «на 10» отворачиваем десять гаек крепления нижней крышки коробки передач.

Снимаем крышку…

…и уплотнительную прокладку.

Отверткой через отверстие механизма выбора передач сдвигаем вниз шток вилки включения I–II передач (при этом включается II передача).

Ключом «на 13» отворачиваем гайку крепления задней крышки, расположенную внутри корпуса коробки.

Ключом «на 13» отворачиваем пять гаек крепления задней крышки, расположенных снаружи корпуса.

Постукиваем молотком по приливам крышки, при этом отверткой (или подходящим отрезком трубы при снятом сальнике вторичного вала) удерживаем задний подшипник на вторичном валу.

Сдвигаем крышку со шпилек и снимаем, поворачивая ее по часовой стрелке (глядя со стороны хвостовика вторичного вала), чтобы исключить задевание крышки за штоки и блок шестерен V передачи и заднего хода.

Снимаем прокладку крышки.

Для замены подшипника блока шестерен V передачи и заднего хода…

…поддеваем ролики подшипника отверткой…

… и вынимаем ролики из сепаратора.

Извлекаем сепаратор.

Поддев крючком наружное кольцо подшипника,…

…вынимаем его из гнезда задней крышки.

Снимаем упорное кольцо заднего подшипника вторичного вала.

Снимаем наружное кольцо подшипника с сепаратором и роликами.

Снимаем внутреннее кольцо подшипника.

Снимаем распорную втулку…

…и маслоотражательную шайбу.

Для стопорения валов от проворачивания необходимо включить две передачи. II передача была включена при снятии задней крышки. Перед тем как включить заднюю или V передачи, освобождаем вилку включения этих передач. Для этого…

…ключом «на 10» отворачиваем болт крепления вилки к штоку.

Нажав отверткой на вилку вниз, включаем заднюю передачу.

Накидным ключом (головкой) «на 17» отворачиваем болт крепления блока шестерен V передачи и заднего хода.

Вынимаем болт…

…и снимаем блок шестерен со шлицев промежуточного вала.

Зажимаем блок шестерен V передачи и заднего хода в тиски с накладками губок из мягкого металла.

Двумя отвертками спрессовываем внутреннее кольцо подшипника блока шестерен…

…и снимаем внутреннее кольцо.

Снимаем втулку шестерни V передачи,…

…саму шестерню с блокирующим кольцом синхронизатора,. ..

…ступицу…

…и муфту синхронизатора.

Повернув вилку включения V передачи и заднего хода на штоке к вторичному валу,…

…снимаем промежуточную шестерню задней передачи.

Накидным ключом «на 13» отворачиваем два болта крепления крышки фиксаторов.

Снимаем крышку и прокладку.

Вынимаем пружины фиксаторов (пружина штока V передачи и заднего хода длиннее двух других и имеет темный цвет покрытия).

Намагниченной отверткой вынимаем все три фиксатора.

Вынимаем шток включения V передачи и заднего хода с вилкой.

Снимаем вилку со штока.

Намагниченной отверткой вынимаем блокировочный сухарь из отверстия картера коробки передач, которое расположено между гнездами картера под штоки V передачи и заднего хода и III–IV передач.

Снимаем со вторичного вала ведомую шестерню задней передачи.

Из паза вала вынимаем шпонку.

Головкой «на 10» отворачиваем болт крепления к штоку вилки включения III–IV передач.

Вынимаем шток.

В отверстие штока вставлен блокировочный сухарь,…

…вынимаем его.

Намагниченной отверткой вынимаем блокировочный сухарь из отверстия картера коробки передач, которое расположено между гнездами картера под штоки I–II и III и IV передач (этот сухарь заметно длиннее сухаря, расположенного между штоком включения V передачи — заднего хода и штоком включения III–IV передач).

Головкой «на 10» отворачиваем болт крепления к штоку вилки включения I-II передач.

Вынимаем шток.

Ударной отверткой с крестообразным наконечником отворачиваем три винта крепления стопорной пластины промежуточного подшипника вторичного вала.

Винты стопорятся специальными шайбами.

Снимаем стопорную пластину.

Накидным ключом «на 19» отворачиваем гайку крепления оси промежуточной шестерни заднего хода, удерживая ось от проворачивания ключом «на 24».

Вынимаем ось промежуточной шестерни заднего хода.

Отвернув гайки крепления картера сцепления ,…

…разделяем картеры сцепления и коробки передач.

Снимаем прокладку.

Снимаем с первичного вала пружинную шайбу с конической поверхностью (меньшим диаметром она обращена к подшипнику).

Зажимаем в тиски с накладками губок из мягкого металла шлицевую часть первичного вала.

Накидным ключом «на 19» отворачиваем болт зажимной шайбы переднего подшипника промежуточного вала.

Снимаем зажимную шайбу подшипника.

Двумя отвертками поддеваем за установочное кольцо передний двухрядный подшипник промежуточного вала…

…и снимаем подшипник.

При снятии подшипника его заднее внутреннее кольцо может остаться на валу.

Двумя отвертками спрессовываем заднее внутреннее кольцо подшипника…

…и снимаем его.

Вынимаем упорное кольцо заднего подшипника промежуточного вала.

Вставив отвертку между торцами подшипника и шестерни I передачи промежуточного вала, сдвигаем задний подшипник.

Вынимаем наружное кольцо подшипника с сепаратором и роликами.

Снимаем внутреннее кольцо подшипника с носка вала.

Сдвинув промежуточный вал назад,…

…вынимаем его из картера коробки передач.

Поддев двумя отвертками за установочное кольцо задний подшипник первичного вала,…

…вынимаем первичный вал в сборе с подшипником и блокирующим кольцом синхронизатора.

Щипцами разжимаем стопорное кольцо…

…и снимаем его.

Снимаем пружинную шайбу.

Опираем торец наружного кольца подшипника на губки тисков.

Молотком с пластмассовым бойком наносим удары в торец первичного вала…

…и спрессовываем подшипник.

Щипцами разжимаем установочное кольцо…

…и снимаем его.

Сдвинув блокирующее кольцо синхронизатора, щипцами разжимаем стопорное кольцо…

…и снимаем его.

Снимаем блокирующее кольцо…

…и пружину синхронизатора.

Блокирующие кольца синхронизаторов других передач снимаются аналогично.

С переднего носка вторичного вала снимаем игольчатый подшипник.

Снимаем вилки включения I и II, III и IV передач.

Двумя отвертками поддеваем за установочное кольцо промежуточный подшипник вторичного вала…

…и снимаем его.

Наклонив, извлекаем из картера коробки передач вторичный вал в сборе с шестернями, муфтами, ступицами и блокирующими кольцами синхронизаторов.

Снимаем с задней стороны вала втулку и шестерню I передачи в сборе с блокирующим кольцом.

Вынимаем втулку из шестерни.

Снимаем муфту синхронизатора включения I и II передач.

Снимаем ступицу синхронизатора.

Снимаем шестерню II передачи в сборе с блокирующим кольцом.

С переднего конца вторичного вала снимаем муфту синхронизатора III и IV передач.

Зажав вторичный вал в тиски с накладками губок из мягкого металла,…

…щипцами снимаем стопорное кольцо.

Снимаем пружинную шайбу (она установлена выпуклой стороной к переднему концу вала).

Снимаем ступицу синхронизатора III и IV передач…

…и шестерню III передачи в сборе с блокирующим кольцом синхронизатора.

Сборку коробки передач проводим в обратной последовательности.

Если при снятии переднего двухрядного подшипника промежуточного вала его заднее внутреннее кольцо осталось на валу, то перед установкой подшипник необходимо собрать. Для этого из наружного кольца подшипника…

…отверткой аккуратно вынимаем сепаратор с шариками…

…и надеваем его на внутреннее кольцо (снятое с вала).

Сепаратор с шариками и внутренним кольцом вставляем в наружное кольцо подшипника.

При сборке первичного вала…

…подходящим отрезком трубы напрессовываем подшипник на вал, опираясь на его внутреннее кольцо.

После установки в картер коробки передач вторичного и промежуточного валов запрессовываем передний и задний подшипники промежуточного вала, промежуточный подшипник вторичного вала и внутреннее кольцо подшипника блока шестерен.
Наружное кольцо подшипника блока шестерен V передачи и заднего хода…

…запрессовываем инструментальной головкой подходящего размера (отрезком трубы) в гнездо задней крышки.

Вставляем в наружное кольцо подшипника сепаратор и ролики.

Для предотвращения отворачивания болта крепления блока шестерен V передачи и заднего хода наносим на резьбу болта резьбовой герметик.

Для удобства монтажа задней крышки устанавливаем на вторичный вал задний подшипник в сборе.

Все уплотнительные прокладки желательно смазать тонким слоем силиконового герметика.

При сборке механизма выбора передач наносим на шаровую опору смазку Литол-24.

Ремонт КПП ВАЗ 2107 нового образца (5 ступенчатой, т.н. «разорванный пакет») часть 1 — разборка КПП | Клуб любителей классики ВАЗ-2107, ВАЗ 2106

Предлагаю вашему вниманию статью по ремонту 5 ступенчатой КПП нового образца (так называемый «разорванный пакет»)
 Часть фоток процесса будет повторяться,прошу сильно не пинать,фотки в основном делались при сборке,так как КПП и детали были отмыты,и фотик остался чистым :).
 Какой инструмент потребуется дополнительно?  Фиксатор первичного вала (я сделал из старой ступицы ведомого диска сцепления),  высокая головка на «30» для отворачивания гайки вторичного вала,пара мощных отверток,съемник стопорных колец, ударная отвертка с молотком и,в идеале, динамометрический ключ.

Вряд ли у кого под рукой окажется специальный стенд для ремонта КПП,в принципе и на столе можно перебрать, а ещё можно её в тиски аккуратно зажать.
 Итак,сливаем масло с КПП,снимаем КПП с машины,снимаем эластичную муфту,заднюю подушку КПП вместе с траверсой и вынимам вилку сцепления с пыльником и выжимным.
 Тщательно очищаем КПП от грязи при помощи щетки по металлу,подходящим инструментом типа отвертки,в идеале продуваем компрессором.

 

Хоть масло и слито,всё равно в КПП осталось немного масла,так что учитываем этот факт при разборке.
Снимаем нижнюю крышку КПП.

Снимаем резиновый пыльник муфты со вторичного вала,стопор со вторичного вала,при помощи подходящей выколотки выбиваем центрирующую втулку муфты.Если не удается «подцепить» втулку, то отворачиваем гайку вторичного вала насколько возможно и заворачиваем её обратно.
 Втулка при этом почти слезет с насиженного места.Включаем любую передачу,фиксируем первичный вал,и откручиваем гайку вторичного вала на «30». Снимаем конусную пружинную шайбу.

Если под рукой нет фиксатора первичного вала,то можно воспользоваться алюминиевой ложкой,вставив её ручку между шестернями первичного и промежуточного валов. Не стоит бояться за шестерни,люминь им не повредит.
Снимаем фланец эластичной муфты.

Отворачиваем выключатель фонарей заднего хода. Не потеряйте медную уплотнительную шайбу.

Отворачиваем гайку и вынимаем привод спидометра

Включаем вторую передачу и снимаем корпус рычага переключения передач,отвернув три гайки по наружнему радиусу.

Отворачиваем две гайки крепления кронштейна штанов к КПП

Снимаем кронштейн и вынимаем находящийся под ним закладной болт с четырехгранной головкой.

Отворачиваем пять гаек крепления задней крышки снаружи и одну внутри.

Снимаем заднюю крышку,иногда слегка приходится пристукнуть молотком.Подшипники могут при этом разъединиться,
часть подшипника остается на валу,часть в задней крышке,не страшно.

Снимаем со вторичного вала внутреннее кольцо подшипника (далее по тексту П.),затем снимаем шестерню привода спидометра.
АХТУНГ! Под шестерней привода есть маленький шарик,не потеряйте!

Снимаем маслоотражательную шайбу.Осматриваем её,был случай,когда шайба слезла со втулки.

При помощи отвертки выставляем шток переключения 1-2 передач в нейтральное положение.
Фиксируем первичный вал и страгиваем с места головкой на «17» болт крепления блока шестерен.Дальше он пойдет от руки,
но пока его не отворачиваем.

Теперь надо снять кожух сцепления (он же колокол). Отворачиваем одну гайку на «13» и шесть гаек на «17».

Снимаем,убираем в сторону.На первичном валу,либо в колоколе остается пружинная конусная шайба.
Осматриваем её на предмет протёртости,трещин.Иногда вместо конусной шайбы может стоять толстое кольцо.

Удерживая первичный вал фиксатором,отворачиваем передний болт промежуточного вала (далее промвал) головкой на «19».

Откручиваем два болта пластины,удерживающую пружины фиксаторов штоков переключения передач.

Под пластиной расположены три пружины,две одинаковые по длине (для штоков 1-2 и 3-4 передач) и одна подлиннее (для штока 5 передачи и заднего хода).
Вынимаем пружины.

Под пружинами находятся три шарика,они в масле,сами не выпадают,но всё же приглядывайте за ними
в процессе дальнейшей разборки.

Теперь отворачиваем болт блока шестерен и вынимаем его. Теперь вынимаем блок шестерен.Движение назад и вбок.
Шестерни 5 передачи при этом немного отходят назад.

Между блоком шестерен и задним П. промвала установлено дистанционное кольцо.Оно иногда прилипает к блоку шестерен
и в самый неподходящий момент отпадывает.

Снимаем с вторичного вала шестерню 5 передачи в сборе с штоком переключения 5 передачи,с шестеренкой З.Х.,муфтой.

Снимаем дистанционное кольцо.

При помощи подходящего тонкого предмета выталкиваем из гнезда шарик фиксатора. Я использую трубочку от ВД 40,она гибкая.

Теперь щипцами разжимаем стопорное кольцо ступицы муфты синхронизатора V передачи и снимаем его.

Снимаем со вторичного вала коробки передач ступицу.

Снимаем пружинную шайбу.Она обращена в сторону шестерни З.Х.

Снимаем шестерню заднего хода

Теперь надо снять промвал.Для этого надо снять передний подшипник.
Иногда достаточно отвертками зацепиться за стопорное кольцо и П. вылезет.

Иногда он не хочет слазить,тогда приходится закрутить болт несколько витков в промвал и,создав упор отверткой,слегка
постучать молотком по болту и сдвинуть подшипник с места.Иногда подшипник разбирается,не страшно,его можно собрать.

Теперь снимаем задний П. промвала,вытолкнув его из корпуса отверткой.

Вынимаем промвал.

Отворачиваем болт крепления вилки 3-4 передач к штоку переключения 3-4 передач головкой на «10».

Вынимаем шток и одновременно вытаскиваем вилку.

АХТУНГ! В штоке переключения расположен маленький блокировочный сухарь.При вытаскивании штока может выпасть.

Затем извлекаем блокировочный сухарь из корпуса КПП.

Вытаскиваем шарик фиксатора.

  Отворачиваем болт крепления вилки 1-2 передач к штоку переключения 1-2 передач головкой на «10».

Вынимаем шток и одновременно вытаскиваем вилку.

Затем извлекаем блокировочный сухарь из корпуса КПП.

Вытаскиваем шарик фиксатора.

Вынимаем первичный вал.

Извлекаем игольчатый подшипник.Осматриваем поверхности трения игольчатого П.внутри первичного вала и на вторичном валу.
Если есть следы выкрашивания,то вал придется менять.

Отмываем подшипник и внимательно осматриваем его,беговая дорожка и шарики не должны иметь следов выкрашивания,питтинга
Смазанный маслом подшипник должен вращаться тихо,без заеданий и шума.
Вот так выглядит изношенная беговая дорожка-причина шума

Если возникла необходимость заменить подшипник,то:
Снимаем стопорное кольцо с наружней обоймы подшипника

При помощи съемника снимаем стопорное кольцо,если не слазит с насиженного места,то сбиваем выколоткой,
снимаем пружинную шайбу

Выпрессовываем подшипник и напрессовываем новый. Стопорное кольцо осаживаем на место при помощи бородка
ударом вдоль вала

При помощи ударной отвертки и молотка страгиваем с места и отворачиваем три винта стопорной пластины.

Винты при отсутствии повреждений можно использовать заново,а вот корончатые шайбы всегда при сборке ставим новые.
Снимаем стопорную пластину.

Извлекаем подшипник из корпуса КПП в сборе со стопорной шайбой.

Удерживая на валу шестерни вытаскиваем вторичный вал в сборе из корпуса КПП.

Отмываем корпус.

Вот так выглядит снятый вторичный вал в сборе.

Снимаем с вала муфту 3-4 передачи,осматриваем муфту.Забоин на зубчиках быть не должно.
Теперь разбираем вторичный вал для осмотра 1 и 2 передач.Все детали просто снимаются с вала.
Иногда ступица 1-2 передач может сидеть достаточно плотно,пара легких ударов по шестерне 2-ой передачи и ступица слезет.
Вот так выглядят снятые со вторичного вала детали 1 и 2 передач.

Если надо получить доступ к шестерне 3 передачи и блокирующему кольцу,то разбираем вал в следующем порядке:
Зажимаем вал в тисках через тряпку.

Разжать стопор не получиться,сбиваем его с места выколоткой,кольцо само выскочит.

Снимаем пружинную шайбу.

Снимаем ступицу муфты.

Снимаем шестерню 3 передачи в сборе.

Меняем изношенные детали.

Ставим на место шестерню,ступицу,пружинное кольцо.

При помощи съемника стопорных колец максимально близко ставим стопорное кольцо к его месту на валу.

При помощи выколотки ударом сверху и по периметру кольца засаживаем стопорное кольцо на место.

