Двигатели лады: какой мне нужен? Ответ эксперта — журнал За рулем

Содержание

какой тип двигателя авто Лада Largus, типы двигателя комплектаций

Classic 5 мест Бензиновый
Classic 5 мест Air conditioner Бензиновый
Classic 7 мест Air conditioner Бензиновый
Classic Climate 5 мест 5 мест Бензиновый
Classic Climate 7 мест Бензиновый
Club 5 мест Бензиновый
Club 7 мест Бензиновый
Comfort 5 мест Бензиновый
Comfort 7 мест Бензиновый
Luxe Газовый
Luxe 5 мест Бензиновый
Luxe 7 мест Бензиновый
Luxe 5 мест Бензиновый
Luxe 7 мест Бензиновый
Luxe Glonass 5 мест
Бензиновый
Luxe Glonass 7 мест Бензиновый
Luxe Prestige Газовый
Luxe Prestige 5 мест Бензиновый
Luxe Prestige 7 мест Бензиновый
Luxe Prestige 5 мест Бензиновый
Luxe Prestige 7 мест Бензиновый
Luxe Prestige Glonass 5 мест
Бензиновый
Luxe Prestige Glonass 7 мест Бензиновый
Norma 5 мест 5 мест Бензиновый
Norma Climate 5 мест 5 мест Бензиновый
Norma Climate 5 мест Glonass 5 мест Бензиновый
Norma Climate 7 мест Бензиновый
Norma Climate 7 мест Glonass Бензиновый
Norma Comfort
Газовый
Norma Comfort 5 мест Бензиновый
Norma Comfort 7 мест Бензиновый
Norma Comfort 5 мест Бензиновый
Norma Comfort 7 мест Бензиновый
Norma Comfort 7 мест Glonass Бензиновый
Norma Comfort Glonass 5 мест Бензиновый
Norma Comfort Glonass 7 мест
Бензиновый
Norma Glonass 5 мест Бензиновый
Standard 5 мест Бензиновый
Standard 5 мест 5 мест Бензиновый
Standard 5 мест Glonass 5 мест Бензиновый
Люкс Бензиновый
Норма Бензиновый
Стандарт Бензиновый

Моторное масло для Lada | Какое масло заливать в двигатели ВАЗ Lada

Автомобили марки Lada получили широкое распространение в России благодаря приспособленности к российским условиям эксплуатации, доступной цене и низкой стоимости обслуживания. Изначально брэнд Lada использовался Волжским автомобильным заводом для автомобилей Жигули, предназначенных на экспорт, однако затем стал применяться для всех моделей завода. В настоящее время помимо АвтоВАЗа автомобили Lada собирает также предприятие ИжАвто. В текущей модельной линейке Lada легковые автомобили Priora, Kalina, Granta, Largus, Vesta, кроссовер XRAY, внедорожник 4х4.

Рекомендуемые моторные масла для Lada зависят от модели автомобиля и условий его эксплуатации. Для подбора масла по модификации используйте специальный сервис на нашем сайте.

ELF EVOLUTION 700 STI 10W40

Полусинтетическое моторное масло ELF EVOLUTION 700 STI 10W40 удовлетворяет стандартам качества API SN/CF и ACEA A3/B4 и подходит для большинства моделей Lada, так как автопроизводитель чаще всего рекомендует использовать масла этих стандартов. Оно адаптировано к экстремальным условиям эксплуатации и отличается устойчивостью к воздействию высокой температуры, поэтому гарантирует защиту двигателя от износа в наиболее сложных режимах работы. Его превосходные очищающие свойства предотвращают образование вредных отложений на деталях мотора и сохраняют его производительность. Характеристики вязкости ELF EVOLUTION 700 STI 10W40 обеспечивают его эффективность как при низкой, так и при высокой температуре, а стойкость к окислению исключает потерю свойств в ходе эксплуатации и допускает увеличение межсервисных интервалов, в соответствии с требованиями автопроизводителя.

ELF EVOLUTION 700 STI 10W40

ELF EVOLUTION 900 SXR 5W30

Разработанное по синтетической технологии энергосберегающее моторное масло ELF EVOLUTION 900 SXR 5W30 имеет улучшенные противоизносные и очищающие характеристики, поэтому надежно защищает двигатель в любых режимах движения. Это масло обладает повышенной энергоэффективностью: благодаря хорошей текучести оно снижает трение при работе мотора, что способствует экономии топлива. Низкая температура застывания этого масла гарантирует уверенный холодный пуск, а окислительная и термическая стабильность позволяет придерживаться максимальных возможных интервалов замены. ELF EVOLUTION 900 SXR 5W30 отвечает спецификациям ACEA A5/B5 и API SL/CF и подойдет для всех двигателей Lada, требующих масел этих стандартов.

ELF EVOLUTION 900 SXR 5W30

ELF EVOLUTION 900 NF 5W40

Высококачественное масло ELF EVOLUTION 900 NF 5W40 производится с применением синтетической технологии ELF и удовлетворяет стандартам ACEA A3/B4 и API SL/CF. Оно рекомендуется для моделей Lada, которым нужны смазочные материалы этого уровня свойств. Это масло эффективно предохраняет двигатель, особенно детали системы газораспределения, от износа в наиболее сложных режимах движения и подходит для всех стилей вождения, в том числе спортивной и высокоскоростной езды, движения в городе или по трассе. Моющие присадки в его составе поддерживают чистоту мотора, а высокая низкотемпературная текучесть гарантирует уверенный запуск в холодную погоду. За счет устойчивости к окислительному воздействию ELF EVOLUTION 900 NF 5W40 может использоваться с увеличенным, в рамках предусмотренных автопроизводителем, интервалом замены.

ELF EVOLUTION 900 NF 5W40

Подробнее о моторных маслах ELF.

 

Моторное масло для Lada Vesta

Моторное масло для Lada Kalina

Моторное масло для Lada Largus

Моторное масло для Lada Granta

 

Моторное масло для Lada Largus

LADA LARGUS — российский автомобиль малого класса, совместно разработанный компаниями Renault и АвтоВАЗ. Первый Ларгус сошёл с тольяттинского конвейера в 2012 году. Выпускаются варианты универсал, минивэн и фургон. Двигатели для Ларгуса имеют две бензиновые версии: 8-клапанный с 87 л.с. и 16-клапанный мощностью 102 л.с. У всех представителей семейства Ларгус установлена 5-ступенчатая МКПП.

В руководстве по эксплуатации указаны рекомендованные смазывающие жидкости. Соответствия и допуски моторных масел для Lada Largus: API SL / API SM / API SN / ACEA A1/ ACEA A2/ ACEA A3/ ACEA A5. В линейке моторных масел Liqui Moly существует целый ряд продуктов, которые рекомендуются для использования в моторах Ларгус.

LIQUI MOLY OPTIMAL 5W-30

Для 8-клапанных моторов Ларгуса рекомендуется HC-синтетическое моторное масло Optimal 5W-30. Масло обладает популярнейшим классом вязкости для современных автомобилей и оптимально подходит для эксплуатации в России. Optimal 5W-30 обеспечивает лёгкий ход мотора, высокую устойчивость смазки, быстрое смазывание деталей при низких температурах, оптимальное давление при любых условиях, отличную защиту от износа, а также экономит топливо и снижает выброс вредных веществ.

LIQUI MOLY OPTIMAL 5W-40

В 16-ти клапанные двигатели автомобилей Lada Largus наиболее подходящим вариантом будет масло Optimal 5W-40. Это HC-синтетическое моторное масло с адаптированным для российских условий пакетом присадок. Новейшие технологии синтеза обеспечивают высокий уровень защиты и оптимальное смазывание деталей двигателя. Продукт обладает отличными антифрикционными свойствами для всесезонного применения. Комбинация базовых масел на основе гидрокрекинга и самой современной технологией присадок гарантирует получение моторного масла, которое снижает до минимума трение, в результате чего уменьшается расход топлива, обеспечивает быстрое поступление масла к деталям двигателя при низких температурах, надежно защищает от износа и снижает вредные выбросы.

Благодаря доступной цене масла линейки Optimal являются идеальным соотношением цены и настоящего немецкого качества. При этом они соответствуют современным международным стандартам API/ACEA.