Осматриваем шестерни,зубчики не должны иметь забоин,грани должны быть острыми

Осматриваем шестерни,сколы зубьев не допускаются.
При покупке новой шестерни обратите внимание на зубья самой шестерни — забоин и прочих дефектов быть не должно.
Попадались новые шестерни с забоинами,вследствие чего шум был обеспечен.
 Осматриваем блокирующее кольцо синхронизатора,на нем не должно быть отметин от муфты (насечки по кольцу или же проточка кольцеобразная)
На фото слева изношенное кольцо,справа новое

Для замены блокирующего кольца прижимаем кольцо к шестерне (сжав пружину)
и съемником разжимаем стопорное кольцо

Снимаем стопор и блокирующее кольцо

Ставим новое кольцо,собираем обратно,проверяем лёгкость перемещения,заедать не должно.

Осматриваем муфту-забоин на зубчиках,следов износа в проточке под вилку быть не должно
Изношенная муфта

Новая муфта

Осматриваем вилки переключения.Износ на рабочей поверхности вилки не допускается.
Для сравнения-новая и изношенная вилка

Меняем сальник первичного вала.
Со стороны сцепления через отверстие в направляющей втулке выжимного подшипника подходящей по диаметру выколоткой
выбиваем сальник.

Тщательно очищаем,обезжириваем,,смазываем тонким слоем герметика,
сажаем сальник на место при помощи головки на «32».

Изучаем опорный «солдатик» вилки сцепления на предмет износа.
Осматриваем пружинную упорную шайбу (износ опорных поверхностей,трещины не допускаются).

Наносим немного литола на посадоное место шайбы и ставим её на место.При помощи литола шайба «приклеена» и не выпадет при сборке.

Займемся теперь задней крышкой.
Как правило в ней остается обойма одного или двух подшипников.Да и сальник тоже надо менять.
Выбиваем при помощи удлинителя заглушку.

Выбиваем сальник при помощи отвертки.

При помощи отвертки и молотка выбиваем подшипники из корпуса задней крышки.П. сидят без натяга,поэтому выбиваются легко.

Отмываем корпус,обезжириваем посадочные места сальника и заглушки.
  На посадочные места сальника и заглушки наносим герметик.
Запрессовываем сальник и заглушку.

Разборка коробки передач мотоцикла Урал.

Собрать коробку

 

Время от времени владельцам мотоциклов Урал приходится выполнять эту нехитрую операцию по разборке и сборке коробки передач. Ремонт вышедших из строя узлов в данной статье мы описывать не будем, ограничимся только разборкой  основных узлов на примере старой ураловской коробки без задней передачи.

Для начала необходимо слить масло  и снять коробку с мотоцикла. В зависимости от конкретного мотоцикла действия могут несколько отличаться. Но основное это поставить мотоцикл на центральную подставку, снять заднее колесо, снять редуктор заднего моста вместе с карданной передачей. Снять воздушный фильтр и резиновые патрубки. Отсоединить трос спидометра. Отсоединить трос сцепления. Выкрутить четыре гайки на шпильках крепления коробки к двигателю, ну а дальше кому как повезет. Например, на моем мотоцикле, приходится снимать глушители, приемные патрубки, откручивать верхнее крепление двигателя, вытаскивать заднюю шпильку крепления двигателя, наклонять двигатель вперед и только после этого коробку возможно вытащить из рамы.

Ну вот все необходимые манипуляции проделаны, приступаем в разборке.

Разборка коробки передач.

Снимаем рычаг кикстартера. Для этого откручиваем гайку и на клинышке и аккуратно выбиваем клин.

Снимаем рычажок выключения сцепления, предварительно вынув шток, грибок и подшипник из корпуса.

Откручиваем пару винтов, которые крепят втулку вала пускового механизма. Внимание, втулка под натягом, как только последний винт будет извлечен из паза можно получить удар по пальцам. Будьте осторожны, лучше использовать какой-нибудь ключ для удерживания втулки.

Выкручиваем семь болтов ключом на 10, крепления крышки к картеру.

Переворачиваем коробку крышкой вниз. Держим немного навесу рукой за корпус и молотком слегка постукиваем по первичному валу. Корпус остается в руках, а крышка со всеми внутренностями уходит вниз.

Вынимаем диск пускового механизма.

Вынимаем ось вилок из корпуса,  и вынимаем вилки переключения.

Расшплинтовываем и откручиваем гайку на 22 удерживающую вилку эластичной муфты на вторичном валу.  Вынимаем вилку, предварительно вытащив шестерню спидометра.

Вынимаем первичный и вторичный валы.

Далее осмотр, замена необходимых деталей.

Как самому собрать коробку передач  мотоцикла Урал смотри тут.

6.00 средний рейтинг (63% очки) — 4 голосов

Это может быть интересно

Разборка и сборка коробки передач ВАЗ-2107

При разборке коробки желательно любым способом маркировать, или запоминать где какая деталь стояла, потому как многие детали схожи.

При установке новых деталей нужно учитывать зазоры и притертость смежных деталей.

Разборка и ремонт коробки передач требуются при следующих неисправностях:

Повышенный шум в коробке передач:

— износ подшипников;

— износ зубьев шестерен и синхронизаторов;

— осевое перемещение валов.

Затрудненное переключение передач:

— износ сферического шарнира рычага переключения передач, отсутствие смазки в узле;

— деформация рычага переключения передач;

— заусенцы, погнутости, загрязнение гнезд штоков, заклинивание блокировочных сухарей;

— загрязнение шлицев скользящей муфты и ступицы;

— деформация вилок переключения передач.

Самопроизвольное выключение или нечеткое включение передач:

— износ лунок под шарики на штоках, поломка пружин фиксаторов;

— износ блокирующего кольца синхронизатора;

— поломка пружины синхронизатора;

— износ зубьев муфты синхронизатора или зубчатого венца синхронизатора.

Пониженный уровень или утечка масла:

— износ сальников первичного и вторичного валов;

— ослабление крепления крышек картера коробки передач, повреждение уплотнительных прокладок;

— ослабление крепления картера сцепления к картеру коробки передач.

Рассмотрим ремонт четырехступенчатой коробки передач. Ремонт пятиступенчатой коробки в основном не отличается, за исключением некоторых деталей. Ремонт пятиступенчатой коробки рассмотрим в следующей статье Ремонт пятиступенчатой коробки передач ВАЗ-2107

Тщательно очищаем от грязи, моем картер коробки передач щеткой и горячей водой с моющим средством снаружи и ставим ее на верстак картером сцепления вниз.

Двумя отвертками разводим секторы распорной втулки

снимаем ее и резиновую втулку демпфера.

Снимаем эластичную муфту и фланец со вторичного вала коробки передач

Головкой «на 13» отворачиваем две гайки крепления опоры

снимаем опору

Головкой «на 10» отворачиваем гайку крепления привода спидометра.

..и снимаем его.

Ключом «на 22» отворачиваем выключатель света заднего хода.

…и снимаем его.

Ключом «на 13» отворачиваем упор перемещения рычага переключения передач

Ключом «на 13» отворачиваем две гайки крепления кронштейна

Снимаем кронштейн и вынимаем болт с квадратной головкой

Ключом «на 13» отворачиваем остальные гайки крепления задней крышки коробки передач

Снимаем заднюю крышку, передвинув рычаг переключения вправо, чтобы освободить его от штоков включения передач

Осторожно, стараясь не повредить, снимаем прокладку задней крышки

Снимаем задний подшипник

Снимаем ведущую шестерню привода спидометра и ее фиксатор – стальной шарик

Головкой «на 10» отворачиваем болт крепления вилки включения передачи заднего хода

Снимаем вилку включения заднего хода и промежуточную шестерню заднего хода

Снимаем со штока включения заднего хода дистанционную втулку

Съемником снимаем стопорное кольцо с промежуточного вала

Снимаем ведущую шестерню заднего хода и пружинную шайбу

Съемником снимаем стопорное кольцо со вторичного вала

Снимаем ведомую шестерню заднего хода и пружинную шайбу

Ударной отверткой отворачиваем четыре винта крепления стопорной пластины подшипника и оси промежуточной шестерни заднего хода.

Снимаем стопорную пластину.

Вынимаем ось промежуточной шестерни заднего хода

Головкой «на 10» отворачиваем десять гаек крепления нижней крышки

29. Снимаем крышку с прокладкой.

Кладем коробку передач на бок.

Головкой «на 13» отворачиваем одну гайку,..

…а головкой «на 17» – шесть гаек крепления картера сцепления к коробке передач

Разъединяем картеры и снимаем прокладку.

Ключом «на 13» отворачиваем два болта крепления крышки фиксаторов штоков

Снимаем крышку и извлекаем из отверстий три пружины и три шарика

Вынимаем шток вилки включения заднего хода.

Головкой «на 10» отворачиваем болт, крепящий вилку включения III и IV передач

Выдвигаем штоки, одновременно удаляя блокировочные сухари

Полностью вынимаем шток вилки включения III и IV передач

Головкой «на 10» отворачиваем болт, крепящий вилку включения I и II передач.

Вынимаем шток вилки включения I и II передач.

Нажав на муфты, включаем сразу две передачи и ключом «на 19» отворачиваем болт крепления переднего подшипника промежуточного вала.

Поддев двумя отвертками за стопорное кольцо, вынимаем передний подшипник промежуточного вала

Выталкиваем наружу задний подшипник промежуточного вала

Наклонив, вынимаем промежуточный вал из картера коробки передач.

Вынимаем две вилки переключения передач.

Поддев отверткой, вынимаем первичный вал в сборе с подшипником и кольцом синхронизатора.

Снимаем игольчатый подшипник со вторичного вала.

Поддев отверткой, извлекаем шпонку с задней части вторичного вала.

Поддев двумя отвертками, снимаем задний подшипник вторичного вала

Вынимаем вторичный вал из картера коробки передач.Вертикально устанавливаем вторичный вал, зажав его в тисках через картонные прокладки

Снимаем муфту синхронизатора III и IV передач.

Съемником снимаем стопорное кольцо…

…и снимаем ступицу синхронизатора и пружинную шайбу

Поддев отверткой, снимаем стопорное кольцо, а также блокирующее кольцо синхронизатора и пружину синхронизатора.

Снимаем шестерню III передачи

Оперев шестерню I передачи на жесткое основание, молотком через проставку из мягкого металла выбиваем вторичный вал и снимаем с него шестерню II передачи в сборе, муфту синхронизатора I и II передач, ступицу синхронизатора, шестерню I передачи и втулку шестерни I передачи.

Элементы синхронизаторов I, II и IV (на первичном валу) передач разбираются аналогично синхронизатору III передачи.

Для снятия подшипника первичного вала съемником разжимаем стопорное кольцо…

…и снимаем его вместе с пружинной шайбой

Оперев подшипник на жесткое основание, молотком через выколотку из мягкого металла выбиваем первичный вал.

Для снятия рычага переключения передач с задней крышки картера коробки передач отсоединяем от рычага возвратную пружину

Ключом «на 10» отворачиваем три гайки крепления шаровой опоры рычага и. ..

…снимаем рычаг со шпилек.

Для замены манжеты первичного (ведущего) вала выбиваем выколоткой манжету через отверстие в передней крышке коробки передач и…

…снимаем ее

Перед осмотром детали коробки передач тщательно очистите. Щеткой или скребком удалите все отложения и очистите отверстия и шлицы от возможных загрязнений; затем промойте, чтобы устранить и растворить все остатки масла.

Обдуйте детали струей сжатого воздуха и аккуратно протрите их. Особенно тщательно продуйте подшипники, направляя струю сжатого воздуха так, чтобы не возникало быстрого вращения колец.

На зубьях шестерен и муфт не должно быть сколов, задиров, усталостных выкрашиваний и заметного износа.

Поверхности валов, осей и штоков переключения передач должны быть совершенно гладкими, без задиров, раковин и сильного износа. На картере не должно быть трещин и забоин, а в расточках под подшипники – износа и следов проворачивания.

На шлицах валов недопустимы коррозия и следы смятия и заедания.

Незначительные повреждения можно устранить мелкой шкуркой с последующей полировкой, но лучше заменить поврежденные детали новыми.

Все подшипники качения, как шариковые, так и роликовые, должны быть в безукоризненном состоянии, их радиальный люфт не должен превышать 0,05 мм, на дорожках и телах качения недопустимы любые дефекты.

Сепараторы не должны иметь разрывов, касаний колец и оплавлений (у пластмассовых).

Вообще, если «пробег» коробки превышает 120 тыс. км и производится ремонт агрегата с разборкой, все подшипники лучше заменить новыми независимо от их состояния, особенно если были замечены сильные повреждения шестерен и муфт включения передач.

Манжеты заменяем новыми в любом случае. При сборке смазываем все детали коробки, в т.ч. гнезда подшипников и сами подшипники трансмиссионным маслом, стыки картера и крышек покрываем тонким слоем маслостойкого герметика, а детали механизма переключения – смазкой ШРУС-4.

Собираем коробку передач в порядке, обратном разборке.

Пружина фиксатора штока вилки заднего хода отличается от других жесткостью, она имеет черное покрытие.

Перед установкой рабочую поверхность манжет покрываем тонким слоем смазки Литол-24. Болт зажимной шайбы подшипника промежуточного вала затягиваем моментом 8,1–10,0 кгс∙м. Гайку заднего конца вторичного вала затягиваем моментом 6,8–8,4 кгс∙м.

Зил 130 — Разборка коробки передач на узлы

Для разборки коробки передач на узлы используют поворотный стенд (рис. ПО), на котором можно одновременно установить пять коробок передач. Коробку 1 передач фиксируют на стенде зажимами 2 и 5. Рукоятка 4 позволяет поворачивать коробку передач в удобное для разборки положение.

Отвернув болты 15 и 21 ( рис. 111) с пружинными шайбами 6, снимают механизм переключения коробки передач и прокладку 23.

Для снятия правой и левой боковых крышек 7 ( рис. 112) с прокладками 3 отвертывают Г-образным ключом по шесть болтов 5 с пружинными шайбами 6.

Для демонтажа ведущего вала 11 отвертывают болты 17, крепящие крышку 15 подшипника к коробке передач, снимают крышку и прокладку 8 крышки. При помощи оправки из мягкого металла и молотка смещают вперед ведущий вал 11 с подшипником 12 так, чтобы они вышли из гнезда картера 1 коробки передач, и вынимают роликовые

подшипники 10 из шестерни ведущего вала, предварительно сняв стопорные кольцо 9.

Ведомый вал 54 коробки передач с подшипником смещают назад из картера 1 при помощи оправки из мягкого металла и молотка так, чтобы шариковый подшипник вышел из гнезда в картере коробки передач, и снимают синхронизатор 42 четвертой и пятой передач. Съемником снимают шариковый подшипник 59 ведомого вала, а рукой — ведущие шестерни 61 и 67 привода спидометра. С шарикового подшипника 59 при помощи двух отверток или съемника снимают стопорное кольцо 60. Поднимая передний конец картера 1 коробки передач, вынимают ведомый вал 54 в сборе с шестернями и шестерню 53 первой передачи.

Для снятия блока шестерен заднего хода вывертывают стопорный болт 5 оси заднего хода, снимают пружинную шайбу и стопор 22 оси. Съемником снимают ось 21 блока шестерен заднего хода и вынимают из картера 1 блок шестерен 18 с роликовыми подшипниками 19. Из блока шестерен вынимают роликовые подшипники 19 и распорную втулку 20.

Отвернув четыре болта 17 с пружинными шайбами 6, снимают крышку 24 заднего подшипника промежуточного вала с прокладкой 26. Предварительно отогнув завальцованную часть, отвертывают гайку 25 заднего подшипника промежуточного вала. При помощи оправки из

мягкого металла и молотка спрессовывают промежуточный вал 29 назад настолько, чтобы задний шариковый подшипник 28 и передняя шейка вала вышли

Рис. 111. Детали механизма переключения коробки передач:

1—рукоятка рычага переключения передач; 2— чехол рычага; 3— стопор рычага; 4 — рычаг переключения передач; 5, 15 ц 21—болты; 6—пружинные шайбы; 7—картер рычага переключения передач; 8— ось промежуточного рычага; 9 и 23 — прокладки; 10— гайка оси; 11—предохранитель включения заднего хода; 12 — пружина предохранителя; 13 — шайба предохранителя; 14 — шплинт; 16 — сапун; 17 — промежуточный рычаг переключения первой передачи и заднего хода; 18 — опора рычага; 19 — пружина рычага; 20 — установочная втулка картера рычага; 22— крышка коробки передач; 24 и 39 — заглушки; 25— вилка переключения второй и третьей передач; 26 — шток переключения второй и третьей передач; 27 — вилка переключения четвертой н пятой передач: 28—шток переключения четвертой и пятой передач; 29 и 33 — шплинтовая проволока; 30-—шток переключения первой передачи и заднего хода; 31—головка штока переключения первой передачи и заднего хода; 32 — стопорный болт; 34 — вилка переключения первой передачи и заднего хода; 35 — шарики замка штоков; 36—штифт замка штоков; 37 — фиксаторный шарик; 38 — пружина фиксатора

1 — картер коробки; 2, 3, 8 и 26— прокладки; 4 — пробка спускного отверстия с магнитом; 5, 17 и 55— болты; 6 и 55 — пружинные шайбы; 7 — крышка люка; 9, 13, 27, 37, 35, 43, 50 и 60— стопорные кольца; 10, 19 и 38—роликовые подшипники; // — ведущий вал; 12, 16, 28 и 55 — шариковые подшипники; 14 — гайка подшипника ведущего вала; 15 — крышка подшипника ведущего вала; 18 — блок шестерен заднего хода; 20 и 35 —распорные втулки; 21 — ось блока шестерен; 22 — стопор оси; 23 — пробка маслоналивного отверстия; 24 — крышка заднего подшипника промежуточного вала; 25 — упорная гайка заднего подшипника промежуточного вала; 29 — промежуточный вал; 30 — шпонки шестерен; 31— шестерня второй передачи промежуточного вала; 32 — шестерня заднего хода промежуточного вала: 33—шестерня третьей передачи промежуточного вала; 34 — шестерня четвертой передачи промежуточного вала; 36—шестерня постоянного зацепления промежуточного вала; 40 — заглушка; 41—уплоткителькое кольцо; 42 — синхронизатор четвертой и пятой передач; 44, 47. 51 и 6Б — упорные шайбы; 45—шестерня четвертой передачи ведомого вала; 46-—втулка шестерни четвертой передачи; 48 — шестерня третьей передачи ведомого вала; 49 — синхронизатор второй и третьей передач в сборе; 52 — шестерня второй передачи ведомого вала; 53 — шестерня первой передачи ведомого вала; 54 — ведомый вал; 57 — стопор штуцера; 58 — штуцер; 61 и 67 — ведущие шестерни привода спидометра; 62 н 68—ведомые шестерни привода спидометра; 63—сальник; 64 — фланец ведомого вала;

66 — гайки фланца

из своих гнезд. При помощи приспособления с заднего подшипника 28 снимают стопорное кольцо 27, а при помощи съемника — задний подшипник 28. Вынув из картера 1 промежуточный вал 29 в сборе с шестернями, при помощи оправки из мягкого металла и молотка выбивают заглушку 40 и передний роликовый подшипник 38, из гнезда переднего подшипника вынимают при помощи приспособления стопорное кольцо 37.

Задать вопрос на форуме

Как правильно разобрать кровать для перемещения

Разборка кровати для переезда может показаться неприятной, но если все сделано правильно и достаточно рук, чтобы помочь, это можно сделать всего за несколько минут. При разборке кровати нужно выполнить четыре простых шага.

Как разобрать кровать:

1. Уберите все постельное белье, подушки и постельные принадлежности

Переезд — отличное время, чтобы тщательно очистить все постельное белье. Найдите время, чтобы постирать пододеяльник, декоративные наволочки и другие постельные принадлежности, которые стираются не так часто, как простыни.Вы будете рады получить свежее постельное белье для сна в первую ночь после переезда в новый дом. Когда постельное белье станет чистым, аккуратно сложите его для упаковки. Многим людям нравится использовать пакеты с вакуумным уплотнением для постельного белья, потому что это уменьшает объем этих громоздких вещей. Однако вакуумная герметизация может смять ваши простыни и наволочки больше, чем просто упаковка предметов в коробку. Если вы предпочитаете складывать вещи в коробки, используйте большие или очень большие движущиеся коробки, в которые может поместиться объемное постельное белье.

2.

Снимите матрас и пружинный блок

Вам понадобится как минимум еще один помощник на этом этапе, потому что матрасы и пружинные блоки громоздкие, тяжелые и с ними сложно обращаться.Сначала поднимите матрас, снимите его с кровати и положите в пластиковый мешок для хранения матраса. Это защитит ваш матрас от потертостей, пятен и повреждений во время движения. Затем снимите коробочную пружину и аналогичным образом поместите ее в защитный мешок.

3. Открутите изголовье и изножье от каркаса кровати

Если у вас декоративные изголовье и подножка, открутите их от металлического каркаса кровати. Логистика этого шага будет зависеть от типа изголовья / изножья, которое у вас есть.При снятии крепежа обязательно держите под рукой пластиковый пакет, в который можно опустить винты, гайки и болты. Закройте пакет и прикрепите его к изголовью с помощью ленты или полиэтиленовой пленки.

4. Разобрать основной каркас кровати

Если у вас традиционная кровать, у вас должен остаться прямоугольный металлический каркас после того, как вы удалите все остальное. Снимите болты и винты с рамы, соблюдая осторожность, чтобы не сорвать винты при использовании электрической отвертки. Подготовьте пакет, в который поместите все оборудование, затем заклейте его и прикрепите к части рамы с помощью ленты или полиэтиленовой пленки.

Если вы потратите дополнительное время на отслеживание оборудования для вашей кровати и каркаса, повторная сборка будет гораздо менее утомительной. Кроме того, чистка постельного белья и защита матраса и пружинного матраса с помощью матрасного мешка обеспечат вам красивую чистую постель, в которую вы сможете скользить после долгого дня. Хотя вы можете разобрать и собрать кровать самостоятельно, когда вы перемещаетесь с Imperial Moving, вам нужно беспокоиться на одну вещь меньше. Наша команда опытных грузчиков будет рада разобрать и собрать вашу кровать в рамках вашего полного переезда в Нью-Йорк.

Лучшая цена для разборки коробки — Отличные предложения по разборке коробки от мировых продавцов разборных коробок

Отличные новости !!! Вы попали в нужное место для разборки коробки. К настоящему времени вы уже знаете, что что бы вы ни искали, вы обязательно найдете это на AliExpress. У нас буквально тысячи отличных продуктов во всех товарных категориях. Ищете ли вы товары высокого класса или дешевые и недорогие оптовые закупки, мы гарантируем, что он есть на AliExpress.

Вы найдете официальные магазины торговых марок наряду с небольшими независимыми продавцами со скидками, каждый из которых предлагает быструю доставку и надежные, а также удобные и безопасные способы оплаты, независимо от того, сколько вы решите потратить.

AliExpress никогда не уступит по выбору, качеству и цене.Каждый день вы будете находить новые онлайн-предложения, скидки в магазинах и возможность сэкономить еще больше, собирая купоны. Но вам, возможно, придется действовать быстро, поскольку эта верхняя разборная коробка в кратчайшие сроки станет одним из самых востребованных бестселлеров. Подумайте, как вам будут завидовать друзья, когда вы скажете им, что приобрели коробку для разборки на AliExpress. Благодаря самым низким ценам в Интернете, дешевым тарифам на доставку и возможности получения на месте вы можете еще больше сэкономить.

Если вы все еще не уверены в разборке коробки и думаете о выборе аналогичного товара, AliExpress — отличное место для сравнения цен и продавцов.Мы поможем вам решить, стоит ли доплачивать за высококлассную версию или вы получаете столь же выгодную сделку, приобретая более дешевую вещь. А если вы просто хотите побаловать себя и потратиться на самую дорогую версию, AliExpress всегда позаботится о том, чтобы вы могли получить лучшую цену за свои деньги, даже сообщая вам, когда вам будет лучше дождаться начала рекламной акции. и ожидаемая экономия.AliExpress гордится тем, что у вас всегда есть осознанный выбор при покупке в одном из сотен магазинов и продавцов на нашей платформе.Реальные покупатели оценивают качество обслуживания, цену и качество каждого магазина и продавца. Кроме того, вы можете узнать рейтинги магазина или отдельных продавцов, а также сравнить цены, доставку и скидки на один и тот же продукт, прочитав комментарии и отзывы, оставленные пользователями. Каждая покупка имеет звездный рейтинг и часто имеет комментарии, оставленные предыдущими клиентами, описывающими их опыт транзакций, поэтому вы можете покупать с уверенностью каждый раз. Короче говоря, вам не нужно верить нам на слово — просто слушайте миллионы наших довольных клиентов.

А если вы новичок на AliExpress, мы откроем вам секрет. Непосредственно перед тем, как вы нажмете «купить сейчас» в процессе транзакции, найдите время, чтобы проверить купоны — и вы сэкономите еще больше. Вы можете найти купоны магазина, купоны AliExpress или собирать купоны каждый день, играя в игры в приложении AliExpress. Вместе с бесплатной доставкой, которую предлагают большинство продавцов на нашем сайте, вы сможете приобрести disassembly box по самой выгодной цене.

У нас всегда есть новейшие технологии, новейшие тенденции и самые обсуждаемые лейблы. На AliExpress отличное качество, цена и сервис всегда в стандартной комплектации. Начните самый лучший шоппинг прямо здесь.

Как разобрать и упаковать каркас кровати

Независимо от того, есть ли у вас кровать из ротанга размера «king-size» или полная обивка, когда дело доходит до упаковки вашей спальни, разборка кровати может показаться самой сложной задачей.Но с правильными инструментами и некоторыми ноу-хау вы можете быстро с этим справиться. Следуйте этим советам по упаковке каркаса кровати!

Узнайте, сколько стоят профессиональные грузчики и упаковщики!

Получить цитаты

Перемещение принадлежностей, которые необходимо разобрать и упаковать каркас кровати

• Набор инструментов с отверткой и гаечным ключом
• Одеяла передвижные
• Пакеты на молнии или упаковочная бумага
• Лента упаковочная
• Перманентный черный маркер

Как разобрать и упаковать каркас кровати для переезда

1.Попросите другого человека помочь

Разборка мебели, особенно громоздкой кровати, — это определенно работа двух человек. Каркасы ваших кроватей из металла или дерева? У некоторых есть прикрепленное изголовье и подножка или только изголовье? Каждая кровать в вашем доме может иметь разную конфигурацию, от кроватей-платформ, кроватей-саней и кроватей с балдахином до двухъярусных кроватей и многого другого. Независимо от типа, обязательно обратитесь за помощью в разборке.

2. Соберите упаковочные материалы

Разложите движущееся одеяло на полу, чтобы вы могли сразу же положить каждую деталь в защищенное место при разборке рамы.Подготовьте набор инструментов, пакеты на молнии, упаковочную ленту и перманентный маркер.

3. Снимите станину

Удалите все постельные принадлежности. Если у вас есть время, постирайте простыни и наволочки, чтобы у вас было чистое постельное белье, когда вы соберете и заправите кровать в новом доме. Мы даем советы по упаковке постельного белья в этом разделе: «Как упаковать подушки и постельное белье для переезда».

4. Снимите матрас и пружинный блок

Когда вы снимаете матрас и пружинный блок, либо прислоните его к стене, либо положите его в сумку / коробку для матраса, пока вы держите их в руках.Мы описываем лучшие способы упаковки матраса и пружины коробки здесь: Как упаковать матрас и пружину коробки для перемещения.

5. Снимите изголовье и изножье с каркаса кровати

Каркасы кроватей крепятся к изголовьям и подножкам различными способами:

Некоторые металлические рамы кровати защелкиваются.

Некоторые металлические и деревянные рамы для кроватей крепятся винтами или гайками и болтами.

Некоторые крепятся с помощью специально изготовленных скоб.

Если каркас кровати прикреплен к изголовью и изножье с помощью винтов, используйте отвертку, чтобы вывернуть винты.Если каркас кровати соединяется с изголовьем и подножкой с помощью специально сделанных скоб, может оказаться полезным использование блока для ослабления скоб. Если у кровати есть рейки, которые ввинчиваются в направляющие каркаса кровати, снимите их и сложите рейки вместе.

Поместите все винты, гайки и болты в пакет с застежкой-молнией или оберните их упаковочной бумагой и заклейте лентой. Поместите фурнитуру в отдельные мешочки или пакеты для каждой части каркаса кровати. Обязательно пометьте, чтобы не было путаницы в том, что и куда попадает, когда вы собираете каркас кровати в своем новом доме.

6. Оберните изголовье, подножку и поручни подвижными одеялами

Положите подножку на одеяло по диагонали. Оберните одеяло вокруг подножки и закрепите его упаковочной лентой или бинтом. Таким же образом сделайте изголовье, а затем боковые поручни и рейки. Прикрепите каждую сумку с оборудованием к соответствующей части кровати с помощью ленты или тесьмы. Таким образом, важные гайки и болты не пропадут во время движения.

Получите оценку стоимости вашего переезда прямо сейчас.

Начать

---

Конструкция для разборки | Пенсар Девелопмент

Утюг был включен, но пластинка на ощупь остыла. Осознание того, что после двух коротких лет службы, было мертво.

Я помню, как дедушка чинил всевозможную бытовую технику, рос, возился и ругался часами, прежде чем создать новый функциональный продукт. Я тоже поставил утюг на верстак, чтобы оживить его. Я сразу понял, что это будет нелегко.Все винты снаружи имели фирменную головку. После некоторой осторожной работы с острием иглы они исчезли, но пластмассовые гильзы все еще не разваливались. Я нажал отверткой, затянул ручки, натянул на защелки. Добравшись, наконец, до металлической основы, я обнаружил, что она покрыта эпоксидной смолой. К тому времени, как все было сказано и сделано, мое железо лежало на прилавке дюжиной осколков, и я проклинал работу своей профессии.

Глубоко разочарованный этим опытом, я снова разбирал то же железо, документируя каждый шаг, чтобы проиллюстрировать боль.Вооружившись знаниями, полученными в результате моей неудачной первой попытки, это было немного проще, но все же потребовалось 67 шагов, чтобы разделить 52 части. Design for Disassembly (DfD) мог бы предотвратить этот беспорядок.

Процесс разборки железа от Алекса Динера на Vimeo

Что такое конструкция для разборки?

Дизайн для разборки — это стратегия проектирования, которая учитывает будущую потребность в разборке продукта для ремонта, восстановления или переработки. Потребуется ли ремонт продукта? Какие детали потребуют замены? Кто его отремонтирует? Как сделать опыт простым и интуитивно понятным? Можно ли вернуть, отремонтировать и перепродать продукт? Если его нужно выбросить, как мы можем облегчить его разборку на легко перерабатываемые компоненты? Отвечая на подобные вопросы, метод DfD увеличивает эффективность продукта как во время, так и после его срока службы.

Десять секунд до полной разборки.

Например, этот недорогой контейнер для мулине воплощает в себе суть DfD — простой в сборке и разборке. Его легко открыть, без клея, винтов или тепловых стержней. Материал основного компонента четко обозначен, и части быстро разделяются.

Откуда появился DfD?

Наши древние инструменты, тщательно изготовленные из натуральных материалов и предназначенные для ремонта и повторного использования, возможно, являются самым ранним примером DfD.Во время роста потребления в 1950-х, вызванного методами массового производства, дешевой рабочей силой и дизайнерской модой, одноразовое использование стало нормой. Со временем были обнаружены отходы, образовавшиеся в результате запланированного устаревания и культуры одноразового использования. Организации изучили негативное влияние токсинов, обнаруженных в отходах нашей продукции, и правительства начали регулировать. В 2004 году Европейский Союз принял знаковую Директиву WEEE (Об отходах электрического и электронного оборудования), возложив ответственность за утилизацию электронных продуктов на их производителей.Этот тектонический сдвиг был признан мировыми производителями признаком грядущих событий, что вызвало интерес к стратегии DfD.

Дорожная карта «Дизайн для разборки».

Как мне DfD?

Учитывая экологические и финансовые ограничения, наша задача состоит в том, чтобы не только создавать, но и убирать продукт. А стратегии DfD применяются на протяжении всего цикла проектирования; дизайнерам нужно будет обучать команду, обнаруживать отходы, ставить цели, создавать решения, а затем отслеживать результаты в процессе производства, выпуска, использования и окончания срока службы.

Выше представлена ​​общая дорожная карта How-to-DfD. Это не установленный путь, а набор действий, которые можно выполнять практически в любом порядке для достижения конечной цели разработки более эффективных продуктов. Как и следовало ожидать, из соображений безопасности не все продукты должны разбираться пользователями. Разборку продуктов с высоким риском (таких, как медицинские устройства, высоковольтная электроника, автомобили и т. Д.) Лучше доверить обученным техникам (или MacGyver).

С помощью нескольких практиков DfD я подробно остановлюсь на ключевых этапах DfD ниже, от фазы предварительного проектирования на основе исследований до пользовательского тестирования пост-дизайна.Если у вас есть опыт работы с DfD, пожалуйста, присоединитесь к диалогу, разместив свои советы, методы и опыт в разделе «Согласие дизайнеров и экологичный дизайн» на форумах Core77 (и включите «DfD» в заголовок).

Поехали:

Предварительный дизайн: организационное обучение + бай-ин

Снижение затрат на рабочую силу: Продукты, которые легко разбираются, часто легко собираются, что позволяет компании экономить время и деньги на рабочей силе. Кроме того, если продукты необходимо отремонтировать или отремонтировать, быстрая разборка сэкономит время и силы для компании и оставит удовлетворение клиента.

Снижение материальных затрат: решения DfD подчеркивают простоту. Внимательно изучая анатомию продукта, дизайнеры часто могут найти компоненты, которые можно объединить или полностью удалить, что позволяет сэкономить на материалах и производственных расходах. Кроме того, когда продукты можно отремонтировать, значительно снижаются материальные и производственные затраты, как в случае одноразовых фотоаппаратов или картриджей для принтеров.

Открывайте новые рынки: люди замечают, когда компании делают разумный выбор. Honda, лидер в производстве экономичных автомобилей, заработала репутацию производителя автомобилей, которые минимизируют их воздействие на окружающую среду.«Потребители признают Honda лидером в разработке эффективных автомобилей. Конструкция с учетом разборки является частью нашей стратегии создания автомобилей с учетом срока службы », — отмечает Хосе Висзогрод из Honda R + D America. Honda активно заявляет о своей философии дизайна в своем маркетинге, что помогает стимулировать продажи экологически сознательных потребителей.

Системное мышление: «Наличие у дизайнеров понимания того, как они могут повлиять на различные группы в организации, имеет фундаментальное значение для разработки более экологичных продуктов», — отмечает Фил Берри, президент Sustainable Product Works и бывший директор по устойчивому развитию обуви в Nike.«Раньше команды разработчиков были изолированы друг от друга, но теперь они работают вместе, чтобы найти новые способы создания продуктов, которые можно разделить на чистые материалы». Видя, что продукты можно утилизировать, дизайнеры меняют способ их изготовления, чтобы эти материалы можно было повторно интегрировать в производственный цикл.