На Lada поставят турбодвигатель мощностью 150 лошадиных сил

https://ria.ru/20210707/lada-1740197414.html

На Lada поставят турбодвигатель мощностью 150 лошадиных сил

На Lada поставят турбодвигатель мощностью 150 лошадиных сил - РИА Новости, 07.07.2021

На Lada поставят турбодвигатель мощностью 150 лошадиных сил

"АвтоВАЗ" планирует в ближайшие пять лет представить автомобили Lada с турбодвигателем 1.3 TCe 150 (объемом 1,3 литра, мощностью до 150 лошадиных сил), сообщил... РИА Новости, 07.07.2021

2021-07-07T08:08

2021-07-07T08:08

2021-07-07T09:29

экономика

ижевск

тольятти

renault s.a

lada

автоваз

авто

/html/head/meta[@name='og:title']/@content

/html/head/meta[@name='og:description']/@content

https://cdn24.img.ria.ru/images/07e5/06/15/1737870271_0:90:3480:2048_1920x0_80_0_0_2f52dcdbd06582a13a67a8c33801d624.jpg

ЕКАТЕРИНБУРГ, 7 июл — РИА Новости. "АвтоВАЗ" планирует в ближайшие пять лет представить автомобили Lada с турбодвигателем 1.3 TCe 150 (объемом 1,3 литра, мощностью до 150 лошадиных сил), сообщил президент компании Николя Мор в кулуарах "Иннопрома-2021".Сейчас такие моторы ставят на машины марки Renault — кроссоверы Arkana, Duster и Kaptur."Этот двигатель создан совместно с Daimler, у него отличная отдача 150 сил. Он очень эффективный", — отметил руководитель автоконцерна.Конкретные модели Lada, которые собираются обновить, топ-менеджер не раскрыл, уточнив лишь, что это будет "более дорогой сегмент"."АвтоВАЗ" делает свои автомобили по полному циклу, а также комплектующие для двух брендов — Lada и Renault. Производство расположено в Тольятти и Ижевске. Марка Lada состоит из пяти семейств моделей: Vesta, Xray, Largus, Granta и Niva. Бренд лидирует на российском автомобильном рынке с долей свыше 20% и представлен более чем в 20 странах.

https://ria.ru/20210621/avtovaz-1737841708.html

https://radiosputnik.ria.ru/20210621/avto-1737892534.html

ижевск

тольятти

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

2021

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

Новости

ru-RU

https://ria.ru/docs/about/copyright.html

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

https://cdn24.img.ria.ru/images/07e5/06/15/1737870271_307:0:3038:2048_1920x0_80_0_0_f622c7fefc4296675197c62fc26aad49.jpg

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

экономика, ижевск, тольятти, renault s.a, lada, автоваз, авто

08:08 07.07.2021 (обновлено: 09:29 07.07.2021)

На Lada поставят турбодвигатель мощностью 150 лошадиных сил

Двигатели Лада Веста - объем, характеристики, видео обзор линейки двигателей

Наверняка отечественному автолюбителю будет интересно, какие типы двигателей будут использованы при окончательной комплектации Лады Весты. По мнению абсолютного большинства водителей, двигатель Лады Весты имеет исключительную важность для будущих владельцев авто.

К счастью, характеристики двигателя Лада Веста уже стали  доступны общественности, поскольку доподлинно известны марки и типы силовых агрегатов, которыми планируется оснастить новую модель «АвтоВАЗ». На данный момент времени на вопрос, какой двигатель стоит на Ладе Веста, можно дать целых четыре ответа – и предложенная линейка двигателей нуждается в описании и сравнении.

ВАЗ-11189

Данный двигатель считается самым слабым, возможным к установке на Ладу Весту. На это указывает объективное сравнение технических характеристик двигателей Лада Веста – на этом агрегате все показатели значительно ниже, чем на иных версиях.

По своей сути, ВАЗ-11189 является прямой модификацией более старого ВАЗ-11186 – единственным отличием двигателей являются различные клапана впуска и выпуска, а сам мотор остался прежним.

По предыдущему опыту концерна «АвтоВАЗ», чей двигатель ВАЗ-11189 был установлен на Гранте и Приоре в базовых комплектациях, этот силовой агрегат отлично проявлял себя в сборке с пятиступенчатой механической трансмиссией. Однако стоит учитывать, что размеры и, соответственно, вес Лады Весты довольно-таки существенно выше – а это значит, характеристики двигателя могут оказаться недостаточными.

На данном этапе конструкторы подумывают о том, чтобы отказаться оснащать седан Ладу Весту данным агрегатом. Если мощность двигателя, составляющая всего 87 лошадиных сил при объеме 1.6 литра, окажется действительно недостаточной, это может серьезно пошатнуть авторитет модели в целом.

ВАЗ-21129

Значительно большей мощностью и привлекательностью обладает модель двигателя ВАЗ-21129. В отличие от ВАЗ-11189, эта вариация при одинаковом объеме двигателя в 1.6 литра имеет мощность 106 лошадиных сил. Основное различие, приводящее к подобной разнице в мощности – это количество клапанов. На ВАЗ-11189 их всего восемь, а в данной версии – шестнадцать.

Этот двигатель новой Лады Весты, по всей вероятности, будет доступен уже в базовой комплектации, тогда как для Гранты и Приоры его устанавливали только в машины комплектации Люкс. Тем не менее, при учете большей массы Весты, максимальная скорость и разгон авто вряд ли будут более мощными и выраженными, чем у той же Приоры на ВАЗ-11189.

Доподлинно известно, что хэтчбек Лада Веста будет оснащаться силовыми агрегатами данного типа, и ВАЗ-21129 будет доступен уже при покупке модели «Классик» в комплекте с механической коробкой передач МКПП. В целом, двигатель хорошо проявляет себя в условиях российских дорог. Единственное, на что стоит обратить тщательно внимание – это ремень ГРМ: при его обрыве клапана двигателя могут быстро прийти в негодность. Если же не допускать подобных проблем – ресурс двигателя Лада Веста по долговечности достаточно велик.

Недостаток ВАЗ-21129 – это высокий уровень создаваемого шума, который, ко всему прочему, не всегда бывает ровным. После длительной эксплуатации двигатель даже в относительно хорошем состоянии может начать стучать и троить.

ВАЗ-21176

Наиболее мощным и производительным среди вазовских двигателей, устанавливаемых на Весту, является модификация ВАЗ-21176 (или – ее более продвинутая сборка 21179 1.8 литра). По всей видимости, именно этим двигателем будет оснащена спортивная Веста (если она будет выпускаться не только для гонок, но и для продажи простым обывателям), а также – долгожданный, обещанный конструкторами «АвтоВАЗ» полноприводный универсал Лада Веста Кросс.

По проверенным данным, данный двигатель будет идти в комплекте с роботизированной пятиступенчатой АКПП, что сделает укомплектованные автомобили более современными и удобными в управлении. Стоит отметить, что, вполне вероятно, этот двигатель будет ставиться на Ладу Весту в комплектации «Люкс».

Характеристики этого силового агрегата внушают уважение. Это единственный серийный двигатель 1.8 литра для Лады Весты, и он же считается самым мощным в линейке (в том числе – и по сравнению с зарубежными аналогами, но об этом позже). Его мощность составляет 122 лошадиных силы в заводской комплектации, однако ее можно повысить, установив некоторые дополнительные элементы (можно посмотреть на предложенном фото).

Естественно, что более высокий уровень мощности и больший объем довольно значительно увеличат расход топлива по сравнению с предыдущими моделями. Тем не менее, возможность развития большей максимальной скорости, более уверенный разгон и возможность резкого старта «со светофора» привлекает многих водителей больше, чем может оттолкнуть лишний литр-другой топлива на сотню километров пути.

HR16DE-h5M

При этом наивысшую цену будет иметь отнюдь не самый мощный двигатель. Дороже всех остальных в линейке будет стоить импортный двигатель, устанавливаемый на многие автомобили концерна Nissan, под маркировкой HR16DE-h5M.

Стоит сразу обозначить технические характеристики двигателя HR16 для Весты. Он имеет объем, схожий с «младшими» версиями вазовских двигателей – 1.6 литра, однако мощность его составляет 114 л.с. – двигатель отнюдь неплох. Даже из достаточно тяжелого автомобиля (каким, несомненно, стоит считать Весту благодаря ее солидным размерам, приближенным к классу C) такой агрегат способен сделать достаточно мобильный и скоростной автомобиль – что, несомненно, очень важно как для городских жителей, так и для часто выезжающих за город водителей.