Walk the Talk: «Если у компании есть мандаты, возложите ответственность за достижение этих целей на команду», — отмечает Трэвис Ли, руководитель отдела устойчивого дизайна в Lunar. Когда компании устанавливают политику в области экологии, командам разработчиков необходимо напоминать людям об этих целях, а затем поднимать планку выше.

Совместное использование целей со стратегическими поставщиками: «Работайте со своими партнерами, чтобы предлагать новые решения», — отмечает Хосе Вышогрод. В тесном сотрудничестве с производителями компания Honda разработала искусственную кожу, пригодную для вторичной переработки. Материал не только может повторно попасть в поток ресурсов, он также устраняет токсичные химические вещества, содержащиеся в производстве кожи, такие как хром. Поставщики являются экспертами в своей области и могут предложить лучшие альтернативы, если команда разработчиков сообщит о своих целях.

Предварительный дизайн: исследование потока переработки

Посещение производства и сборки: относительно своих визитов к азиатским поставщикам Nike Фил Берри заявляет: «Из первых рук проанализировав производственные мощности, мы смогли вернуть примерно 15% материала, который был бы утилизирован.Мы также смогли разработать новые методы изготовления нашей обуви, с учетом будущего разрушения конструкции ». Изучая производственный процесс, дизайнеры могут выявлять сложности, задержки и потери, связанные с определенными методами строительства и выбором материалов.

Когда я был в SonoSite Ultrasound, Джейк, техник по сборке, крикнул: «Привет, господин дизайнер, я слышал, вы разрабатываете новую медицинскую тележку…» «Угу, да», — ответил я. «Это сложно построить, поэтому, если у вас есть время, я хотел бы показать вам некоторые вещи…» Это открыло диалог, который упростил следующие три поколения конструкции медицинской тележки, что привело к снижению затрат на запчасти на 450 долларов и меньше. время сборки.Развивайте контакты на производстве, от которых вы можете получать неотфильтрованную обратную связь. Они ежедневно воплощают в жизнь дизайн и являются хорошим ранним индикатором того, насколько успешными были усилия DfD.

Посетите предприятие по переработке отходов: «Нет альтернативы тому, чтобы попасть в траншеи», — комментирует Ли о своих посещениях предприятия по переработке и утилизации отходов Сан-Франциско. Есть вопрос, как что-то сортируется и обрабатывается? Если сомневаетесь, обратитесь к первоисточнику.

Дизайн: постановка целей + планирование проекта

Долгосрочная + краткосрочная: чтобы помочь измерить производительность, установите ряд долгосрочных и краткосрочных целей.«Устранение краски» было бы простой и достижимой целью, например, тогда как «сокращение времени сборки на 50%», вероятно, потребовало бы гораздо больших усилий. Краткосрочные цели принесут команде ощутимые результаты и помогут мотивировать их продолжать работать над долгосрочными усилиями. Независимо от того, являетесь ли вы консультантом или корпоративным дизайнером, не забудьте включить создание целей DfD и управление ими в объем работы и график.

Письменный, видимый + измеримый: политика Herman Miller «Дизайн в интересах окружающей среды» (DFE) оценивает продукты на основе трех основных факторов: химический состав материала, конструкция для разборки и возможность вторичной переработки. «В процессе оценки продукта мы задаем четыре вопроса о наших разработках: однородны ли материалы? Используются ли общие инструменты для их разделения? Обратное соединение заняло больше 30 секунд? И были ли компоненты отмечены типом материала? » — объясняет Скотт Харон, менеджер программы DFE Германа Миллера. Каждый компонент тщательно исследуется на основе этих факторов и присваивается рейтинг в таблице оценок, что позволяет команде разработчиков точно оценить результаты.

Чтобы о них не забыли, сделайте цели написанными и хорошо заметными. «Сокращение времени сборки» — более слабая цель, чем «Сокращение времени сборки с 4 до 2 минут». Отслеживание показателей также позволит дизайнерам продемонстрировать экономию, которую DfD внесла в компанию. Не дожидайтесь конца проекта, чтобы вернуться к своим целям; используйте обычные обзоры проекта, чтобы следить за прогрессом. Вряд ли вы достигнете всех своих целей с первого раза. Агрессивные цели заслуживают того, чтобы их преследовать, учиться и развивать каждое последующее поколение продуктов.

Дизайн: исследовательские материалы + процессы

Каталог

: Огромный спектр различных материалов, процессов, методов сборки и производителей может привести к перегрузке информации. Создавайте документы для отслеживания материалов, дизайна и вариантов обработки, а также для улучшения документов.

Уменьшите количество типов застежек: в целом уменьшение вариации снижает стоимость. Если копировальный аппарат имеет 34 различных типа винтов, компания должна отслеживать, заказывать и складировать их… а рабочие должны быть обучены и снабжены соответствующими инструментами для их установки.Если в конструкции можно использовать всего 3 типа шнеков, можно сэкономить материальные затраты, управление и рабочее время. Или дизайнеры могут заменить винты на литые карабины. «Мы заменили большинство винтов на карабины. Для установки болтов требуется персонал, и они могут откручиваться при вибрации », — отмечает Хосе из Honda R + D.

Минимизируйте типы материалов: если конструкция может состоять из меньшего количества деталей и типов материалов, ее будет легче отсортировать и переработать. Возьмем, к примеру, этот контейнер для нити.Когда все будет готово, весь стальной корпус может быть полностью переработан. Если бы другая сторона была пластиковой, ее нужно было бы вручную отделить и отсортировать для переработки.

Контейнер для нити, состоящий из двух металлических половинок и пластиковой катушки.

Избегайте постоянной фиксации (клеи, совместное формование) различных материалов: формованная зубная щетка или кухонный инструмент не подлежат переработке. Разные материалы не могут быть переработаны вместе. У Nike была аналогичная проблема с их обувью. «Связанные ткани не позволяли им снова попасть в поток материала.Вместо этого мы исследовали способы сшивания или шнурка материала вместе », — отметил Фил Берри о таких проектах, как ботинки Nike Учитываемые. «Если требуется ультразвуковая сварка, мы обнаружили, что точечная сварка, а не шовная сварка может обеспечить разделение в будущем», — говорит Трэвис Ли из Lunar.

Избегайте токсичных или вредных материалов и химикатов: «Хромированная отделка требует токсичных химикатов, поэтому в наших новых автомобилях мы активно ищем альтернативные варианты отделки», — отмечает Хосе из Honda R + D. Обработка химикатов и материалов, таких как ПВХ, свинец, ПБДЭ и антипирены ПБД, как известно, токсична, поэтому следует использовать альтернативы.DfD усиливает взаимосвязь между наукой о материалах и дизайном, требуя от дизайнера понимания значимости выбранных материалов.

Избегайте окрашивания: цвет пластика, получаемого в форме, предпочтительнее краски или металлических покрытий. Краски и покрытия дороги, плохо изнашиваются и препятствуют переработке пластмасс. Выбросы ЛОС от их применения способствуют загрязнению воздуха и строго регулируются. Для металлических деталей хорошей альтернативой является порошковое покрытие, обеспечивающее лучшую долговечность и меньшее количество выбросов ЛОС.

Определение типов материалов: маркировка деталей международными символами переработки позволяет переработчикам уверенно сортировать предметы в нужный поток материалов.

Великолепные семь икон вторичной переработки. (Кто-нибудь знает сообщество, которое на самом деле перерабатывает различные пластмассы до 7 лет?)

Дизайн: создание концепций DfD

Опыт пользователя: «Продумайте все до конца. Визуализируйте или смоделируйте шаги по ремонту или разборке продукта.- говорит Трэвис из Lunar. Вам нужно использовать ваши навыки человеческого фактора в процессе разборки.

У каждого продукта много «пользователей»: люди, занимающиеся производством и сборкой, потребитель (потребители), специалисты по обслуживанию, специалисты по восстановлению и переработчики. Полезно сопоставить этих пользователей и то, как дизайн предназначен для достижения их целей.

Обеспечьте руководство и доступность: дайте им инструкции, которые никогда не будут потеряны — индикаторы тиснения или выдавливания, чтобы направлять пользователей через разборку — потому что к тому времени, когда продукт нужно будет разобрать, руководство пользователя, скорее всего, исчезнет.

Защелки

полезны, потому что они устраняют винты, но могут быть невидимыми и неприятными, если нет индикаторов, показывающих их местоположение. Для облегчения и упрощения разборки рекомендуются общие инструменты и крепежные детали. Продукты, которые сложно отремонтировать или разобрать, будут продвигаться потребителями и избегать их повторного производства.

Конструкция для легкого ремонта + доступ к деталям: если он изношен, его необходимо заменить, и конструкция должна поддерживать это.Батареи, движущиеся компоненты, контактные площадки — все это примеры частей, которые в какой-то момент потребуют замены. Задача двоякая: упростить замену и сделать детали доступными для покупки через веб-сайт или у торгового посредника. Если не учитывать эти два фактора, срок службы продукта сильно ограничен.

Метод Акилле Кастильони без инструментов для замены ремешка на часах AL6021.

Повышение эффективности: Иногда лучшим решением DfD является устранение или объединение частей.Подразделение ноутбуков Hewlett Packard начало с сокращения количества деталей, связанных с упаковкой. «Мы обратили внимание на количество коробок, руководств и компонентов из пеноматериала, которые поставляются с одним ноутбуком, и нашли способы заменить их альтернативными или полностью отказаться от них», — комментирует Стейси Вольф, директор по дизайну ноутбуков в HP. Пеноблоки были заменены оболочками из бумажной массы с сформированными отсеками для разделения различных компонентов и исключения дополнительных коробок. Руководства пользователя были заменены двухгигабайтной SD-картой, которую можно было повторно использовать с любым SD-совместимым устройством.Другой дизайн ноутбука, созданный для Walmart, заменил коробочную упаковку на компьютерный корпус в стиле сумки-почтальона.

Благодаря упаковке HP для ноутбука не было нескольких коробок, пакетов и пенопласта на каждом поставленном компьютере.

Пост-дизайн

Это пользовательское тестирование, на которое немногие тратят время, но оно должно происходить: спрашивать пользователей, линии по восстановлению и операции по переработке: «Как бы вы избавились от этого?» Столкнувшись с проблемой смертности объекта, дизайнеры могут узнать, как их решения влияют на конечный срок эксплуатации.Превратите эту обратную связь в цели, чтобы поделиться с командой DfD.

Дизайн, который изменит мир, не происходит в одночасье. Вместо этого вещи постепенно развиваются, чтобы создать более высокий стандарт. Разборный дизайн (DfD) имеет фундаментальное значение для повышения стоимости, качества и долговечности нашей продукции. DfD выполняет свое обещание предоставить людям лучшие инструменты для жизни на долгие годы.

Выражаем особую благодарность Филу Берри (Sustainable Product Works), Трэвису Ли (Lunar), Хосе Висзогроду (Honda R + D Америка), Стейси Вольф (Hewlett Packard) и Скотту Харону (Herman Miller) за их опыт и идеи.

Интернет-ресурсы: Билль о правах производителя, каталог материалов Ecolect, Полевое руководство по устойчивому развитию Лунара, Программа восстановления электроники Best Buys.

Ресурсы для печати: Okala: изучение экологического дизайна от Филипа Уайта, Стива Беллетира, Луи Сен-Пьера; Дизайн — это проблема Натана Шедроффа; «От колыбели к колыбели: переделка того, как мы делаем вещи» Уильяма МакДоноу и Майкла Браунгарта; «Естественный капитализм» Пола Хокена, Эмори Ловинс, Л. Хантера Ловинса; Дизайн для реального мира Виктора Папанека; и Зеленый императив Виктора Папанека

Патриархат на демонтаж

Приглашаем на конкурс «Патриархат на демонтаж»

Внимание:

Нью-Йорк, Нью-Джерси и Коннектикут учащиеся средней школы
и студенты колледжей повсюду

Примите участие в конкурсе Dismantle Patriarchy Contest , чтобы узнать, как патриархат влияет на вашу жизнь, ваше сообщество и мир.Как мы можем разобрать — разобрать, разбить на части, разложить — патриархат? Что для этого нужно? Как бы ВЫ это сделали?

Будьте максимально изобретательны!

Молодежь во всем мире призывает к изменению систем, которые продолжают нас подводить. Мы стали свидетелями возрождения превосходства белых, санкционированного государством насилия в отношении меньшинств и протестующих, разрушительных последствий климатической катастрофы и экономического неравенства. Пандемия Covid-19 усугубила последствия этих кризисов и по-прежнему ощущается среди наиболее маргинализованных слоев населения.

Одна из этих систем —

Патриархат [pey-tree-ahr-kee]:

Патриархат — это система власти, при которой мужественность и мужчины отмечены как по своей сути более достойные, чем женственность и женщины. Это ставит мужчин на наверху, предоставляя им больше доступа к власти, ресурсам и даже знаниям. Оно говорит женщины, которых они заслуживают меньше: меньше денег, меньше свободы, меньше силы. И это стирает людей, которые не приписывают традиционные гендерные роли, слишком часто с насилие.

Патриархат приводит к таким вещам, как гендерный разрыв в оплате труда, культура изнасилования и даже изменение климата. В конце концов, патриархат вредит каждому, заставляя людей выбирать между их полной человечностью (которая включает в себя «женские» качества, такие как сочувствие и «мужские» качества, такие как напористость), и доступом к множеству привилегий.

Патриархат по-прежнему является доминирующим способом организации нашей культуры. Пришло время ликвидировать несправедливость, лежащую в основе системы.

Подумайте о том, как концепция пола и гендерных ролей влияет на нашу жизнь.Как они влияют на вас и ваших сверстников, вашу семью? Что патриархат значит для молодежи сегодня? Как патриархат влияет на трансгендеров и тех, кто придерживается изменчивой идентичности и подвержен гендерному насилию? Если вы смотрите на гендер иначе, чем вас учили видеть раньше, как, по вашему мнению, изменится ваше мировоззрение? Что это значит для будущего и нашего мира? Кому уделяется приоритетное внимание патриархат? Каким будет непатриархальный мир для традиционно маргинализированных и исключенных людей?

Сообщите нам.Как бы вы Патриархат развалили?

Принесите свой творческий голос на этот конкурс! Скажите, в каком творческом приеме отражается ваш проект, и вы можете получить награду за свою идею. Материалы могут быть в форма эссе, стихи, музыка, искусство, фотография, фильм и т. д.

Эксперимент. Мыслите нестандартно.
Разрушьте патриархат и покажите нам, как выглядит постпатриархальный мир.
Сформулируйте свое видение, используя все творческие инструменты, имеющиеся в вашем распоряжении.

О конкурсе Часто задаваемые вопросы Форма заявки

Как разобрать и избавиться от каркаса кровати

Если вам интересно, как проще всего разобрать и утилизировать каркас кровати, вы попали в нужное место.

В этой статье мы расскажем, как разобрать каркас кровати перед утилизацией, от снятия матраса до отсоединения поручней кровати. Мы также включаем шаги для разборки двухъярусной кровати или регулируемого каркаса кровати.

🛏️ Нужна помощь, чтобы избавиться от каркаса кровати? Наши услуги по демонтажу каркаса кровати позволяют легко и по доступной цене утилизировать каркас кровати с соблюдением всех требований — от приема до перевозки.

Разборка и утилизация каркаса кровати

Когда пришло время избавиться от старого каркаса кровати, первым делом нужно разобрать его. Разобрать каркас кровати довольно легко, для этого потребуется всего нескольких инструментов и около 30 минут вашего времени.

Экономьте время.Получите расчет стоимости демонтажа каркаса кровати БЕСПЛАТНАЯ ЦЕНА ❯

Как разобрать каркас кровати

Разборка рамы может выполняться одним человеком, но перемещать матрас и пружины коробки намного проще, если у вас есть напарник, который вам поможет.

Итак, , возьмите ваши инструменты и друга , и приступим!

Возьмите свои инструменты

Если у вас все еще есть инструменты, которые идут в комплекте с каркасом кровати, отлично! Если нет, то нет проблем. Для разборки вам понадобится всего несколько инструментов, в том числе:

• Плоскогубцы
• Отвертка
• Разводной ключ
• Шестигранный ключ или шестигранный ключ
• Резиновый молоток или небольшой молоток

Если вы решили повесить на каркас кровати , обязательно храните винты в пластиковом пакете и маркируйте все (малярная или малярная лента и Sharpie отлично подходят), когда будете разбирать его. Это упростит отслеживание на складе или во время переезда.

Move Матрас и пружинный блок

А теперь пора схватить друга и сдвинуть пружины и матрас с кровати. Прислоните каждую часть кровати к стене или где-нибудь в стороне, чтобы вы могли безопасно работать над разборкой каркаса кровати. Если ваша кровать не имеет коробчатых пружин , вы можете перейти к следующему шагу по снятию планок или платформы после снятия матраса.

Хотите отказаться от старого матраса ?? ПОДРОБНЕЕ ❯

Снимите планки или платформу

Если для вашей кровати не требуется пружинный короб, то ваш матрас, вероятно, стоит на платформе или на нескольких планках. При снятии планок или платформы откроются направляющие кровати и каркас под ними.

Удаление ламелей. Соединенные вместе планки можно легко свернуть и отложить. Рейки можно прикрепить к каркасу кровати с помощью липучки или шурупов.В зависимости от типа планок, которые используются в вашей кровати, вам, возможно, придется откручивать их от каркаса кровати, прежде чем снимать их.