Стоит отметить высокий уровень надежности этого двигателя. По оценкам автомобильных экспертов, ресурс его долговечности при бережном использовании и регулярном ТО практически в полтора раза выше, чем на стандартном вазовском агрегате того же объема.

Данный двигатель планируется к установке на купе Лада Веста – автомобиль благодаря нему приобретет экспрессию и некоторые претензии на спортивность.

Будет ли Лада Веста поставляться в продажу с возможностью установки дизельного двигателя – пока не совсем ясно. Дизельные двигатели более экономичны – следовательно, над этим вопросом конструкторы завода должны так или иначе задуматься.

Неясен лишь один момент: будет ли устанавливаться на Ладу Весту двигатель ВАЗ-11189, или же его использование окончательно признают не имеющим особого смысла? По мнению многих авторитетных автомобильных экспертов, 87 лошадиных сил для габаритов Весты – это действительно несерьезно, и по этой причине, скорее всего, ВАЗ-21129 будет самым «младшим» двигателем, использованным для комплектаций «Классик» и «Комфорт».

АвтоВАЗ анонсировал Lada XRAY с вариатором Jatco и двигателем Renault

До настоящего времени «АвтоВАЗ» оснащал XRAY «вазовским» двигателем объемом 1,8 литра, развивающий мощность 122 л.с., в сочетании с 5-ступенчатой механической коробкой передач.

Lada XRAY с новым мотором от Рено и вариатором Jatco JF015E

Но, 15 апреля 2019 года российский автопроизводитель получил «Одобрение Типа Транспортного Средства» (ОТТС) на установку японского вариатора Jatco JF015E и двигателя Renault h5M (он же  Nissan HR16DE). Получение отечественным производителем данного ОТТС дает производителю «зеленый свет» на изготовление и реализацию авто в данной модификации. Это позволяет сделать потребителям вывод, что новая модель XRAY вскоре появится на российском рынке.

Новый вариатор, которым производитель планирует оснащать XRAY, знаком нам и давно обкатан на таких автомобилях, как Renault Kaptur, Renault Fluence, а также Nissan Juke и Nissan Qashqai.

Главной особенностью данного вариатора является то, что, по своей сути, это «двухступенчатый» автомат – его повышающая передача позволит уменьшить расход топлива, а гидротрансформатор поможет сгладить все «недостатки» вариатора. Примечательно, также, что ресурс данного силового агрегата составляет «не менее 250 000 км», что не может не радовать рядового потребителя «АвтоВАЗа»!

Что касается двигателя, он нам также уже знаком, он устанавливался на XRAY в период с конца 2015 года по июль 2016г. Данная модель двигателя успешно устанавливается и на большую часть автомобилей марки Renault. Благодаря удачной конструкции данного вида двигателей, использующей цепной привод ГРМ, широкой распространенности данной модели двигателя в автомобилях, уже зарекомендовавших себя на рынке, в надежности данного силового агрегата сомнений не остается.

Мнения потребителей уже успели разделиться традиционно на два лагеря: одни – считают, что в использовании данных агрегатов нет смысла, другая же часть поддерживает отечественного производителя. Как бы то ни было, данные улучшения, позволят ВАЗу не только увеличить количество продаж, за счет создавшегося ажиотажа вокруг этой модели, но и создать действительно надежный автомобиль, который придется по вкусу многим.

На данный момент «АвтоВАЗ» выпустил только пилотный образец модифицированного российского кроссовера XRAY, но планируется, что уже летом 2019 года производитель порадует нас стартом серийного выпуска новой версии Lada XRAY, а уже к концу 2019 года такиv сочетанием агрегатов будет оснащаться и Lada Vesta.

Новый мотор ВАЗ 1,8 литра: на какие модели Lada он пойдёт и сколько из него можно «выжать»


Чтобы обеспечить нормальное питание этого насоса, диаметр трубки маслозаборника был увеличен с 15 до 20 мм. У масляного картера особая геометрическая форма, и теперь в затяжных быстрых поворотах система смазки менее склонна к отливам масла от маслозаборника, его «оголению», изъятию неотстоявшегося вспененного масла – это тоже повышает надёжность работы всех механизмов, которые используют масло под давлением.

Масляный поддон обеспечивает больший запас масла: у базового мотора объём составлял 3,2 л, у нового – 4,4 л. Таким образом, уменьшилась частота прокачки масла через двигатель, масло успевает лучше «отдохнуть», охладиться, и, соответственно, дольше сохраняет свойства, т.к. скорость срабатывания в нём присадок уменьшилась.

Поставщики

На сегодняшний день те компании, которые производят двигатели, самостоятельно изготавливают всего четыре-семь базовых деталей: блок, головка блока, коленвал, маховик… Всё остальное заказывается у профильных фирм – это удобно технически и выгодно экономически. В СССР автозаводы являли собой подобие «натурального хозяйства», когда абсолютное большинство деталей выпускалось в пределах предприятия. АВТОВАЗ, конечно, уже отошёл от этой схемы.

Но на данный момент солидная часть поставщиков комплектующих для нового мотора – иностранные. Почему? Когда проект стартовал, никто подобного не предполагал, экономическая ситуация складывалась по-другому. Сейчас же к решениям, аналогичным принятому по водяному насосу, подталкивает сама жизнь. Многие иностранные комплектующие в будущем постараются локализовать в России. Ведь об этом сказано и в перечне поручений Президента России, на основании которых сформирована стратегия развития автопрома. А на самом АВТОВАЗе традиционно делаются: головка блока цилиндров, крышка головки, корпус подшипников, блок цилиндров, коленчатый вал и масляный картер.

Но и поставщиков из числа российских немало, вот лишь некоторые: шкив выпускного распредвала ООО ДЗПМ (г. Димитровград), гидротолкатели ОАО «Стар» (Пермь), демпфер крутильных колебаний SLON (СК «Промавто», г. Артёмовский), вкладыши коленвала «Дайдо Металл Русь» (бывший ЗМЗ, старый поставщик АВТОВАЗа), катколектор «Экоальянс» (г. Новоуральск), пластмассовый модуль впуска «Мотор-Супер» (г. Тольятти), катушки зажигания делают несколько отечественных компаний.

Мелкие детали – маслозаборник, указатель уровня масла, держатель сальника, кронштейны – также имеют российское происхождение. А шатунно-поршневая группа хоть и от Federal Mogul, но производство по большей части тоже российское: отливка делается в Набережных Челнах, мехобработка ведётся в Тольятти, и только шатун пока привозной – из Индии. Но в целом объём российских комплектующих в новом моторе – более 50%.

Возможности форсировки

Понятно, что новый мотор очень ждали спортсмены, и его гоночные модификации мы будем категорически приветствовать. По собственной информации редакции, в официальном тюнинговом ателье АВТОВАЗа Lada Sport уже начали работать в этом направлении. Но поговорим о серийной продукции: сколько можно снять с этого мотора, если готовить некую «заряженную» версию одной из моделей – скажем, Vesta Sport? Один из вариантов поднятия отдачи – уже упомянутый второй «фазер», на выпускном распредвалу – он хоть и в меньшей степени, но тоже влияет на мощностные характеристики. В основном же второй «фазер» дает экономичность, и в итоге это явно не самый простой, доступный и действенный вариант форсировки.

Есть резервы и по снижению сопротивления системы выпуска. Сейчас у газоприёмника очень короткие каналы, они хороши в плане экологии: максимум вредных выбросов из мотора идёт в первые минуты работы, и поэтому каталитический нейтрализатор важно максимально быстро прогреть. Поэтому его в ходе эволюции систем контроля токсичности стали сдвигать из-под пола автомобиля ближе к двигателю, в результате чего и появился термин «катколлектор», который соединил в себе катализатор и выпускной коллектор.

Однако короткие каналы катколлектора создают негативное влияние одного цилиндра на другой – потоки отработанных газов из разных цилиндров смешиваются, и в газоприёмнике возникают перепады давления и «турбулентность», что снижает общую скорость потока. Но можно сделать каналы более длинными (применить нечто подобное тому, что на спортивном сленге называется «паук» или «штаны»), а снизившуюся «экологию» (катализатор ведь теперь не сможет сразу нейтрализовать вредные выбросы) отыграть с помощью системы VVT. Схема реализуемая, главные вопросы – в компоновке.