Удаление платформы. Если ваша кровать опирается на платформу, не забудьте отвинтить ее от каркаса кровати, прежде чем пытаться ее снять. Для этого шага может потребоваться отвертка или шестигранный ключ, в зависимости от оборудования вашего каркаса кровати.

Разберите каркас кровати

Теперь, когда вы обнажили каркас под планками или платформой на кровати, пора снять изголовье и изножье.Во-первых, взгляните на крепления , которые удерживают поручни вашей кровати на изголовье и изножье. Это винты? Болты? Или вы видите прорези, в которых изголовье и подножка крепятся к рельсам?

Если вы видите прорези в месте соединения изголовья и изножья, то для этого шага может пригодиться молоток. Используйте молоток, чтобы выбить поручень вверх, а затем оттяните поручень от подножки или изголовья. В противном случае возьмите подходящий инструмент, чтобы удалить оборудование, и начинайте отсоединять каждую часть по одной.

Щелкните, чтобы перейти к инструкциям по разборке регулируемого каркаса кровати или двухъярусной кровати.

Снять изголовье и изножье

Поскольку изголовье обычно больше и тяжелее, начнем с подножки. После того, как вы отсоединили подножку от боковых направляющих, снимите ее с каркаса кровати и поместите где-нибудь в стороне. Теперь переходим к изголовью. Отсоедините его так же, как вы отсоединили подножку, и отодвиньте в сторону.

Разберите боковые направляющие

В зависимости от типа кровати, отсоединение изголовья и подножки от направляющих могло быть вашим последним шагом. Однако, если ваши направляющие складываются или соединяются с каким-либо другим способом, возьмите инструмент (-ы) и завершите процесс, удалив остальные винты или болты, чтобы завершил отсоединение направляющих .

Пружины коробки передач больше не «пружинящие»? ПОЛУЧИТЬ ЦЕНУ ❯

Как разобрать регулируемый каркас кровати

Если у вас все еще есть инструкции производителя, следование их инструкциям по разборке будет наиболее эффективным способом разобрать регулируемый каркас кровати. Если у вас больше нет бумажного руководства, вы можете найти в Интернете инструкции для конкретной кровати.

🔌 Отключите шнур питания. Перед тем, как разбирать регулируемое основание, отключите шнур питания и заверните его, чтобы он не запутался во время разборки.

Отсоединение матраса от регулируемого основания

Если матрас прикреплен к регулируемому основанию, его должно крепить несколько болтов. Большинство регулируемых оснований соединяются болтами с шестигранной головкой 7/16 ″, которые можно ослабить с помощью торцевого ключа на 7/16 ″.В зависимости от типа регулируемой кровати может потребоваться другой инструмент. Обратитесь к руководству пользователя для получения более подробных инструкций, включая инструменты, необходимые для разборки.

Отсоедините ножки

Если ножки каркаса кровати затрудняют или делают невозможным перемещение ее из комнаты, прочитайте, как отсоединить их от регулируемого основания.

Если ножки на каркасе кровати короткие и снять их не составит труда, не беспокойтесь об их отсоединении. Каркас вашей кровати теперь готов к подъему и вывозу одним из наших профессиональных погрузчиков.

Отсоединение ножек

1. Освободите ножки изнутри возле изголовья, повернув их против часовой стрелки.
2. Продолжайте поворачивать, пока нога не будет полностью удалена.
3. При необходимости повторите.

Как разобрать двухъярусные кровати

Перед тем, как разобрать каркас кровати, необходимо разобрать двухъярусную кровать.После отключения вам нужно будет выполнить инструкции по разборке каждой кровати.

1. Обратитесь к руководству пользователя, чтобы узнать, можно ли безопасно отсоединить двухъярусные кровати.
2. Снимите матрас, чтобы открыть ламели.
3. Снимите лестницу и предохранительный поручень. Отложите в сторону.
4. Снимите планки или платформу. Отложите в сторону.
5. Возьмите друга и снимите верхнюю кровать с нижней.
6. Отодвиньте верхнюю кровать от нижней и осторожно установите ее.
7. Выполните указанные выше действия, чтобы разобрать каркас кровати.

Наилучший способ утилизации каркаса кровати

Никогда не было так просто избавиться от старого каркаса кровати с помощью быстрых и доступных услуг по удалению каркаса от LoadUp. Наши надежные бригады из полностью застрахованных, проверенных на наличие данных Погрузчики войдут в ваш дом и быстро унесут старую раму, боковые поручни, изголовье и подножку уже на следующий день.

Мы также предлагаем пружинные блоки и услуги по утилизации матрасов, которые можно добавить к вашему заказу на вывоз мусора, когда вы заказываете услугу у нас онлайн или по телефону! (Единственные виды матрасов и пружинных коробок, которые мы не принимаем, , — это матрасы, у которых активных заражения постельными клопами или сильное переувлажнение .)

Дополнительные элементы стоят всего около 10–15 долларов за штуку, и вы можете получить гарантированное предварительное предложение без необходимости оценки на месте. В LoadUp мы не взимаем плату за объемы, что позволяет нам поддерживать наши цены на 20–30% ниже, чем у большинства других компаний по удалению мусора.

Разборка старого каркаса кровати — отличный способ сэкономить немного времени перед назначением на уборку дома. Однако, если вам нужна дополнительная помощь с каркасом кровати, мы вас позаботимся! LoadUp предлагает решение с полным спектром услуг для каждого .Просто позвоните нам, и мы поможем подобрать для вас подходящий вариант утилизации.

Статьи по теме из блога Trash Talk:

Связь

NTR-опосредованной разборки сплайсосомы с DEAH-бокс-АТФазами Prp2, Prp16 и Prp22

ВВЕДЕНИЕ

Интроны удаляются из мРНК-предшественников (пре-мРНК) с помощью двух реакций переэтерификации. Реакции происходят на большом рибонуклеопротеиновом комплексе, называемом сплайсосомой, который состоит из пяти малых ядерных РНК (мяРНК) и многочисленных белковых факторов.Эти факторы связываются с пре-мРНК последовательным образом, чтобы собрать сплайсосомы в функциональный комплекс для катализа (для обзоров см. Ссылки 1-4). После завершения реакции сплайсинга зрелое сообщение выпускается, и сплайсосома разбирается для повторного использования ее компонентов.

Обширная структурная перестройка сплайсосомы, включая обмен спариванием оснований РНК и белковыми компонентами (1, 2, 4–9), связана с каждым этапом процесса сборки сплайсосомы.DEXD / H-box РНК-геликазы, как предполагается, опосредуют структурные изменения сплайсосомы на отдельных стадиях (10-15). В почкующихся дрожжах Saccharomyces cerevisiae для сплайсинга требуется восемь белков DEXD / H-box. Prp5 и Sub2 участвуют в ранних стадиях сборки сплайсосом, чтобы облегчить образование пресплицеосом (16-18). Prp28 и Brr2 необходимы для высвобождения U1 и U4, соответственно, для активации сплайсосомы (11, 15). Prp2 и Prp16 необходимы для каталитических стадий, и их активности связаны с высвобождением компонентов U2 SF3a и SF3b (SF3a / b) и факторов первой стадии Yju2 и Cwc25, соответственно (19-24).После завершения сплайсинга Prp22 необходим для высвобождения зрелой мРНК и Prp43 для разборки сплайсосом с целью рециклирования сплайсосомных компонентов (25-28). Хотя было показано, что некоторые из этих белков раскручивают дуплекс РНК in vitro , ни один из них не проявляет субстратной специфичности. Тем не менее, белки DEXD / H-box регулируются для функционирования на точных стадиях пути сплайсинга. Было показано, что активность Brr2 по раскручиванию РНК стимулируется карбоксиконцевым фрагментом Prp8 (29), тогда как Prp43 активируется аминоконцевым фрагментом Ntr1, содержащим домен G-patch (30), что позволяет предположить, что функция белков DEXD / H-box может регулироваться ассоциированными факторами сплайсинга.Компонент U5 Snu114, как было показано, служит сигнально-зависимым переключателем для регуляции динамики сплайсосом посредством регуляции активности Brr2 (32). Посттрансляционная модификация др. Факторов сплайсинга или самих белков DEXD / H-box также участвует в регуляции функции этих геликаз во время сборки сплайсосом (31, 33–35).

Ранее было показано, что белковый комплекс, названный NTR, опосредует разборку сплайсосомы после высвобождения зрелой мРНК (36). NTR, который содержит Ntr1 (также называемый Spp382), Ntr2 и DEAH-box РНК-геликазу Prp43, взаимодействует с U5 snRNP динамическим образом посредством взаимодействия Ntr2 и компонента U5 Brr2. Такие взаимодействия могут опосредовать рекрутирование NTR в сплайсосому с помощью мяРНП U5 (37). Поскольку U5 связан со сплайсосомой на ранней стадии пути сборки, рекрутирование NTR с помощью U5 может происходить раньше, чем завершится реакция. В поддержку этого мнения недавно было показано, что Prp43 необходим для разборки выброшенных промежуточных продуктов сплайсосом (38, 39).Тем не менее, NTR обычно не функционирует до тех пор, пока зрелое сообщение не высвобождается из сплайсосомы после завершения сплайсинга, предполагая, что взаимодействие NTR с U5 регулируется во времени.

Мы исследовали, как NTR может опосредовать разборку промежуточных продуктов сплайсосомы и как предотвращается разборка при нормальных условиях сплайсинга. Мы обнаружили, что NTR может специфически катализировать разборку сплайсосомы, задерживаемой на этапах после действия DEAH-бокс-РНК-геликазы Prp2, Prp16 или Prp22, но не на этапах до действия этих белков или после их связывания. Известно, что действие Prp2, Prp16 и Prp22 связано с высвобождением SF3a / b, Yju2 / Cwc25 и Prp22 / Prp18 / Slu7 соответственно (21, 23, 24, 46). Поскольку эти факторы связываются с каталитическим центром сплайсосомы, рядом с сайтом разветвления или сайтом 3′-сплайсинга, на каждой конкретной стадии, восприимчивость сплайсосомы к разборке может потребовать удаления этих факторов из каталитического центра. Анализ связывания Ntr2 показал, что сплайсинговые комплексы проявляют дифференциальную аффинность связывания с Ntr2, как правило, в соответствии с их восприимчивостью к разборке, но не все комплексы, которые хорошо связывают Ntr2, являются чувствительными.Наши результаты демонстрируют, что NTR может быть задействован в сплайсосоме только на определенных стадиях, и только когда определенные компоненты, которые связываются с каталитическим центром, удалены, сплайсосома становится восприимчивой к разборке. Кроме того, связывание Ntr2 со сплайсосомными промежуточными продуктами конкурентно ингибируется присутствием Prp16 и Slu7. Таким образом, наши результаты обеспечивают механизм предотвращения разборки промежуточных продуктов сплайсосомы в нормальных условиях.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы дрожжей.В качестве штаммов дрожжей использовались BJ2168 ( mat a prc1 prb1 pep4 leu2 trp1 ura3 ), YSCC5 ( mat a prc1 prb1 pep4 leu2 trp1 ura3 YCJU2 trp1-ura3 ) a prc1 prb1 pep4 leu2 trp1 ura3 dbr1 :: LEU2 ), YSCC16 ( мат a prc1 prb1 pep4 leu2 trp1 ura3 URA3 :: GAL.PR :: GAL.PR a prc1 prb1 pep4 leu2 trp1 ura3 SLU7-V5 ), SS304 ( mat a ura3 trp1 his3 ade2 prp2-1 ) и prp22 ( mat adera

trp 1 ).

Антитела и реагенты. Антитело против V5 было приобретено у Serotec Inc. Антитело против гемагглютинина (HA) получали путем иммунизации мышей пептидом HA, конъюгированным с гемоцианином лимфы улитки (KLH) (неопубликованные данные). Поликлональные антитела анти-Prp16, анти-Prp22, анти-Slu7, анти-Ntr2 и анти-Cwc25 получали путем иммунизации кроликов рекомбинантными белками Prp16, Prp22, Slu7, Ntr2 и Cwc25 соответственно. Динуклеотиды 4-тио-UpG и UpG были приобретены у Dharmacon.РНК-полимераза RNasin и SP6 от Promega, нуклеаза P1 от Sigma и РНК-лигаза 1 от New England Biolabs. Аффинная колонка с протеином A-сефарозой и Ni-нитрилотриуксусной кислотой (NTA) была получена от Amersham Biosciences и Qiagen, соответственно. были использованы

Oligonucleotides.The следующие олигонуклеотиды: А1 (CTTCATCACCAACGTAG), А8 (TGTTAGTACATGAGAC), А9 (GCAACAAAAAGAATGAAGCAATCGTACATGAGACTTAGTAACA), S6 (TACGATTTAGGTGACAC), P2-6 (CTTTAAAATTGCTTATATCATTAGCAACAATGAACGCAAAAAA), P2-7 (TTTTTTGCGTTCATTGTTGCTAATGATATAAGCAATTTTAAAG), P16-5 (GATAAATATTCGTGTGTTATTATTGCTGAAGCTCATGAAAGGTCATTAAAT) и P16-6 (ATTTAATGACCTTTCATGAGCTTCAGCAATAATAACACACGAATATTTATC).

Очистка Prp2, prp2-S378L, prp16, prp16-D473A, prp22, prp22-S635A, Ntr2-HA и Slu7-V5. Ген PRP2 , кодирующий белок, помеченный 4 копиями эпитопа V5 на аминогруппе. конец (41) и 2 копии эпитопа НА на карбоксильном конце были клонированы в pET15b. Мутация серина в лейцин в положении 378 была введена посредством сайт-направленного мутагенеза с использованием праймеров P2-6 и P2-7. Как белок дикого типа, так и мутантный рекомбинантный белок prp2-S378L очищали последовательной хроматографией на никелевой аффинной колонке и на гранулах белка A-сефарозы, конъюгированного с антителом против НА.Для очистки Prp2 от дрожжей получали экстракты из штамма, несущего плазмиду pYES-HIS-PRP2 (подарок от R.-J. Lin), и фракционировали хроматографией на никелевой аффинной колонке. Ген PRP16 , кодирующий белок, помеченный 3 копиями НА на карбоксильном конце, был субклонирован в pET28b для экспрессии рекомбинантного белка. Мутация из аспартата в аланин в положение 473 была введена посредством сайт-направленного мутагенеза с использованием праймеров P16-5 и P16-6. И белок дикого типа, и мутантный рекомбинантный белок prp16-D473A очищали, как описано для Prp2. Prp22 и мутантный белок prp22-S635A очищали по методу Ценга и Ченга (42). Ген NTR2 , кодирующий белок, меченный HA на карбоксильном конце, и ген SLU7 , кодирующий белок, меченный V5 на аминоконце, были индивидуально клонированы в плазмиду pSUMO для экспрессии слитых белков SUMO. После очистки хроматографией на никелевой аффинной колонке слитые белки обрабатывали протеазой SUMO для удаления SUMO.

Истощение Cwc25, Slu7, Prp16, Prp22 и NTR. Для иммунного истощения фактора из дрожжевого экстракта 25 мг протеин A-сефарозы набухали в 1 мл буфера NET-2 (50 мМ трис-HCl [pH 7,5] , 150 мМ NaCl, 0,05% NP-40) и конъюгировали со специфическим антителом. Для истощения Cwc25 200 мкл поликлонального антитела против Cwc25 конъюгировали со 100 мкл протеина А-сефарозы и использовали для истощения 200 мкл экстрактов. Для истощения Prp16 использовали 100 мкл поликлонального антитела против Prp16.Для истощения Ntr1 использовали 50 мкл поликлонального антитела против Ntr1. Для истощения Slu7 использовали 100 мкл поликлонального антитела против Slu7. Для совместного завершения Slu7 и Prp22 использовали 100 мкл антитела против Slu7 и 2,6 мкг очищенного антитела против Prp22. Экстракты инкубировали с конъюгированным с антителом протеином A-сефарозой при 4 ° C в течение 1 ч, и супернатанты собирали в виде обедненных экстрактов.

Арест промежуточных продуктов сплайсосомы. Для прекаталитических сплайсосом сплайсинг проводили в инактивированных нагреванием экстрактах мутантов prp2-1 .Для Prp2-ассоциированной сплайсосомы сплайсинг выполняли в инактивированных нагреванием экстрактах мутантов prp2-1 , и реакционная смесь была истощена по АТФ путем инкубации при 25 ° C в течение 5 минут после добавления 10 мМ глюкозы. Затем 100 нг рекомбинантного Prp2 или prp2-S378L дикого типа или 28 нг Prp2, очищенного из дрожжей, добавляли к каждым 10 мкл реакционной смеси. Для сплайсосомы post-Prp2 сплайсинг проводили в экстрактах, истощенных по Yju2, как описано ранее (41). Для сплайсосомы pre-Prp16 сплайсинг проводили в экстрактах, обедненных Prp16. Для сплайсосомы, ассоциированной с Prp16, сплайсинг проводили в экстрактах, обедненных Prp16, и реакционная смесь была истощена по АТФ путем инкубации при 25 ° C в течение 5 мин после добавления 10 мМ глюкозы. Затем 100 нг рекомбинантного Prp16 или prp16-D473A дикого типа или 0,5 мкл дрожжевых экстрактов, сверхэкспрессирующих Prp16, добавляли к каждым 10 мкл реакционной смеси. Чтобы заблокировать Prp22-ассоциированную сплайсосому, содержащую промежуточные продукты сплайсинга, сплайсинг проводили с пре-мРНК ACAC мутантного сайта сплайсинга.Чтобы остановить посткаталитическую сплайсосому, сплайсинг проводили в присутствии от 50 до 200 нг рекомбинантного prp22-S635A на каждые 10 мкл реакционной смеси (42). Чтобы остановить сплайсосому на терминальной стадии, сплайсинг проводили в экстрактах с истощенным NTR с использованием антитела против Ntr1, как описано ранее (36).