Одномолекулярная динамика FRET молекулярных двигателей в ловушке ABEL

Основные моменты

Сочетает перенос энергии резонанса Фёрстера одиночной молекулой с ограничением молекул.

Антиброуновское электрокинетическое улавливание обеспечивает время наблюдения до 6 с.

Наблюдает события конформационного переключения молекулярного двигателя Rep с разрешением по времени 1 мс.

Моделирование электрического потенциала в микросхеме микрофлюидики.

Скрытый марковский анализ траекторий резонансной энергии Фёрстера одиночных молекул.

Abstract

Одномолекулярный резонансный перенос энергии Фёрстера (smFRET) молекулярных двигателей обеспечивает трансформирующее понимание их динамики и конформационных изменений одновременно с высоким временным и пространственным разрешением. Однако ключевая задача таких исследований FRET состоит в том, чтобы наблюдать молекулу в действии достаточно долго, не ограничивая ее естественную функцию.Антиброуновская электрокинетическая ловушка (ловушка ABEL) предназначена для комбинирования smFRET с ограничением молекул, чтобы обеспечить время наблюдения до нескольких секунд, устраняя при этом любое требование привязанного поверхностного прикрепления рассматриваемой молекулы. Кроме того, присущая ловушке ABEL способность избирательно захватывать активные молекулы FRET ускоряет процесс сбора данных. В этой работе мы проиллюстрируем возможности ловушки ABEL в выполнении измерений smFRET в расширенном временном масштабе на молекулярном двигателе Rep, что имеет решающее значение для удаления белковых блоков перед прогрессирующим механизмом репликации ДНК и для перезапуска застопорившейся репликации ДНК.Мы можем контролировать отдельные молекулы Rep до 6 секунд с разрешением по времени менее миллисекунды, фиксируя множественные события конформационного переключения в течение времени наблюдения. Здесь мы предлагаем пошаговое руководство по рациональному проектированию, созданию и реализации ловушки ABEL для smFRET обнаружения Rep in vitro . Мы включаем подробную информацию о том, как моделировать электрический потенциал в месте ловушки, и использовать скрытый марковский анализ траекторий smFRET.

Ключевые слова

Ловушка ABEL

Одномолекулярный FRET

Rep

Электрокинетический захват

Скрытое моделирование Маркова

Рекомендуемые статьи Цитирующие статьи (0)

Полный текст

© 2021 Elsevier Inc.Все права защищены.

Рекомендуемые статьи

Ссылки на статьи

Одномолекулярная динамика FRET молекулярных двигателей в ловушке ABEL

Реферат

Одномолекулярный резонансный перенос энергии Ферстера (smFRET) молекулярных двигателей обеспечивает трансформирующее понимание их динамики и конформационных изменений. одновременно с высоким временным и пространственным разрешением. Однако ключевая задача таких исследований FRET состоит в том, чтобы наблюдать молекулу в действии достаточно долго, не ограничивая ее естественную функцию.Антиброуновская электрокинетическая ловушка (ловушка ABEL) предназначена для комбинирования smFRET с ограничением молекул, чтобы обеспечить время наблюдения до нескольких секунд, устраняя при этом любое требование привязанного поверхностного прикрепления рассматриваемой молекулы. Кроме того, присущая ловушке ABEL способность избирательно захватывать активные молекулы FRET ускоряет процесс сбора данных. Здесь мы проиллюстрируем возможности ловушки ABEL в выполнении измерений smFRET в расширенном временном масштабе на молекулярном двигателе Rep, что имеет решающее значение для удаления белковых блоков перед прогрессирующим механизмом репликации ДНК и для перезапуска застопорившейся репликации ДНК.Мы можем контролировать отдельные молекулы Rep до 6 с с разрешением по времени 1 мс, фиксируя множественные события конформационного переключения в течение времени наблюдения. Здесь мы предлагаем пошаговое руководство по рациональному проектированию, созданию и реализации ловушки ABEL для smFRET обнаружения Rep in vitro . Мы включаем подробную информацию о том, как моделировать электрический потенциал в месте ловушки, и использовать скрытый марковский анализ траекторий smFRET.

1. Введение

Область биофизики одиночных молекул находится на переднем крае современных научных инструментов, позволяя описывать самые строительные блоки человеческой жизни с деталями, намного превосходящими те, которые получаются с помощью ансамблевых методов [1].Несмотря на то, что ансамблевые измерения быстрые и эффективные, они всегда дают усредненную картину, а переходные промежуточные конформации и динамика часто скрыты. Извлечение значимых данных из отдельных молекул в сложных жидких средах по своей сути является сложной задачей, но предлагает вознаграждение в виде доступа к молекулярной динамике, функции белков и молекулярной гетерогенности [2, 3]. Инструменты флуоресцентной микроскопии оказались неоценимыми для извлечения деталей на молекулярном уровне [4], при этом конфокальная микроскопия и микроскопия полного внутреннего отражения (TIRF) в сочетании с переносом энергии Ферстера (FRET) в настоящее время являются наиболее распространенными методами [5].Однако необходимо сделать выбор между исследованием свободно диффундирующих молекул в течение изначально короткого времени наблюдения или продлением этого времени наблюдения за счет потенциального нарушения биологической функции путем прикрепления молекул к поверхности в микроскопии TIRF. Тесты прикрепления работают для некоторых систем, но поиск комбинации FRET и меток прикрепления, которые не препятствуют функционированию рассматриваемой молекулы, является нетривиальной задачей [6, 7].

Для устранения этих ограничений и наблюдения за белками и молекулярными двигателями в действии в последнее десятилетие набирает силу растущая область исследований, посвященных разработке удержания одиночных молекул [8–10].Задача состоит в том, чтобы контролировать отдельный белок - обычно с эффективным диаметром 5-10 нм - достаточно долго, чтобы обнаруживать конформационные изменения в течение одного цикла реакции его естественной функции, избегая при этом необходимости иммобилизации поверхности. Белок диффундирует в 10 раз быстрее, чем типичный вирус, например, потому что скорость его броуновской диффузии обратно пропорциональна его гидродинамическому радиусу, как моделируется соотношением Стокса-Эйнштейна. Кроме того, одиночные молекулы обычно маркируются только одним флуорофором, таким образом выделяя ограниченное количество фотонов для сбора.Таким образом, ключевыми задачами являются: 1) обнаружение быстро движущейся молекулы с временным разрешением менее миллисекунды, 2) удержание ее на месте в пределах области пространства, эффективный масштаб длины которой составляет менее микрометра, и 3) регистрация конформации. изменения, а также другие молекулярные свойства. В настоящее время наиболее многообещающие ловушки для одиночных молекул - это антиброуновская электрокинетическая ловушка (ABEL-ловушка) [11–14], геометрическая электростатическая ловушка для жидкости [15] и оптическая ловушка с самоиндуцированным обратным действием (SIBA) [16].Только первые два метода продемонстрировали удерживание в растворе молекул размером с отдельные флуорофоры.

В дополнение к ограничению одиночной молекулы в области наблюдения, ловушка ABEL обеспечивает доступ к фотофизическим свойствам флуоресцентных меток и облегчает гидродинамическое профилирование отдельных молекул [17–19]. Измерение константы диффузии молекулы D и электрокинетической подвижности μ позволяет нам наблюдать связывание отдельных молекул с ДНК [11, 14].Регистрация яркости флуоресценции, времени жизни, анизотропии и спектральной информации позволила изучить индуцированные светом конформационные изменения и эффекты олигомеризации белка фотосинтетической антенны аллофикоцианина [19, 20], комплекса пигмент-антенная антенна C-фикоцианин [21], а также выделить между одно- и двухцепочечными молекулами ДНК в смеси [22]. Ловушка ABEL оказалась отличным инструментом для исследования окислительно-восстановительного цикла в мульти-медном ферменте bNiR [23] и гидролиза АТФ в мульти-субъединичном ферменте TRiC [24] посредством изменения интенсивности флуоресценции.Комбинация FRET и ABEL захвата одной молекулы предлагает новый подход к доступу к динамике изменений конформации, связанных с отдельными молекулами, с точностью, близкой к дробовому шуму [25]. Это особенно многообещающе для мониторинга динамики субъединиц молекулярных моторов.

Здесь мы исследуем конформационную динамику одиночных Rep молекул в самодельной ловушке ABEL (Figure 1). Молекулярные моторы геликазы необходимы во всех аспектах метаболизма нуклеиновых кислот, гидролизующих нуклеозидтрифосфаты (NTP) (обычно АТФ), чтобы генерировать энергию для направленной транслокации вдоль цепи нуклеиновой кислоты [26–28].Транслокация обычно происходит в одну или две основные стадии на гидролиз каждого нуклеотидтрифосфата, нарушая водородную связь между комплементарными основаниями на каждой стадии [29, 30]. Нуклеиновые кислоты in vivo связываются белками, которые должны одновременно удаляться во время разделения цепи [31], что делает процесс намного более сложным, чем простое нарушение спаривания оснований. Геликазы способны использовать избыточную свободную энергию, полученную в результате гидролиза NTP и разделения пар оснований, для создания силы, чтобы проталкивать белки вдоль ДНК [32–35].Обычно предполагалось, что таким образом белки вытесняются из ДНК, однако фактический метод вытеснения белков еще предстоит выяснить. Чтобы осуществить транслокацию, геликазы претерпевают молекулярные конформационные изменения, и поэтому являются хорошими экспериментальными образцами для оптимизации биофизических методов, которые предназначены для изучения переключения между различными молекулярными состояниями.

Рис. 1. Схема ловушки ABEL.

Флуоресценция, испускаемая захваченной молекулой Rep в конфокальной ловушке ABEL, обеспечивает сигнал FRET и информацию о положении молекулы.Это основа для расчета напряжения обратной связи, необходимого для создания электрофоретической силы, которая толкает молекулу в центр ловушки.

Дополнительные репликативные геликазы необходимы в клетках для того, чтобы облегчить прогрессию бактериального аппарата репликации, называемого реплисомой [36], посредством нуклеопротеиновых комплексов, которые в противном случае блокировали бы репликацию [37-43]. Rep представляет собой вспомогательную репликативную геликазу в бактериях Escherichia coli , которая удаляет белковые блоки репликации ДНК, связанные с ДНК, а также помогает перезапустить остановившийся механизм репликации [44].Он содержит четыре субдомена (1A, 2A, 1B и 2B), из которых 2B может вращаться вокруг шарнирной области, обеспечивая значительные конформационные изменения в белке [27, 28, 45–50] (см. Рисунок 2a, b). Как хеликаза 1A суперсемейства, Rep имеет 3’-5 ’направленность и, как таковой, вероятно, смещает комплексы нуклеопротеидов перед продвигающейся репликационной вилкой на матрице ведущей цепи ДНК [37, 39].

Рис. 2. Кристаллические структуры Rep Helicase.

Rep содержит 4 субдомена: 1A (желтый), 1B (зеленый), 2A (пурпурный) и 2B (синий).Видно, что в его кристаллических структурах Rep занимает как а) открытую, так и б) закрытую конформацию, в которой субдомен 2B повернулся примерно на 130 ° [48]. Расположение прикрепленных красителей - Alexa Fluor 546 и Alexa Fluor 647 -, используемых в этом исследовании, обозначено оранжевыми и пурпурными звездами соответственно. Размещение красителей в положениях A97C и A473C через малеимидную связь позволяет использовать FRET в качестве линейки наноразмеров для измерения расстояния между остатками на субдоменах 1B и 2B.

Ключевыми факторами в определении эффективности репликации ДНК являются частота и продолжительность паузы реплисом и заикания. Доступ к движению и динамике геликазы с помощью FRET в качестве линейки наноразмеров обеспечивает доступ к этим величинам на основе отдельной молекулы. В частности, маркировка Rep в положениях 97 (субдомен 1B) и 473 (субдомен 2B) донором (например, Alexa Fluor 546) и акцептором (например, Alexa Fluor 647) дает возможность обнаруживать конформационные переходы в субдомене 2B.Эти измерения с высоким разрешением потенциально раскрывают правила перехода субдомена Rep 2B между открытыми и закрытыми состояниями, количество состояний и то, сдвигает ли присутствие кофакторов конформационное состояние. На сегодняшний день эти типы измерений требуют иммобилизации геликазы на субстрате [49], что, по нашему собственному опыту, может привести к нарушению функциональной активности, а также к возникновению искусственных фотофизических эффектов из-за близости к поверхности. Напротив, улавливание Rep-молекул в ловушку ABEL позволяет проводить измерения smFRET вдали от любых границ раздела в растворе в течение продолжительных периодов времени.

Здесь мы описываем протокол для создания и реализации ловушки ABEL для идентификации множества конформационных состояний в молекулярной машине, на примере отдельных молекул Rep с использованием smFRET. Мы ожидаем, что эта процедура может открыть платформу для исследования мутаций Rep в частности, а также динамических молекулярных машин и их взаимодействия в растворе в целом.

2. Методы и материалы

2.1 Очистка и маркировка Rep

Ген rep , лишенный всех нативных остатков цистеина и с ненативными цистеинами, введенными вместо аланина 97 и аланина 473, был клонирован в pET14b таким образом, чтобы он находился в рамка с гекса-гистидиновым тегом, создавая плазмиду pJLh235.Rep был сверхэкспрессирован и очищен с использованием pJLh235, как ранее было опубликовано для WT с his-tagged Rep [51]. Короче говоря, белок был сверхэкспрессирован из E. coli с использованием 0,2% арабинозы при 20 ° C в течение двух часов перед тем, как полученный осадок клеток хранился при -80 ° C. Осадок клеток лизировали перед осаждением Polymin P и сульфата аммония. Полученный супернатант затем очищали с использованием 5 мл неочищенной колонки HisTrap FF и 3 мл колонки с гепарин-агарозой. Затем белок маркируется следующим образом:

  1. Собирают фракции, содержащие чистый Rep, и восстанавливают в течение двух часов при 4 ° C, добавляя 5 мМ трис (2-карбоксиэтил) фосфин гидрохлорид (TCEP).

  2. Добавить сульфат аммония до 70% насыщения при перемешивании при 4 ° C. Продолжайте перемешивать еще 10 минут.

  3. Полученный осадок осаждают центрифугированием при 18000 g в течение 20 минут при комнатной температуре. Ресуспендируйте осадок в дегазированном буфере для маркировки (100 мМ фосфат натрия pH 7,3, 500 мМ хлорид натрия, 20% (об. / Об.) Глицерин).

  4. Alexa Fluor 546 C 5 Maleimide и Alexa Fluor 647 C 2 Maleimide (оба Invitrogen A10258 и A20347 соответственно) растворяли в безводном диметилсульфоксиде (DMSO) и смешивали в эквимолярных количествах.

  5. Добавить смешанные красители к Rep при 5-кратном молярном избытке при перемешивании путем встряхивания при комнатной температуре в течение 30 минут. Реакцию мечения гасят добавлением 10 мМ 2-меркаптоэтанола и встряхивание продолжают еще 10 минут.

  6. Свободный краситель отделяют от меченого Rep с использованием 1 мл неочищенной колонки HisTrap FF. Колонку уравновешивают буфером A (20 мМ Трис-HCl pH 7,9 и 500 мМ NaCl, 20% (об. / Об.) Глицерина) + 5 мМ имидазол перед загрузкой смеси краситель / белок.

  7. Промойте колонку 20 мл буфера A + 5 мМ имидазол перед ее проявлением с градиентом 20 мл от буфера A + 5 мМ имидазола до буфера A + 500 мМ имидазола.

  8. Соберите фракции пиков, содержащие меченый Rep и пул, аликвотируйте и храните при -80 ° C в 20 мМ Трис-HCl pH 7,9 и 500 мМ NaCl, 30% (об. / Об.) Глицерине.

Все химические вещества были приобретены у Sigma Aldrich, если не указано иное.

2.2 Подготовка чипа

Микрофлюидный чип играет центральную роль в удерживании образца, содержащего молекулы Rep в растворе, и создании электрического поля для захвата AEBL.В зависимости от типа эксперимента есть два варианта. Первый заключается в использовании микрожидкостных чипов из кварца или плавленого кварца [14, 52], второй - в чипе из PDMS (полидиметилсилоксанового эластомера) с рисунком, прикрепленном к стандартному покровному стеклу микроскопа [18, 53–56].

Кварцевые чипы имеют отличное соотношение сигнал / шум, поскольку фон от автофлуоресценции в кварце значительно ниже по сравнению со стандартными стеклянными покровными стеклами. Это особенно важно для экспериментов, исследующих флуоресценцию в УФ-области спектра.Производство кварцевой крошки относительно дорогое, поэтому ее часто очищают и повторно используют многократно. Это лучший вариант для статических экспериментов, не требующих замены аналитов или субстратов. Для большинства экспериментов необходима пассивация поверхности путем нанесения многослойного покрытия для предотвращения адсорбции молекул на кварцевые стенки до загрузки чипа образцом [57].