Анализы разборки сплайсосом. Анализы разборки сплайсосом выполняли в соответствии с методом Tsai et al. (36) с небольшими изменениями. Реакцию сплайсинга проводили в нормальных условиях с использованием мРНК предшественника актина в качестве субстрата, и сплайсосому выделяли путем осаждения 10 мкл реакционной смеси 1 мкл антитела против Ntc20, конъюгированного с 10 мкл протеина A-сефарозы. .Затем выделенные сплайсосомы инкубировали в условиях сплайсинга при 25 ° C в течение 20 мин с 30 мкл буфера, содержащего 8 мМ HEPES (pH 7,9), 60 мМ KPO ₄ (pH 7,0), 20 мМ NaCl, 0,08 мМ EDTA, 1 мМ спермидин, 3% полиэтиленгликоль (PEG) 8000, 8% глицерин, 2 мМ АТФ и 4 мМ MgCl ₂ , с 5 мкл очищенного NTR или без них. После центрифугирования фракции супернатанта и осадка собирали для анализа РНК. Седиментационный анализ градиентов глицерина проводили, как описано Tsai et al.(36).

Анализы связывания Ntr2. Для анализа связывания Ntr2 проводили реакции сплайсинга, как описано выше, для остановки сплайсосомы на определенных стадиях. Затем к каждым 10 мкл реакционной смеси добавляли 0, 20, 50, 100, 200 или 500 нг рекомбинантного Ntr2-HA. Затем реакционную смесь осаждали 1 мкл антитела против Ntc20 или 80 мкл антитела против НА. Для анализа конкуренции между Ntr2 и Prp16 сплайсинг проводили в экстрактах, обедненных Prp16. Затем к реакционным смесям добавляли предварительно смешанные рекомбинантные prp16-D473A-HA и Ntr2-HA при молярных соотношениях prp16-D473A-HA / Ntr2-HA 0,0.04, 0,1, 0,2 и 0,4, с конечной концентрацией 0,5 мкМ для Ntr2-HA, и смеси подвергали иммунопреципитации с антителом против Ntr2 или против Prp16. Для анализа конкуренции между Ntr2 и Slu7 реакции сплайсинга проводили с пре-мРНК ACAC в экстрактах, иммуно истощенных по Slu7 и метаболически истощенных по Ntr2. Затем к реакционным смесям добавляли предварительно смешанные рекомбинантные Slu7-V5 и Ntr2-HA при молярных соотношениях Slu7-V5 / Ntr2-HA 0, 0,04, 0,1, 0,2 и 0,4 с конечной концентрацией 1 мкМ для Ntr2-HA, и смеси подвергали иммунопреципитации антителами против Ntr2 или против V5.После иммунопреципитации РНК экстрагировали из каждого продукта реакции, анализировали гель-электрофорезом и количественно определяли с использованием фосфорного сканера.

РЕЗУЛЬТАТЫ

NTR опосредует разборку промежуточных продуктов сплайсосомы. В нормальных условиях сплайсинга NTR опосредует разборку сплайсосом после высвобождения зрелой мРНК. Сначала мы спросили, можно ли разобрать сплайсосому перед высвобождением мРНК с помощью экстрактов, полученных из мутанта prp22-1 . Prp22 необходим как для высвобождения мРНК из сплайсосомы после завершения сплайсинга, так и для второй каталитической реакции (26, 40).Чтобы выделить сплайсосомы для анализа разборки, мы использовали антитела против Ntc20 для осаждения сплайсосомы, поскольку Ntc20 стабильно связывается со сплайсосомой на различных стадиях и остается связанным со сплайсосомой до завершения реакции (43). Осажденные сплайсосомы затем инкубировали с NTR в присутствии АТФ, чтобы определить, высвобождались ли субстратные РНК из гранул (36). Схема процедуры анализа показана на рис. 1А. Результаты контрольных экспериментов с использованием антитела против Ntr1 для истощения NTR показаны для анализа разборки в присутствии (рис. 1B, дорожки 5 и 6) или отсутствие (дорожки 3 и 4) NTR (36). Иммунопреципитация антителом против Ntc20 показала, что сплайсинг инактивированных нагреванием экстрактов prp22-1 приводит к накоплению продуктов сплайсинга, а также большего количества промежуточных продуктов сплайсинга на сплайсосоме (рис. 1B, дорожка 8), что позволяет предположить, что обе мРНК высвобождают и реакции сплайсинга были затронуты в мутантном экстракте prp22-1 . Когда NTR был добавлен к осажденной сплайсосоме для анализа на разборку, в супернатанте было обнаружено от 40 до 60% всех видов РНК (рис.1B, дорожки 11 и 12). Меньшие количества РНК были обнаружены в супернатанте после инкубации в отсутствие NTR (дорожки 9 и 10). Диссоциированные материалы анализировали седиментацией на градиентах глицерина от 10 до 30% (фиг. 1C), а содержание РНК в каждой градиентной фракции дополнительно анализировали с помощью гель-электрофореза (фиг. 1D). В то время как РНК, которая отделилась от гранул после инкубации в отсутствие NTR (рис. 1D, в центре), состояла в основном из интактных сплайсосом (фракции 5-9), большая часть РНК, которая диссоциировала в присутствии NTR (рис.1D, вверху), совмещенная с РНК, экстрагированной из реакционной смеси сплайсинга (фиг. 1D, внизу), в верхней части градиента (фракции с 12 по 15), что указывает на то, что РНК была диссоциирована из-за разборки сплайсосом (36). Эти результаты подтверждают, что NTR может также обеспечивать разборку сплайсосомы, содержащей пре-мРНК или промежуточные соединения сплайсинга, и они поднимают вопрос, может ли NTR связываться со сплайсосомой на нескольких стадиях, если сборка сплайсосомы замедлена. Чтобы определить, все ли сплайсинговые комплексы промежуточных продуктов сборки восприимчивы к NTR-опосредованной разборке, мы заблокировали сборку сплайсосом на разных стадиях и выделили различные сплайсинговые комплексы путем иммунопреципитации с антителом против Ntc20 для анализов разборки.

Рис. 1

Разборка сплайсосомы, образованной в экстрактах мутанта prp22-1 . (A) Схема, показывающая процедуру анализа разборки. (B) Сплайсосомы, образованные в экстрактах, истощенных по NTR (дорожки 1-6) или инактивированных нагреванием мутанта prp22-1 (дорожки 7–12), осаждали антителом против Ntc20 (дорожки 2 и 8), и гранулы инкубировали в присутствии (дорожки 5, 6, 11 и 12) или в отсутствие (дорожки 3, 4, 9 и 10) NTR. (C) После инкубации фракции супернатанта от инактивированных нагреванием экстрактов мутантов prp22-1 (соответствующие панели B, дорожки 10 и 12), а также общая РНК, выделенная из реакционной смеси сплайсинга, фракционировали с 10 по 10. -30% градиент глицерина.(D) РНК экстрагировали из каждой градиентной фракции и анализировали на денатурирующих полиакриламидных гелях. IP, иммунопреципитация; dNTR, экстракты с низким содержанием NTR; Δprp22, инактивированные нагреванием экстракты мутантов prp22-1 ; R — реакция; Т — общее количество осадков; П — гранула; S, супернатант.

Помимо ингибирования высвобождения мРНК, у мутанта prp22-1 обнаружен общий дефект сплайсинга, о чем свидетельствует сопутствующее накопление более высокого уровня промежуточных продуктов сплайсинга. Чтобы специфически блокировать высвобождение мРНК, не влияя на другие стадии сплайсинга, мы использовали доминантно-отрицательный мутант Prp22, prp22-S635A.Мутант S635A не обладает активностью раскручивания РНК и не может катализировать высвобождение мРНК, но является функциональным для второй каталитической стадии и остается стабильно связанным со сплайсосомой (44). Сплайсинг в присутствии рекомбинантного белка prp22-S635A приводил к накоплению большого количества интрона лариат (рис. 2A, дорожка 3), и образовавшаяся сплайсосома была устойчивой к разборке при инкубации с NTR (рис. 2B, дорожки 9–10). 12). Этот результат предполагает, что либо диссоциация мРНК является предпосылкой чувствительности сплайсосомы к NTR, либо присутствие белка Prp22 предотвращает ассоциацию NTR.Принимая во внимание, что мРНК-содержащая сплайсосома, образованная в инактивированных нагреванием экстрактах мутанта prp22-1 , была восприимчива к разборке, маловероятно, что ассоциация мРНК препятствовала разборке.

Рис. 2

Связывание Prp22 и Slu7 предотвращает разборку сплайсосомы. (A) Сплайсинг в присутствии рекомбинантного Prp22 (дорожка 2) или prp22-S635A (дорожка 3). (B) Сплайсосомы, образованные в экстрактах с истощенным NTR (дорожки с 1 по 6) или в присутствии prp22-S635A (дорожки с 7 по 12), выделяли путем преципитации антителом против Ntc20 для анализов разборки, выполняемых путем инкубации в присутствии (дорожки 5, 6, 11 и 12) или отсутствие (дорожки 3, 4, 9 и 10) NTR.(C) Сплайсосомы, сформированные в экстрактах с ложным истощением (дорожки с 1 по 7) или экстрактами с Prp22 и Slu7 (дорожки с 8 по 14) с использованием пре-мРНК ACAC, выделяли путем преципитации антителом против Ntc20 для анализов разборки, выполняемых с помощью инкубация в присутствии (дорожки 6, 7, 13 и 14) или в отсутствие (дорожки 4, 5, 11 и 12) NTR. Реакционные смеси также осаждали антителом против Prp22, чтобы выявить присутствие (дорожка 2) или отсутствие (дорожка 9) Prp22. R — реакция; Т — общее количество осадков; П — гранула; S — супернатант; α-22, антитело против Prp22; α-Ntc20, антитело против Ntc20. (D) Иммуноблоттинг экстрактов, лишенных Slu7 (дорожка 2), Prp22 (дорожка 3) или обоих Prp22 и Slu7 (дорожка 4). (E) Реакцию сплайсинга проводили в псевдо-обработанных экстрактах, истощенных по Prp22 / Slu7 или Prp22 / Slu7 / NTR- dbr1 Δ, с пре-мРНК ACAC, и реакционные смеси фракционировали по 10-к- 30% градиент глицерина. РНК выделяли из градиентных фракций и анализировали в гелях 8% полиакриламид – 8 М мочевина. Т, общая реакционная смесь.

Связывание Prp22 и Slu7 предотвращало NTR-опосредованную разборку сплайсосом.Чтобы определить, будет ли присутствие Prp22 ингибировать NTR-опосредованную разборку сплайсосом, для реакции сплайсинга использовали мутантную пре-мРНК ACAC по 3′-сайту сплайсинга (45). Сплайсосома, образованная пре-мРНК ACAC, накапливает промежуточные продукты сплайсинга, при этом Prp22 остается на сплайсосоме (42). Инкубация аффинно очищенной сплайсосомы с NTR привела к разборке очень небольшого количества сплайсосомы, содержащей промежуточные продукты сплайсинга (фиг. 2C, дорожки с 3 по 7). Затем мы исчерпали экстракт Prp22, чтобы определить, можно ли повысить эффективность разборки.Поскольку для стабильной ассоциации Prp22 со сплайсосомой требуется Slu7 (46), Slu7 был дополнен, чтобы минимизировать связывание остаточного Prp22. Иммуноблот экстрактов, лишенных одного или обоих белков, показан на рис. 2D. Около 30% сплайсосом, образованных в экстракте, дополненном Prp22 и Slu7, было разобрано (фиг. 2C, дорожки с 10 по 14), что указывает на то, что присутствие Prp22 и Slu7 на сплайсосоме действительно предотвращало NTR-опосредованную разборку сплайсосомы. В отсутствие Prp22 и Slu7 сплайсосома чувствительна к NTR даже до завершения реакции сплайсинга.

Примечательно, что количество сплайсосом, осажденных антителом против Ntc20 из экстрактов, истощенных по Prp22 и Slu7, было постоянно намного ниже, чем из экстрактов, подвергнутых ложной обработке (фиг. 2C, сравните дорожки 3 и 10). Мы предположили, что часть сплайсосомы могла быть разобрана во время реакции сплайсинга до иммунопреципитации. Следовательно, мы выполнили седиментационный анализ, чтобы определить, присутствовали ли высвободившиеся промежуточные соединения сплайсинга в реакционной смеси.Чтобы предотвратить деградацию высвобожденного интермедиата лариата, для этого эксперимента мы использовали экстракты, полученные из дефицитного по дебранхазе ( dbr1 Δ) штамма. Реакции сплайсинга проводили с пре-мРНК ACAC в экстрактах dbr1 Δ, и реакционные смеси подвергали седиментации в градиенте глицерина (фиг. 2E). В экстрактах, подвергнутых ложной обработке, большая часть субстратной РНК была связана со сплайсосомой во фракциях 5 и 6 с небольшим пиком в более легких фракциях 11 и 12.Более светлый пик увеличивался с уменьшением пика сплайсосомы, когда экстракт был истощен по Prp22 и Slu7, но не увеличивался значительно, когда также истощался NTR, чтобы предотвратить разборку, предполагая, что более светлый пик был продуктом разобранной сплайсосомы. Это было подтверждено РНК-анализом градиентных фракций с помощью гель-электрофореза, который показал, что фракции 11 и 12 содержали пре-мРНК и промежуточное соединение лариата, тогда как фракции 13 и 14 содержали вырезанный экзон 1. Эти результаты показывают, что сплайсосома ACAC более восприимчива к разборке в отсутствие Prp22 и Slu7.

Связь Prp2 и Prp16 с разборкой сплайсосомы. Чувствительность сплайсосомы ACAC к разборке подтвердила, что промежуточные соединения сплайсосомы могут подвергаться разборке. Затем мы систематически анализировали различные промежуточные соединения сплайсосом, чтобы увидеть, все ли комплексы или только определенные комплексы восприимчивы к NTR-опосредованной разборке. Каждая каталитическая стадия реакции сплайсинга включает в себя АТФ-зависимое структурное изменение сплайсосомы, которое требует ДЭАГ-бокс-РНК-геликаз Prp2 и Prp16 соответственно, и АТФ-независимую каталитическую реакцию, для которой требуются несколько других белков (19, 20, 41). , 46–48).Сначала мы спросили, подвержена ли сплайсосома разборке при аресте до действия Prp16. Сплайсосома, образованная в экстрактах, лишенных Prp16, накапливала промежуточные соединения сплайсинга (фиг. 3A, дорожка 1), которые можно было выделить путем преципитации антителом против Ntc20 (дорожка 2). Инкубация сплайсосомы с NTR существенно не способствовала разборке (фиг. 3A, дорожки 2–6), предполагая, что сплайсосома, которая была арестована перед стадией Prp16, не была восприимчивой к разборке.Затем мы проверили, подвержена ли сплайсосома разборке после связывания Prp16. Мутант АТФазы Prp16, prp16-D473A, который может связываться со сплайсосомой, но не может диссоциировать от нее, был использован для образования Prp16-ассоциированной сплайсосомы (49) (см. Рис. S1A в дополнительном материале). Реакции сплайсинга проводили в экстрактах, обедненных Prp16, и реакционные смеси истощали АТФ путем инкубации в присутствии глюкозы перед добавлением Prp16. Затем сплайсосомы осаждали антителом против Ntc20 для анализов разборки.В этих условиях Prp16 удерживался на сплайсосоме. Однако после инкубации с NTR и ATP для анализов разборки Prp16 может гидролизовать ATP, чтобы способствовать структурным изменениям сплайсосомы и может высвобождаться из сплайсосомы (см. Рис. S1B в дополнительном материале) вместе с Yju2 и Cwc25. Напротив, мутантный белок D473A будет удерживаться на сплайсосоме (см. Рис. S1C в дополнительном материале). Эти результаты показывают, что, хотя присутствие мутантного белка prp16-D473A предотвращало разборку сплайсосомы (рис.3A, дорожки 12–16), Prp16 дикого типа способствовал структурному изменению сплайсосомы в форму, восприимчивую к NTR-опосредованной разборке (дорожки 7–11). Результирующая структура сплайсосомы post-Prp16, по-видимому, подобна структуре, образованной в экстрактах с кодированием Prp22 и Slu7 (см. Схему на фиг. 5A).

Рис. 3

Разборка сплайсосом, образованных после действия Prp16 и Prp2. (A) Реакцию сплайсинга проводили в экстрактах, обедненных Prp16. После истощения АТФ в реакционную смесь не добавляли ни Prp16 (дорожки с 1 по 6), ни Prp16 дикого типа (дорожки с 7 по 11), ни prp16-D473A (дорожки с 12 по 16), ни сплайсосому выделяли с помощью преципитация антителом против Ntc20 для анализов разборки, выполняемая путем инкубации в присутствии (дорожки 5, 6, 10, 11, 15 и 16) или в отсутствие (дорожки 3, 4, 8, 9, 13 и 14) NTR. (B) Реакцию сплайсинга проводили в инактивированных нагреванием экстрактах мутантов prp2-1 . После истощения АТФ в реакционную смесь не добавляли Prp2 (дорожки с 1 по 6), Prp2 дикого типа (дорожки с 7 по 11) или prp2-S378L (дорожки с 12 по 16), и сплайсосомы выделяли для анализы разборки, как описано для панели A. R, реакция; Т — общее количество осадков; П — гранула; S, супернатант.