Самым большим преимуществом микросхем PDMS является простота использования. Их быстрое и дешевое воспроизведение делает их одноразовыми, поэтому нет необходимости в агрессивных процедурах очистки.Что еще более важно, до процесса соединения покровное стекло и микросхема PDMS находятся в вакууме для плазменного травления. Этот этап вакуумирования удаляет весь накопленный кислород или другие газы из микросхемы PDMS. Затем PDMS может реабсорбировать пузырьки воздуха, образующиеся при заполнении чипа аналитом. Чипы PDMS особенно подходят для экспериментов, которые требуют динамической замены раствора образца свежими субстратами, а не использования статической буферной среды. Чтобы обойти повышенную автофлуоресценцию от стекла и PDMS, предварительные этапы отбеливания с интенсивным источником УФ-света или планирование эксперимента с флуорофором вдали от синего конца спектра делают этот подход возможным.

2.2.1 Изготовление микрожидкостного чипа и подготовка к эксперименту

В этом эксперименте мы использовали чип из PDMS, прикрепленный к стандартному покровному стеклу микроскопа (24 × 32 мм, Roth, толщина # 1), как показано на рисунке 3. Мы приобрели пластина-маска по индивидуальному заказу (IPHT Jena) с желаемыми размерами и рисунком на 26 чипов диаметром 1,5 см каждый. Микрожидкостная структура отпечатана в чипе PDMS, состоящем из четырех каналов глубиной 40 мкм, по которым доставляются образец и аналит, а также электрическое поле.4 канала соединяются в центральной зоне захвата размером 120 мкм в поперечнике с высотой 600 нм, как было измерено ранее [18]. На рисунке 3 показаны другие размеры и микросхема. Затем мы готовим микросхемы микрофлюидики следующим образом.

  1. Смешайте PDMS с поставляемым отвердителем (набор эластомеров Sylgard 184, Dow Corning) и удалите пузырьки воздуха из смеси, поместив ее в вакуум на несколько минут. Для ускорения процедуры удаления воздуха и предотвращения выкипания может потребоваться несколько циклов вентиляции / вакуумирования.

  2. Ополаскиваем маску Waver только деионизированной водой и осторожно сушим продувкой азота. Мы прикрепляем вибратор маски ко дну чашки Петри с каплей PDMS перед тем, как вылить PDMS на маску, стараясь избежать образования пузырьков. PDMS можно отверждать при комнатной температуре (24 часа) или термоотверждать. Выпекаем маску + ПДМС 4 ч при 75 ° С.

  3. После охлаждения до комнатной температуры мы снимаем затвердевший ПДМС с маски и разрезаем его на отдельные микрожидкостные чипы.Для каждого чипа требуется 4 отверстия в глубине PDMS, чтобы удерживать платиновые электроды, создающие электрическое поле, которое мы аккуратно вдавливаем заостренной иглой для инъекций.

Рисунок 3. Процесс изготовления микросхемы.

a) Пластина маски служит шаблоном, содержащим 26 идентичных рисунков микрожидкостных микросхем, каждый примерно 1,5 см в диаметре. б) Покрытие маски PDMS передает функции маски PDMS. Каналы глубиной 40 мкм ведут к мелкой зоне захвата 600 нм, доставляя аналит и электрическое поле к центру.c) Закаленный PDMS вырезан по форме с добавленными отверстиями для Pt электродов. г) Последующее прикрепление чипа PDMS к покровному стеклу микроскопа закрывает все микрофлюидные каналы, оставляя отверстия для электродов, чтобы заполнить чип и вставить электроды. д) Фотографии, показывающие пластину маски, микроскопическое изображение зоны захвата в центре чипа с единственным фокусом лазера и готовый чип, прикрепленный к покровному стеклу микроскопа.

После резки и штамповки стружки мы очищаем и собираем их следующим образом.

  1. Мы встряхиваем чипы PDMS в ацетоне в течение одной минуты, промываем их деионизированной водой и сушим продувкой азотом. Для большинства экспериментов достаточно двух циклов промывки покровных стекол микроскопа изопропанолом и деионизированной водой с последующей сушкой с продувкой азотом, но на этом этапе возможна более тщательная очистка [58].

  2. И чип, и покровное стекло - затем оставьте в вакууме в течение 10 минут перед плазменным травлением в течение одной минуты. Плазменное травление удаляет метильные группы с поверхности PDMS и заменяет их гидроксильными группами.Это изменяет поверхность с гидрофобной на гидрофильную и облегчает процесс связывания ПДМС со стеклом [59].

  3. После извлечения микросхемы и покровного стекла из вакуума мы непосредственно помещаем чип PDMS поверх покровного стекла для склеивания.

  4. Микрофлюидный чип готов к экспериментам. Заполнение образца в чип сразу после этапа вакуумирования позволяет использовать способность PDMS поглощать пузырьки воздуха, избегая необходимости в сложных насосных системах.

2.3 Ловушка ABEL

2.3.1 Основной принцип и моделирование электрического поля

Основной принцип ловушки ABEL основан на электрофорезе: создание электрофоретической силы для перемещения молекулы с зарядом q по желаемому пути путем экспонирования это к пространственно однородному электрическому полю. Полная электрокинетическая сила представляет собой комбинацию электрофоретических и электроосмотических сил, действующих на поверхностный заряд молекулы или всего буферного раствора соответственно.В отличие от диэлектрофореза [60, 61], электрофорез является полевым эффектом первого порядка и поэтому особенно подходит для приложения сил к заряженным наноразмерным объектам. Мы моделируем электрическое поле для нашей конкретной геометрии чипа, чтобы оценить его однородность по всей области захвата. Это вызывает необходимость в инструменте моделирования электродинамики, доступном далеко не каждому. Мы предлагаем альтернативный подход, использующий известную математическую аналогию между электростатикой и установившейся теплопроводностью [62].Большинство инструментов анализа методом конечных элементов включают анализ теплопроводности в качестве стандартной функции, неявно предоставляя инструменты для моделирования электрического поля. Следовательно, это открывает возможность оптимизировать геометрию чипа для определенного распределения поля по участку ловушки. Мы демонстрируем этот метод с помощью ANSYS Workbench для 2D-горизонтальной плоскости через ловушку.

Аналогия между электростатикой и теплопроводностью очевидна, но мы подчеркиваем, что это математическая, а не физическая аналогия.В таблице 1 представлен обзор того, как мы заменили электростатические переменные теплопроводности. Помимо замены закона Гаусса на закон термодинамики 1 st , необходимо также учитывать граничные условия на границах раздела материалов. В частности, нормальные компоненты электрического смещения и электрического потенциала φ должны быть непрерывными, что мы переводим на постоянную температуру T и нормальные компоненты теплового потока через границы раздела фаз.Мы приняли следующий рабочий процесс:

  1. Расчетная геометрия с указанием областей электродов, PDMS и буферного раствора

  2. Установка граничных условий: установка значений температуры в положениях электродов, которые соответствуют приложению напряжения к электродам

  3. Моделирование температурного поля, которое соответствует электрическому потенциал

  4. Рассчитайте электрическое поле согласно и получите соответствующие силовые линии на этапе постобработки в MATLAB

Таблица 1.Аналогия между электростатикой и теплопроводностью.

Результаты моделирования электрического поля в нашей ловушке ABEL представлены на рисунке 4 с типичными напряжениями обратной связи ± 1 В и электрической проницаемостью ε r = 3 для PDMS, ε r = 80 для воды и ε r. = 1 для воздуха. Сначала мы рассмотрим одномерный случай приложения напряжения обратной связи +1 В на левом электроде и -1 В на правом электроде (верхний ряд рис. 4). Это создает электрическое поле, которое является однородным в центральной области захвата, как показывают параллельные силовые линии (белые).На практике напряжение обратной связи прикладывается в направлениях x и y одновременно с наложением результирующих электрических полей. Пример показан в нижнем ряду рисунка 4: мы прикладываем ± 1 В в направлениях x и y, что приводит к диагональному однородному электрическому полю (параллельные силовые линии в центре ловушки), подходящему для приложения силы к заряженной молекуле в обоих направлениях. x и y одновременно.

Рис. 4. Моделирование электрического поля внутри ловушки ABEL.

a) Напряжение обратной связи устанавливается равным +1 В и -1 В по направлению x, что приводит к однородному электрическому полю в области захвата, как показано крупным планом центральной области, показанной на b).c) Однородные электрические поля вдоль направлений x и y накладываются друг на друга, что приводит к диагонально ориентированным параллельным силовым линиям в зоне захвата для одновременного приложения ± 1 В по x и y (увеличенное изображение показано на d).

2.3.2 Улавливание обратной связи и приборы

Мы реализовали ловушку ABEL в конфигурации smFRET конфокального объема лазерного возбуждения, добавив специально созданный блок лазерного сканирования для управления лучом и микрожидкостный чип (описанный в разделе 2.2.1) с платиновыми электродами. для доставки электрического поля к ловушке.В основе нашей установки лежит программируемая вентильная матрица (FPGA 7852R, National Instruments): система управления с обратной связью в реальном времени, запускающая лазерное сканирование и вычисление необходимых напряжений обратной связи для захвата молекулы в соответствии с ее положением. Лазер возбуждения в ловушке ABEL перемещается по заранее заданному шаблону, большему, чем фокус луча, чтобы определить положение молекулы для захвата. Из-за степени и скорости броуновского движения белков и объектов размером менее ~ 100 нм отслеживание с помощью видеокамеры происходит слишком медленно [13, 52].Стандартная конфокальная система определяет наличие флуоресцентной молекулы в фокусном объеме возбуждающего луча, но предел разрешения не позволяет нам узнать ее точное положение. Создание нескольких участков обнаружения, разбросанных в пространстве с помощью лазерного сканирования, позволяет нам получить доступ к местоположению рассеивающейся молекулы, сохраняя при этом отличное соотношение сигнал / шум конфокальной системы. Поскольку зарегистрированные флуоресцентные фотоны и выполнение лазерного смещения имеют временную метку, мы можем определить положение молекулы в месте захвата (рис. 5).

Рисунок 5: Основной принцип ловушки ABEL.

Лазер сканирует заранее заданный 32-точечный шаблон с частотой 7 кГц (по 4,5 мкс в каждой точке), в то время как фотоны флуоресценции с меткой времени, исходящие из этой области сканирования, предоставляют информацию о положении молекулы для захвата. ПЛИС управляет лазерным сканированием, оценивает положение молекулы с помощью фильтра Калмана и отправляет необходимые напряжения обратной связи, чтобы уловить молекулу в центре диаграммы сканирования. Внизу слева показана рассчитанная усредненная по времени картина интенсивности для всего участка ловушки.

Для того, чтобы ловушка ABEL работала с одиночными молекулами, определение положения, основанное только на положении лазера, недостаточно точно; перетяжка лазерного фокуса имеет поперечный диаметр, который на два порядка больше, чем типичный эффективный диаметр захваченной молекулы, и молекула также продолжает совершать броуновское движение между этапами сканирования. Увеличение скорости сканирования ограничено характеристиками блока управления лучом (см. Раздел 2.3.1) и отношением сигнал / шум. Уменьшение скорости сканирования улучшает отношение сигнал / шум до точки, где размытость движения становится очевидной [63].Для достижения требуемой точности определения местоположения мы реализовали фильтр Калмана [11, 64]: стандартный инструмент для измерения зашумленных данных в сочетании с известной динамикой системы - в нашем случае броуновским движением и электрокинетическим откликом. Этот фильтр оценивает положение молекулы в ловушке ABEL на основе обнаруженных фотонов, положения лазера и предсказания броуновского движения молекулы с учетом ее предполагаемого коэффициента диффузии D и электрокинетической подвижности μ. Затем фильтр взвешивает информацию о местоположении необработанных данных (количество фотонов) с оценкой местоположения на основе транспортных параметров ( D, и μ) для прогнозирования обновленной оценки местоположения (рисунок 5).Чтобы преодолеть ограничения фильтра Калмана по фиксированным параметрам модели ( D , μ), можно расширить его, используя инновационное отбеливание, включая фоновый шум с оценкой максимального правдоподобия, и, таким образом, достичь полного онлайн-определения D и μ [14, 65].

Детали нашего оборудования следующие (Рисунок 6):

Рисунок 6. Схема установки светового микроскопа с реализованной ловушкой ABEL. Телескопы

(L1-L6) переключают плоскости сопряжения и регулируют диаметр луча перед попаданием в линзу объектива (O).Вверху слева: управление лучом лазерного возбуждения, нижнее синее поле: обнаружение однофотонной флуоресценции

Линейно поляризованный луч непрерывного возбуждения с длиной волны 532 нм проходит полуволновую пластину и куб светоделителя (AHWP05M-600, PBS201, Thorlabs) для регулировки мощности лазера. до 20 мкВт перед попаданием в электрооптические дефлекторы (EOD, M310A, Conoptics), создающие шаблон сканирования в месте ловушки. Дихроичный светоделитель (z 532 RD, AHF) внутри корпуса промышленного инвертированного микроскопа (IX71, Olympus) направляет возбуждающий лазер в линзу объектива микроскопа (60x, масляная иммерсия, PlanApo N, NA 1.42, UIS2, Olympus), позволяя возвращающейся флуоресценции одновременно проходить на путь детектирующего луча. Точечное отверстие 300 мкм (P300D, Thorlabs) в первой плоскости изображения после линзы трубки больше по сравнению со стандартной конфокальной установкой, чтобы не отрезать какой-либо расширенный шаблон лазерного сканирования ловушки. Второй дихроичный светоделитель (F48-640, AHF) спектрально разделяет донорные и акцепторные фотоны по направлению к их соответствующему лавинному фотодиоду (APD SPCM-AQRH 14, Excilitas). После прохождения дополнительных фильтров (донорская полоса пропускания: F37-582 / 75, акцепторная полоса пропускания: F46-647, оба AHF) карта TCSPC (коррелированный по времени подсчет одиночных фотонов) (SPCM, DPC230, Becker & Hickl) и FPGA (7852R, National Instruments) одновременно обнаруживает донорные и акцепторные фотоны.Карта TCSPC отмечает входящие фотоны для дальнейшего анализа временной трассы.

FPGA оценивает положение захваченной флуоресцентной молекулы с помощью фильтра Калмана и подает соответствующее напряжение обратной связи, чтобы удерживать ее в ловушке. Усилитель напряжения обратной связи (VPP = 20 В, рабочая частота 80 МГц) соединяет выход обратной связи FPGA с четырьмя платиновыми электродами, создавая электрическое поле для захвата молекулы в микросхеме микрофлюидики. Пьезоэлемент (P-527.3CD, Physik Instrumente) удерживает микрожидкостный чип и позволяет нам точно регулировать осевое положение (пространственное разрешение 0.1 нм, повторяемость ± 1 нм по z) вдоль распространения возбуждающего лазера. Перед началом эксперимента мы используем камеру EMCCD (iXon EM + DU-897, Andor Technology), чтобы выровнять чип по лазерной схеме захвата, вставив светоделитель 50/50 в путь луча, который впоследствии удаляется из путь детектирующего луча снова.

2.3.3 Регулировка возбуждающего луча и управление лучом

Управление лучом в ловушке ABEL требует быстрого и точного метода лазерного сканирования.Хотя существует множество возможностей - от гальванических зеркал до пространственных модуляторов света - требования к скорости сужают наши возможности до двух устройств: электрооптических дефлекторов (EOD) и акустооптических дефлекторов (AOD). AOD имеют большие углы отклонения и являются более экономичным выбором. Они модулируют показатель преломления прозрачного кристалла акустическими волнами (применяя радиочастоты (RF) к кристаллу). Скорость отклонения луча зависит от диаметра луча (чем меньше, тем быстрее), с использованием продольных (более быстрых) или поперечных волн, а также от того, адресуется ли радиочастотный синтезатор с помощью аналогового генератора управления напряжением или прямого цифрового синтеза (быстрее).Кроме того, эффективность дифракции снижается для больших углов (максимальная ширина полосы модуляции) на практике до 50%, что необходимо скорректировать для однородного освещения всей картины захвата [57].