Чтобы определить, являются ли прекаталитические сплайсосомы также чувствительными к NTR, мы сформировали сплайсосомы в термоинактивированных экстрактах мутантов prp2-1 и осаждали сплайсосомы антителом против Ntc20 (рис.3Б, дорожка 2). Сплайсосома, которая образовалась до действия Prp2, не разбиралась при инкубации с NTR (фиг. 3B, дорожки 2-6). Затем мы проверили, была ли прекаталитическая сплайсосома, которая была сформирована с Prp2, связанным или после действия Prp2, восприимчивой к разборке, выполнив эксперимент, аналогичный описанному выше для рис. 3A. Сплайсинг проводили в инактивированных нагреванием экстрактах prp2-1 , и реакционные смеси были истощены по АТФ перед добавлением рекомбинантного Prp2, чтобы обеспечить связывание Prp2. Когда сплайсосомы, осажденные антителом против Ntc20, инкубировали с NTR, приблизительно. 40% сплайсосомы было разобрано (фиг. 3B, дорожки с 7 по 11), предположительно из-за предшествующего структурного изменения сплайсосомы, катализируемого Prp2 в присутствии АТФ. Этот результат предполагает, что сплайсосома трансформируется в состояние, которое подвержено разборке после действия Prp2. Доминантно-негативный мутантный белок prp2-S378L, несущий мутацию в мотиве геликазы, может связываться со сплайсосомой, но не может диссоциировать от нее (50).При использовании prp2-S378L сплайсосома была устойчива к разборке (фиг. 3B, дорожки с 12 по 16), что указывает на то, что сплайсосома, связанная с Prp2, не восприимчива к разборке, но действие Prp2 необходимо для того, чтобы сделать сплайсосому чувствительной.

Взятые вместе, наши результаты демонстрируют, что комплекс NTR может катализировать разборку сплайсосомы, арестованной специфически после действия Prp2 или Prp16, но не на этапах до их действия или после их связывания со сплайсосомой. Чтобы исключить возможность того, что присутствие субстратных РНК во фракциях супернатанта в анализе разборки было связано с неспецифической диссоциацией сплайсосомы от гранул во время инкубации, мы показали, что высвобождение субстратных РНК зависит от функционального Prp43 с использованием комплекса NTR, восстановленного с Prp43-ATPase мутантный prp43-T123A (27, 37), который не способствует высвобождению субстратной РНК из шариков (см. Рис. S2 в дополнительном материале). Мы дополнительно проанализировали фракцию супернатанта от сплайсосомы post-Prp16 на градиентах глицерина, чтобы выявить, что высвобожденные РНК осаждались в виде голых РНК, что свидетельствует о разобранной сплайсосоме (см.рис.S3 в дополнительном материале).

Удаление Cwc25 необходимо для разборки прекаталитической сплайсосомы. Интересно, что NTR обеспечивает разборку сплайсосом только после действия белков DEAH-бокса. Недавно было показано, что функции Prp2 и Prp16 связаны с высвобождением SF3a / b и Yju2 / Cwc25 соответственно (21, 23, 24). Как SF3b, так и Cwc25 участвуют в связывании со сплайсосомой в каталитическом центре. SF3b связывается непосредственно с сайтом ветвления на ранних этапах сборки сплайсосомы и высвобождается под действием Prp2 (21, 24).Cwc25 связывается со сплайсосомой после высвобождения SF3a / b, чтобы способствовать первой каталитической реакции, а затем высвобождается из сплайсосомы под действием Prp16 (23, 47). Связывание Cwc25 со сплайсосомой ингибируется мутациями в точке ветвления, что позволяет предположить, что Cwc25 может связываться с пре-мРНК вблизи сайта ветвления (23). Это подтверждается сайт-специфическим фото-перекрестным связыванием Cwc25 с пре-мРНК, несущей единственный 4-тиоуридиновый (4sU) остаток на 3 основания ниже точки ветвления (см.рис.S4 в дополнительном материале). В этом контексте сплайсосома может быть подвержена разборке только тогда, когда удаляются специфические факторы, связывающиеся с каталитическим центром. Мы проверили, подвержена ли сплайсосома, собранная в экстрактах, обедненных Cwc25, разборке. Cwc25 рекрутируется в сплайсосомы непосредственно перед первой каталитической реакцией. Сплайсосомы, образованные в экстрактах, обедненных Cwc25, содержат все другие факторы, необходимые для ускорения реакции, и их можно использовать для получения промежуточных продуктов сплайсинга при добавлении рекомбинантного Cwc25 (47).Когда NTR был добавлен к сплайсосоме, выделенной преципитацией антителом против Ntc20, почти половина прекаталитической сплайсосомы отделилась от гранул (фиг. 4A, дорожки 5 и 6). Сплайсосома, образованная в экстрактах, обедненных Cwc25, находится на стадии пост-Prp2, на которой SF3b был удален из сайта разветвления. Чтобы исключить возможность того, что часть сплайсосомы, восприимчивая к разборке, представляет собой то, что без связанного Yju2, мы специально выделили Yju2-содержащую сплайсосому для анализов разборки.Сплайсосомы, образованные в экстрактах Yju2-V5, обедненных Cwc25, осаждали антителом против V5 и инкубировали с NTR для изучения разборки (фиг. 4B). Более половины сплайсосомы диссоциировали от гранул (фиг. 4B, дорожки 5 и 6), указывая тем самым, что ассоциация Yju2 не предотвращает разборку. Вместе эти результаты подтверждают, что разборка прекаталитических сплайсосом требует только предотвращения связывания Cwc25.

Рис. 4

NTR может разбирать сплайсосому в отсутствие Cwc25.(A) Реакцию сплайсинга проводили в экстрактах, обедненных Cwc25, и сплайсосомы выделяли для анализов разборки путем осаждения реакционной смеси (дорожка 1) антителом против Ntc20 (дорожка 2) с последующей инкубацией в присутствии (полосы 5 и 6) или отсутствие (дорожки 3 и 4) NTR. (B) Реакцию сплайсинга проводили в экстрактах Yju2-V5, обедненных Cwc25, и сплайсосомы выделяли для анализа разборки путем осаждения реакционной смеси (дорожка 1) антителом против V5 (дорожка 2) с последующей инкубацией. в присутствии (дорожки 5 и 6) или отсутствии (дорожки 3 и 4) NTR.(C) Реакцию сплайсинга проводили с пре-мРНК brC, и сплайсосомы выделяли для анализов разборки путем осаждения реакционной смеси (дорожка 1) антителом против Ntc20 (дорожка 2) с последующей инкубацией в присутствии (полосы 5 и 6) или отсутствие (дорожки 3 и 4) NTR. R — реакция; Т — общее количество осадков; П — гранула; S, супернатант.

Ранее мы показали, что на стабильную ассоциацию Cwc25 со сплайсосомой в значительной степени влияют мутации в последовательности точки ветвления, и что в отсутствие гидролиза АТФ связывание Prp16 стабилизирует ассоциацию Cwc25, чтобы способствовать реакции (23).В присутствии АТФ Prp16 способствует диссоциации Cwc25 от сплайсосомы, чтобы предотвратить сплайсинг при гидролизе АТФ. Вероятно, сплайсосома, собранная на пре-мРНК мутантной точки ветвления, особенно в отсутствие Prp16, чувствительна к разборке из-за плохого связывания Cwc25. Действительно, когда сплайсосома, которая была сформирована на пре-мРНК, несущей мутацию A-to-C в точке ветвления (brC), осаждалась антителом против Ntc20, приблизительно. 40% отделялось от гранул после инкубации с NTR (рис.4C, дорожки 5 и 6). Это дальнейшее открытие подтверждает, что предотвращение связывания Cwc25 со сплайсосомой является критическим для NTR-опосредованной разборки прекаталитической сплайсосомы.

Дифференциальное сродство Ntr2 к разным промежуточным соединениям сплайсосом. Затем мы рассмотрели вопрос о том, коррелирует ли чувствительность сплайсинговых комплексов к разборке с их способностью рекрутировать NTR. Ранее мы показали, что Ntr2 обеспечивает привлечение NTR к сплайсосоме посредством взаимодействия с Brr2 и что только Ntr2 может связываться со сплайсосомой (37).Способность сплайсинговых комплексов связываться с Ntr2 может отражать их способность рекрутировать NTR. Для анализа связывания Ntr2 различных комплексов сплайсинга сплайсинг проводился в различных условиях для остановки сплайсосомы на разных стадиях. Затем к реакционным смесям добавляли возрастающие количества рекомбинантного Ntr2-HA с последующим осаждением антителом против HA или против Ntc20 (фиг. 5A). Для предкаталитических стадий сплайсосомы были арестованы с использованием инактивированных нагреванием экстрактов мутантов prp2-1 (рис.5Aa), добавлением Prp2, очищенного из экстрактов, сверхэкспрессирующих Prp2, к реакционной смеси сплайсинга после истощения АТФ (фиг. 5Ab) или истощения Yju2 из экстрактов (фиг. 5Ac). Для постшага 1 сплайсосомы были остановлены истощением Prp16 (фиг. 5Ad) путем добавления разбавленных экстрактов, сверхэкспрессирующих Prp16, которые примерно в 20 раз производят Prp16 (см. Фиг. S5 в дополнительном материале), к реакции сплайсинга. смеси после истощения АТФ (рис. 5Ae) за счет истощения Slu7 (рис.5Af), или с помощью пре-мРНК ACAC (рис. 5Ag). Для посткаталитических сплайсосом сплайсинг проводили в присутствии prp22-S635A (фиг. 5Ah). Для сплайсосом на терминальной стадии сплайсинг проводили в экстрактах, обедненных Ntr1 (рис. 5Ai). Количество сплайсосом, связанных с Ntr2, количественно определяли с помощью фосфоро-визуализатора и нормализовали по количеству сплайсосом, связанных с Ntc20 (фиг. 5A, дорожки 2) после вычитания количества РНК, осажденной в отсутствие Ntr2-HA (дорожки 3). Затем процентное содержание Ntr2-связанной сплайсосомы наносили на график в зависимости от количества добавленного Ntr2-HA (рис.5Б).

Рис. 5

Дифференциальное сродство Ntr2 к сплайсосомам задерживается на различных стадиях. (A) Реакция сплайсинга проводилась в следующих условиях: сплайсинг инактивированных нагреванием экстрактов prp2-1 (a), сплайсинг инактивированных нагреванием экстрактов prp2-1 , с последующим сначала истощением АТФ, а затем добавление очищенного дрожжевого Prp2 (b), сплайсинг в экстрактах, обедненных Yju2 (dYju2) (c), сплайсинг в экстрактах, обедненных Prp16 (d), сплайсинг в экстрактах, обедненных Prp16, с последующим сначала истощением АТФ, а затем добавлением Сверхэкспрессирующие Prp16 дрожжевые экстракты (e), сплайсинг в экстрактах, истощенных по Slu7 (f), сплайсинг с пре-мРНК ACAC (g), сплайсинг в присутствии рекомбинантного prp22-S635A (h) или сплайсинг в экстрактах, истощенных по Ntr1 ( я).Реакционные смеси (дорожки 1) осаждали антителом против Ntc20 (дорожки 2) или анти-HA антителом либо без добавления Ntr2-HA (дорожки 3), либо после добавления 20 нг (дорожки 4), 50 нг (дорожки 5), 100 нг (дорожки 6), 200 нг (дорожки 7) или 500 нг (дорожки 8) рекомбинантного Ntr2-HA. (B) Результаты, показанные на панели A, были количественно определены с использованием фосфорного сканера, и процент сплайсосомы, осажденной антителом против Ntc20, который также был преципитирован антителом против HA, был нанесен на график как функция количества рекомбинантного Ntr2- HA добавил.(C) Реакции сплайсинга проводили в имитационных экстрактах или экстрактах, обедненных Prp16, и реакционная смесь была обеднена АТФ добавлением 10 мМ глюкозы с последующей инкубацией при 25 ° C в течение 5 минут. После добавления рекомбинантного Ntr2 (дорожки 3 и 7) или аффинно-очищенного комплекса NTR (дорожки 4 и 8) реакционные смеси осаждали антителом против Ntr2 (дорожки 2–4 и 6–8).

Следует отметить, что процент сплайсосомы, связанной с Ntr2, может быть несколько занижен из-за присутствия эндогенного Ntr2, которое оценивается примерно в 8 нг в каждой реакционной смеси, за исключением экстрактов, обедненных Ntr1 (рис.5Ai), в котором Ntr2 был со-завершен (36). Тем не менее, результаты показывают, что сплайсинговые комплексы можно разделить на три группы на основании их сродства к Ntr2. Сплайсосома на терминальной стадии, которая является исходным субстратом комплекса NTR в нормальных реакциях сплайсинга, связала Ntr2 с наивысшим сродством (обозначено черным кружком), и примерно 30% или 40% сплайсосомы, связанной с Ntc20, содержали Ntr2- HA при добавлении 20 или 200 нг Ntr2-HA соответственно (фиг. 5Ai). Промежуточные продукты сплайсосомы, восприимчивые к разборке (пост-Prp2 [рис.5Ac] и пост-Prp16 [Рис. 5Af]) связывал Ntr2 с промежуточным сродством (обозначено черными квадратами) примерно с 20% сплайсосомы, связанной с Ntc20, содержащей Ntr2-HA, при добавлении 200 нг Ntr2-HA. Эти сплайсинговые комплексы могут также связываться с комплексом NTR, как показано связыванием экзогенно добавленного мутанта prp43-T123A со сплайсосомой, образованной в экстрактах, истощенных по Yju2 или Slu7 (см. Рис. S6 в дополнительном материале). Напротив, только едва заметные количества сплайсосомы были осаждены в присутствии 20 нг Ntr2, и менее 10% сплайсосомы, связанной с Ntc20, содержали Ntr2-HA, с добавлением 500 нг Ntr2 для пре-Prp2. (Рис.5Aa), Prp2-связанные (фиг. 5Ab), Prp16-связанные (фиг. 5Ae) и Prp22-связанные сплайсосомы (фиг. 5Ag и h), ни одна из которых не подвержена разборке. Чтобы исключить возможность того, что эпитоп HA Ntr2-HA был не так доступен для антитела в этих сплайсосомах, как в других, плохое связывание Ntr2 с этими сплайсосомами было дополнительно подтверждено их неспособностью эффективно рекрутировать prp43-T123A в сплайсосомы ( см. рис. S7 в дополнительном материале). В качестве исключения сплайсосома pre-Prp16, которая сохранила Yju2 и Cwc25 и не была подвержена разборке, связала Ntr2 с промежуточным сродством (рис.5Ad). Кроме того, очищенный комплекс NTR может также связываться со сплайсосомой pre-Prp16 в отсутствие АТФ (фиг. 5C, дорожка 8). Эти результаты предполагают, что сплайсинговые комплексы, которые плохо связываются с Ntr2, обычно не подвержены разборке, но не все комплексы, которые способны хорошо связывать NTR, являются чувствительными. Взятые вместе, наши результаты показывают две важные структурные особенности сплайсосомы, которая восприимчива к разборке: (i) способность связывать Ntr2 с хорошим сродством и (ii) удаление специфических белков, которые связываются в каталитическом центре.

Конкурентное ингибирование связывания Ntr2 с помощью Prp16 и Slu7. Результаты, обсужденные выше, показывают, что NTR может опосредовать разборку сплайсосомы, когда она задерживается на стадии пост-Prp2 или пост-Prp16, но NTR необходимо исключить, чтобы Избегайте разборки промежуточных продуктов сплайсосом при обычных реакциях сплайсинга. Вероятно, факторы сплайсинга с разных стадий пути могут конкурировать с Ntr2, чтобы предотвратить его связывание со сплайсосомой. Методом двугибридного анализа дрожжей было показано, что Brr2 взаимодействует с Prp2, Prp16 и Slu7 через второй геликазный домен (51).Как и в случае с Ntr2, такие взаимодействия могут играть роль в рекрутировании этих белков в сплайсосомы во время каталитических стадий. Сначала мы использовали двухгибридные анализы, чтобы определить, взаимодействует ли Ntr2 также со вторым геликазным доменом Brr2 (рис. 6А). Белок Brr2 примерно разделен на пять участков, несущих аминоконцевой (N), первый геликазный (h2), средний (M), второй геликазный (h3) и карбоксиконцевой (C) сегменты. На фигуре 6А показано, что N-концевая половина белка (аминокислотные остатки с 1 по 1369), содержащая сегменты N, h2 и M, или фрагмент, содержащий только С-концевую последовательность (аминокислотные остатки с 1713 по 2163), не взаимодействует с Ntr2.Однако карбокси-концевая половина белка (аминокислотные остатки от 1209 до 2163), содержащая h3 и C, взаимодействует с Ntr2. Таким образом, Ntr2 также взаимодействует со вторым доменом геликазы Brr2, и его связывание со сплайсосомой может быть предотвращено с помощью Prp2, Prp16 и Slu7 во время прогрессирования пути сплайсосомы.

Рис. 6.

Конкуренция Prp16 и Slu7 с Ntr2 за связывание сплайсосом. (А) Дрожжевые двухгибридные анализы, показывающие, что область Brr2 взаимодействует с Ntr2. N, амино-конец; h2, 1-й домен геликазы; М, средний регион; h3, 2-й домен геликазы; С, карбоксильный конец; BD, связывающий домен; AD, домен активации; V, вектор; FL, полная длина.(B) Реакции сплайсинга проводили в экстрактах, обедненных Prp16. К реакционной смеси добавляли предварительно смешанные рекомбинантные Ntr2 и prp16-D473A с конечной концентрацией 500 нМ для Ntr2 (дорожки с 1 по 15) и конечной концентрацией 0 нМ (дорожки с 1 по 3), 20 нМ (дорожки с 4 по 6). , 50 нМ (дорожки 7–9), 100 нМ (дорожки 10–12) или 200 нМ (дорожки 13–15) для prp16-D473A. Смеси иммунопреципитировали антителом против Prp16 (дорожки 2, 5, 8, 11 и 14) или антителом против Ntr2 (дорожки 3, 6, 9, 12 и 15).RXN, 1/10 реакционной смеси. (C) Результаты, показанные на панели B, были количественно определены с использованием фосфорного сканера, и процентное содержание Ntr2, которое осталось связанным со сплайсосомой в присутствии prp16-D473A, было нанесено на график в зависимости от отношения количества prp16-D473A к количеству Ntr2. (D) Реакции сплайсинга проводили с пре-мРНК ACAC в экстрактах, лишенных Slu7 in vitro и метаболически истощенных по Ntr2. К реакционной смеси добавляли предварительно смешанные рекомбинантные Ntr2 и Slu7-V5 с конечной концентрацией 1000 нМ для Ntr2 (дорожки с 1 по 15) и конечной концентрацией 0 нМ (дорожки с 1 по 3), 40 нМ (дорожки с 4 по 6). , 100 нМ (дорожки 7–9), 200 нМ (дорожки 10–12) или 400 нМ (дорожки 13–15) для Slu7-V5.Смеси подвергали иммунопреципитации антителом против V5 (дорожки 2, 5, 8, 11 и 14) или антителом против Ntr2 (дорожки 3, 6, 9, 12 и 15). (E) Результаты, показанные на панели D, были количественно определены с использованием фосфорного сканера, и процентное содержание Ntr2, которое осталось связанным со сплайсосомой в присутствии Slu7-V5, было нанесено на график в зависимости от отношения количества Slu7-V5 к количеству Ntr2.

Чтобы определить, может ли Prp16 нарушить связывание сплайсосом Ntr2, мы провели конкурентные анализы.Сплайсинг проводили в экстрактах, обедненных Prp16, и затем к реакционным смесям добавляли предварительно смешанные рекомбинантные Ntr2 и prp16-D473A в различных соотношениях с фиксированной концентрацией Ntr2 500 нМ (фиг. 6B). Связанную с Ntr2 сплайсосому выделяли путем осаждения антителом против Ntr2, и процентное содержание Ntr2, которое оставалось связанным в присутствии prp16-D473A, наносили на график в зависимости от отношения количества prp16-D473A к количеству Ntr2. На рисунке 6C показано, что количество сплайсосомы, связанной с Ntr2, снижалось более чем на 40% в присутствии 20 нМ prp16-D473A (при соотношении 0. 04) и на 80% при 100 нМ prp16-D473A (при соотношении 0,2), что указывает на то, что Prp16 лучше связывается, чем Ntr2, со сплайсосомой pre-Prp16 и может конкурировать с Ntr2 за связывание для удаления NTR из сплайсосомы.

Аналогичный конкурентный эксперимент был проведен с Slu7. Реакции сплайсинга проводили в экстрактах, обедненных Slu7, с использованием пре-мРНК ACAC. Чтобы предотвратить разборку сплайсосомы в отсутствие Slu7, для этого эксперимента использовали экстракты, метаболически обедненные Ntr2 (37).К реакционным смесям добавляли предварительно смешанный рекомбинантный Ntr2 в конечной концентрации 1 мкМ и различные количества белка Slu7-V5. Связанные с Ntr2 и Slu7 сплайсосомы затем осаждали антителом против Ntr2 и антителом против V5 соответственно (фиг. 6D), и процентное содержание Ntr2, которое оставалось связанным в присутствии Slu7, наносили на график в зависимости от соотношения количество Slu7 по сравнению с Ntr2 (рис. 6E). На рисунке 6E показано, что количество сплайсосомы, связанной с Ntr2, уменьшилось на 25% в присутствии 40 нМ Slu7 (при соотношении 0. 04), что указывает на то, что Slu7 также лучше, чем Ntr2, связывается со сплайсосомой после Prp16. Количество сплайсосомы, связанной с Ntr2, снижалось примерно на 50% при 400 нМ Slu7 (в соотношении 0,4). Дальнейшее увеличение количества Slu7 не препятствовало большему связыванию Ntr2 со сплайсосомой (данные не показаны). Поскольку стабильному связыванию Slu7 со сплайсосомой способствует присутствие Prp22 (46), возможно, что количество эндогенного Prp22 недостаточно для поддержания связывания Slu7, когда Slu7 добавляется в больших количествах.Альтернативно, Prp22-зависимое отторжение сплайсосомы может предотвратить дальнейшее ингибирование связывания Ntr2 с помощью Slu7. Кроме того, сплайсосома pre-Prp16, по-видимому, накапливалась в больших количествах в отсутствие Slu7 и составляла часть сплайсосомы, связывание которой Ntr2 было устойчивым к ингибированию Slu7, поскольку добавление Prp16 также могло ингибировать связывание Ntr2 при в таких условиях (см. рис. S8 в дополнительном материале). Взятые вместе, наши результаты показывают, что в присутствии Prp16 или Slu7 связывание Ntr2 со сплайсосомой пре-Prp16 или пост-Prp16 конкурентно ингибируется, обеспечивая механизм, предотвращающий разборку промежуточных продуктов сплайсосомы NTR в нормальных условиях сплайсинга.

ОБСУЖДЕНИЕ

Было продемонстрировано, что

DEXD / H-box белки Prp43 и Brr2 играют роль в разборке сплайсосом (25, 27, 32, 36). Prp43 ассоциирует с Ntr1 и Ntr2 с образованием комплекса NTR, который обеспечивает разборку. Ntr1 взаимодействует с Prp43 через свой домен G-patch (36), который также стимулирует геликазную активность Prp43 (30), и с Ntr2 через его среднюю область. Ntr2 обеспечивает связывание NTR со сплайсосомой и может связываться со сплайсосомой посредством взаимодействия с Brr2 (37).Мутации в Brr2 также препятствуют диссоциации лариат-интрона и отделению U2 и U6 от Prp43-ассоциированной сплайсосомы (32). Принимая во внимание тот факт, что U5 ассоциирован со сплайсосомой на ранней стадии во время сборки сплайсосомы, возможно, что NTR может быть задействован, чтобы опосредовать разборку сплайсосомы на ранних этапах пути. Несколько генетических исследований подтверждают это мнение. NTR1 (также называемый SPP382 ) также был идентифицирован как супрессор мутации prp38-1 .Prp38 является компонентом три-мяРНП дрожжей и необходим для активации сплайсосомы (52). Было также показано, что несколько мутаций в PRP43 , влияющих на активность АТФазы, подавляют дефект роста мутации prp38-1 с эффективностью, обратно пропорциональной измеренной активности АТФазы (53), предполагая, что снижение активности Prp43 может частично компенсировать нарушение сборки сплайсосом. Недавно было дополнительно продемонстрировано, что Prp43 способствует удалению промежуточных продуктов сплайсосом, взаимодействуя с функцией Prp16 и Prp22 при проверке реакции сплайсинга (38, 39).Посредством систематического анализа in vitro мы показываем здесь, что NTR может опосредовать разборку промежуточных продуктов сплайсосомы, но только на определенных стадиях пути. NTR может функционировать после АТФ-зависимого действия каждого белка DEAH-бокса — Prp2, Prp16 и Prp22 — но не до их действия или пока они связаны со сплайсосомой (рис. 5A). Это наблюдение указывает на то, что NTR функционально связан с этими белками DEAH-бокса.

Разборка сплайсосомы требует предварительного удаления белков, связывающихся с каталитическим центром.Действие Prp2, Prp16 и Prp22 связано с высвобождением или дестабилизацией связывания сплайсосомных компонентов в каталитическом центре на каждой конкретной стадии. Компоненты SF3b связываются с сайтом разветвления во время сборки сплайсосомы, и до катализа они дестабилизируются или теряются из сплайсосомы в зависимости от условий отмывки, что указывает на то, что способ их взаимодействия со сплайсосомой изменяется под действием Prp2 (21, 22, 24). До действия Prp2, когда SF3a / b все еще тесно связаны, сплайсосома не подвержена разборке, и только после дестабилизации SF3a / b сплайсосома становится чувствительной.Дестабилизация SF3a / b позволяет связывать Cwc25 для ускорения первой каталитической реакции. В отсутствие Cwc25 застопорившаяся прекаталитическая сплайсосома чувствительна к разборке, а присутствие др. Ступенчатого фактора, Yju2, не предотвращает разборку сплайсосомы. После образования лариата действие Prp16 необходимо для удаления Yju2 и Cwc25 из сплайсосомы, чтобы подготовиться ко второй каталитической реакции. С ассоциированными Yju2 и Cwc25 сплайсосома не подвержена разборке.Высвобождение Yju2 и Cwc25 позволяет факторам второй ступени, Slu7, Prp18 и Prp22, связываться с субстратной РНК в 3′-сайте сплайсинга, чтобы способствовать второй реакции. В отсутствие Slu7 и Prp22 застопорившаяся сплайсосома также восприимчива к разборке, а стабильная ассоциация Prp22 и Slu7 предотвращает разборку сплайсосом. После лигирования экзона Prp22 катализирует высвобождение мРНК и сам диссоциирует от сплайсосомы вместе с Slu7 и Prp18. На этой конечной стадии факторы второй стадии удаляются из каталитического центра, и сплайсосома легко разбирается.Взятые вместе, эти результаты убедительно указывают на то, что специфические факторы, связывающиеся в каталитическом центре на каждой каталитической стадии, должны быть удалены, чтобы сплайсосома стала восприимчивой к NTR-опосредованной разборке. Как связывание этих белков предотвращает разборку, неизвестно. Спаривания оснований РНК образуют каркас каталитического центра сплайсосомы, но стабилизируются за счет связывания белковых факторов. На каждой каталитической стадии дестабилизация этих белков, по-видимому, обеспечивает большую структурную динамику в каталитическом центре сплайсосомы, так что положение сайтов сплайсинга можно регулировать.Возможно, такая динамика может также создать хрупкую среду, в которой сплайсосома подвержена разборке.

Стабильное связывание NTR со сплайсосомой необходимо, но недостаточно для опосредования разборки. При изучении корреляций между чувствительностью различных сплайсинговых комплексов к разборке и их сродством к связыванию NTR мы обнаружили, что сплайсинговые комплексы можно разделить на три группы на основе об их сходстве с Ntr2. Как и ожидалось, сплайсосома, связанная с лариатом и интроном, как аутентичный субстрат для NTR в нормальных условиях сплайсинга, связывает Ntr2 с гораздо более высокой аффинностью, чем любой из других проанализированных комплексов. Сплайсосомы, образованные в экстрактах, истощенных по Yju2 или Slu7, соответствующих сплайсосомам после Prp2 и после Prp16, соответственно, также связывают Ntr2, но с более низким сродством. Все комплексы, которые не подвержены разборке, плохо связывают Ntr2, за исключением сплайсосомы pre-Prp16, которая связывает Ntr2 со сродством, сопоставимым с аффинностью сплайсосом post-Prp2 и post-Prp16. Эти результаты предполагают, что различные структурные особенности сплайсосомы могут определять ее сродство к Ntr2. Альтернативно сайт связывания Ntr2 может блокироваться другими сплайсосомными компонентами, чтобы предотвратить преждевременную разборку функциональных сплайсосом.Хотя комплексы, которые почти не связывают Ntr2, неизменно не подвержены разборке, не все комплексы, которые связывают Ntr2 с промежуточным сродством, восприимчивы к разборке. Например, в случае сплайсосомы pre-Prp16 связывание Cwc25 предотвращает разборку сплайсосомы.

Стоит отметить, что, несмотря на его способность получать доступ к промежуточным соединениям сплайсосом, остановленным на определенных стадиях, NTR необходимо исключить из пути сплайсинга до завершения реакции, чтобы избежать преждевременной разборки функциональных сплайсосом во время реакции сплайсинга. Одним из способов исключения NTR является конкурентное связывание специфических факторов сплайсинга с одним и тем же сайтом сплайсосомы. Мы показываем, что Ntr2 взаимодействует с Brr2 через второй домен геликазы, который, как было показано в двухгибридных анализах, также взаимодействует с Prp2, Prp16 и Slu7 (51). Вероятно, что Brr2 служит платформой для рекрутирования этих факторов на различных стадиях пути сплайсосом. Вероятно, конкурентное взаимодействие Prp2, Prp16 или Slu7 может блокировать взаимодействие Ntr2 с Brr2 для предотвращения рекрутирования NTR.В соответствии с этим представлением, связывание Ntr2 со сплайсосомами pre-Prp16 и post-Prp16 значительно снижается в присутствии Prp16 или Slu7, соответственно. Более того, все сплайсосомы, связанные с Prp2, Prp16 и Slu7, обладают очень низкой способностью связываться с Ntr2, но устойчивая к разборке сплайсосома pre-Prp16 может гораздо лучше связывать Ntr2, при этом ни один из этих факторов, взаимодействующих с Brr2, не связан. Эти результаты подтверждают модель конкурентного исключения NTR из сплайсосомы в нормальных условиях сплайсинга.

Для сплайсосомы post-Prp2 ожидается, что связывание Cwc25 со сплайсосомой будет более благоприятным, чем связывание Ntr2 в предотвращении преждевременной разборки. Тем не менее не наблюдали, что Cwc25 конкурирует за связывание Ntr2 с очищенной сплайсосомой post-Prp2 (данные не показаны). Также Cwc25 не взаимодействует с Brr2 в дрожжевых двухгибридных анализах (данные не показаны). Механизм, лежащий в основе предотвращения NTR-опосредованной разборки сплайсосомы post-Prp2, неизвестен. Мы предполагаем, что Cwc25 может кинетически благоприятствовать сплайсосоме post-Prp2, и при связывании со сплайсосомой Cwc25 может быстро способствовать первой реакции и оставаться стабильно связанным со сплайсосомой, чтобы предотвратить NTR-опосредованную разборку.

Связь разборки сплайсосом с корректурой. DEXD / H-box ATPases участвуют в корректуре сплайсинга пре-мРНК на нескольких этапах (54–56). Впервые было обнаружено, что Prp16 повышает точность распознавания сайтов разветвлений, поскольку мутации в PRP16 увеличивают накопление промежуточных продуктов аберрантных сайтов разветвлений (54). Механизм кинетической корректуры был предложен для роли Prp16 в контроле достоверности путем связывания гидролиза АТФ с путем сброса для удаления некорректных промежуточных продуктов сплайсинга РНК из нормального пути сплайсинга (54, 57), но не до недавнего времени был подробный молекулярный механизм этого раскрыт процесс корректуры (23, 38, 58).Используя модифицированный U6 с серой, замещающей немостиковый кислород в положении U80, который связывает Mg ²⁺ в первой каталитической реакции (59), Koodathingal et al. показали, что Prp16 опосредует отторжение медленной сплайсосомы перед расщеплением 5′-сайта сплайсинга и что Prp43 необходим для разборки отклоненной сплайсосомы (38). Ранее мы показали, что Prp16 обеспечивает высвобождение Yju2 и Cwc25 после первых каталитических реакций в нормальных условиях сплайсинга, но может делать это до реакции, когда катализ медленный из-за мутаций в точке ветвления.Этот результат предполагает, что Prp16 может функционировать при корректуре, удаляя Cwc25 для предотвращения каталитической реакции (23). Здесь мы далее показываем, что NTR может обеспечивать разборку прекаталитических сплайсосом, лишенных Cwc25. Вместе эти результаты указывают на то, что медленные сплайсосомы, вероятно, предназначены для разборки после опосредованного Prp16 отторжения посредством удаления Cwc25.

Аналогичным образом, Prp22, как было показано, подавляет сплайсинг аберрантных промежуточных продуктов и повышает точность сплайсинга, опосредуя отторжение сплайсосомы АТФ-зависимым образом (55), а отклоненные промежуточные продукты, как было показано, отбрасываются через Prp43 ( 39).Мутантная пре-мРНК ACAC по 3′-сайту сплайсинга образовывала сплайсосомы, в которых накапливаются промежуточные продукты сплайсинга. Prp22, Slu7 и Prp18 остаются связанными с такими сплайсосомами, но не могут способствовать второй каталитической реакции (46). Мы показываем, что NTR не может катализировать разборку очищенной сплайсосомы ACAC, но что предшествующее истощение Prp22 и Slu7 из экстракта сделало его восприимчивым к разборке, предполагая, что Prp22 и Slu7 защищают сплайсосому от разборки. С этой точки зрения Prp22 может опосредовать отторжение сплайсосомы путем гидролиза АТФ; диссоциация Prp22 из сплайсосомы вместе с Slu7 и Prp18 затем позволяет NTR получить доступ к сплайсосоме, чтобы вызвать разборку.В соответствии с этим представлением, разборка сплайсосомы ACAC в отсутствие Prp22 и Slu7 наблюдалась в реакции сплайсинга без предварительной очистки сплайсосомы. Мы обнаружили, что количество промежуточных продуктов сплайсинга, содержащих сплайсосомы, было значительно меньше в экстрактах, обедненных Prp22 и Slu7, чем в контрольных экстрактах. Когда реакционные смеси для сплайсинга анализировали с помощью седиментации в градиенте глицерина, в реакционной смеси экстрактов, обедненных Prp22 и Slu7, было обнаружено свободное лариатное промежуточное соединение, что указывает на то, что часть сплайсосомы была разобрана во время реакции сплайсинга.

Prp5 также был предложен для проверки спаривания сайтов U2-ответвлений на ранней стадии пути сплайсосомы (56), но судьба отвергнутой сплайсосомы неизвестна.