Электрооптические дефлекторы (EOD) быстрее, чем AOD, и работают на основе эффекта Поккельса, который изменяет оптические свойства электрооптического кристалла в ответ на приложенное электрическое поле. Угол отклонения не зависит от длины волны, как в AOD, а является функцией дисперсии показателя преломления и, следовательно, постоянным в видимом диапазоне длин волн.EOD отклоняют весь луч с эффективностью передачи, не зависящей от угла отклонения, и они позволяют лучу проходить прямо через них, когда они выключены. Эти свойства упрощают настройку нескольких длин волн возбуждения с помощью EOD. Хотя они, как правило, имеют меньший угол отклонения по сравнению с AOD, при больших углах отклонения не происходит уменьшения интенсивности, что делает поправку на однородную картину возбуждения излишней.

Мы используем пару связанных EOD (M310A, Conoptics) в сочетании с широкополосными усилителями мощности (7602M, Krohn-Hite Corporation), обеспечивающими необходимое высокое напряжение (± 200 В).Заявленный угол отклонения 1,5 мкм рад / В при апертуре 2,5 мм позволяет нам создать картину размером 2,3 мкм x 2,3 мкм с 6 разрешаемыми пятнами вдоль направлений x и y в плоскости нашего образца. В этом эксперименте мы выполняем ловушку с помощью EOD на частоте 7 кГц. Более быстрое сканирование требует лучшего отношения сигнал / шум, чтобы иметь возможность достаточно точно определить положение молекулы, чтобы уловить ее. После принятия решения о системе управления лучом единственным свободным параметром, определяющим размер диаграммы и количество разрешимых пятен, является диаметр луча.Уменьшение диаметра лазерного луча приводит к большему углу дифракции, но ограничивает количество разрешимых пятен и увеличивает перетяжку луча в плоскости образца. Лучший способ определить требуемый диаметр входного луча - начать с перетяжки луча и диапазона Рэлея в плоскости образца и вернуться к лазерному источнику.

На рис. 5 показан предполагаемый шаблон сканирования: шаблон обхода Найта с 32 точками, разделенными по диагонали на 0,47 мкм. Чтобы создать однородную интенсивность возбуждения по всей области захвата, мы стремимся к перетяжке пучка ω b = 0.5 мкм. Ловушка ABEL активно ограничивает броуновское движение молекулы по осям x и y, ограничивая ее движение по оси z физическими пределами микрожидкостного чипа (высота = 600 нм). Следовательно, конфокальный параметр b луча должен оставаться постоянным по всей высоте чипа для получения одного и того же сигнала флуоресценции независимо от фактического положения молекулы по оси z вдоль луча возбуждения. Это условие выполняется при конфокальном параметре b = 2,95 мкм, полученном удвоением диапазона Рэлея (b = 2πω b 2 / λ).

Для определения диаметра луча d = 2ω i , входящего в объектив нашего микроскопа, мы аппроксимируем распространение гауссова луча через линзу для малых углов с

Фокусное расстояние линзы объектива рассчитывается с помощью f obj = f tubelens / M с увеличением линзы объектива M - в нашем случае f obj = 3,33 мм, что приводит к требуемому диаметру луча d = 1,13 мм. (обратите внимание, что эта обратная зависимость между шириной входного луча и выходной шириной в образце также используется в микроскопии одиночных молекул Slimfield [66]).Вышеприведенное уравнение для коллимирования гауссова пучка действительно только в том случае, если ω i >> ω b и если ω i >> λ - требование параксиального приближения. Хотя эти уравнения дают только оценки, их обычно достаточно, и размер луча можно легко настроить с помощью подходящего кеплеровского телескопа. Наиболее важным аспектом использования телескопов является ретрансляция сопряженных плоскостей. Во-первых, это абсолютно необходимо для отображения отклонения луча по оси x на отклонение по оси y и далее в плоскость захвата, чтобы гарантировать, что манипулирование пучком по обеим осям происходит в одной плоскости, создавая шаблон 2D-сканирования.Во-вторых, нам нужно обеспечить, чтобы луч всегда попадал в заднюю апертуру объектива. Путем передачи сопряженных плоскостей отклонения x и y на заднюю апертуру объектива изменяется только угол луча, входящего в объектив, но не его пространственное положение. Задняя апертура объектива - это плоскость Фурье плоскости нашего образца, переводящая угловое отклонение в боковое движение. Дополнительный телескоп на нашем пути луча (L3 и L4) помогает выровнять всю систему. Это дает нам еще одну сопряженную плоскость, расположенную непосредственно на зеркале, чтобы точно выровнять фокус луча без необходимости повторного совмещения остальной части пути луча.

Калибровка шаблона сканирования EOD.

  1. Установите начальное значение шкалы отклонения EOD. Удостоверьтесь, что нет вызванного усилением ограничения напряжения усиления усилителя мощности.

  2. Задайте 4-точечный квадратный шаблон сканирования и измерьте их расстояние на разных заранее заданных расстояниях с помощью камеры. Камера также должна быть откалибрована, чтобы сделать вывод о шагах по расстоянию в пикселях.

  3. Сравните установленное расстояние с измеренным расстоянием и соответствующим образом отрегулируйте масштаб отклонения EOD.Повторяйте итерацию до тех пор, пока установленное расстояние и измеренное расстояние не совпадут.

Юстировка трактов обнаружения лавинных фотодиодов (ЛФД)

И донорский, и акцепторный ЛФД присоединены к одному микрометровому преобразователю x-y-z, включая фильтры, линзы, дихроичный светоделитель и точечное отверстие. Оба детектора имеют дополнительную свободу микрометрового перемещения по x и y относительно оси распространения луча.

  1. Поместите автофлуоресцентное пластиковое предметное стекло (Chroma) или каплю раствора флуоресцентного красителя, изготовленного на заказ, на покровное стекло объектива микроскопа для выравнивания после добавления иммерсионного масла.

  2. Сначала выровняйте APD по прямому пути луча (акцепторный APD в нашем случае), неоднократно регулируя положения x, y, z главной ступени трансляции, правильно позиционируя точечное отверстие на пути детектирующего луча с последующей точной регулировкой по x и y положение APD.

  3. После максимизации скорости счета фотонов на акцепторном APD повторите то же самое для донорского APD, стараясь не смещать точечное отверстие.

  4. Положение точечного отверстия по оси z, а также APD в нашем случае немного менее критично, поскольку перетяжка луча возбуждающего лазера немного расширена, а точечное отверстие больше по сравнению с конфокальной установкой.Окончательную настройку положения по оси Z APD лучше всего проводить с помощью работающего датчика FRET - того, с которым мы собираемся поэкспериментировать.

  5. Наиболее важным для отношения сигнал / шум не менее 2: 1 и способности захвата является правильное осевое позиционирование микрожидкостного чипа, которое мы достигаем с помощью пьезостадиона (P-527.3CD, Physik Instrumente) удерживая пробный столик.

3. Сбор данных FRET: общая стратегия для выявления конформационных флуктуаций в Rep

10 мкл раствора, содержащего 150 пМ помеченного Rep (Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 647), были приготовлены и немедленно введены в предварительно изготовленный ABEL чип.Условия буфера (10 мМ трицин, 10 мМ сукцинат, 1,25 мМ MgCl 2 , 0,03 мМ KCl, 10 мМ NaCl, pH 8) были выбраны для облегчения улавливания ABEL, а также обеспечения конформационной свободы между состояниями высокого и низкого FRET. В отсутствие обратной связи одиночные молекулы Rep диффундируют через шаблон лазерного сканирования с типичным временем диффузии около 30-40 мс (рис. 7a). Однако при применении обратной связи молекулы Rep, которые диффундировали в ловушку, быстро подталкивались к центру и удерживались примерно полсекунды до фотообесцвечивания или выхода из ловушки (Рисунок 7b и Рисунок 8c).Мы отметили, что> 10% всех захваченных молекул Rep находились в области захвата в течение> 1 с. Мы зарегистрировали в среднем около 27000 донорных и акцепторных фотонов за 1 секунду захвата.

Рис. 7. Улавливание ABEL дважды меченых молекул Rep в растворе.

(a) При отсутствии обратной связи на временах флуоресценции донора и акцептора наблюдались короткие всплески длительностью обычно несколько десятков мс над фоном. (b) При наличии обратной связи время пребывания молекулы обычно составляло полсекунды, но иногда и несколько секунд.(c) Гистограмма записанных длительностей ловушек. (d) Захват Rep показал антикорреляции между траекториями флуоресценции донора (синий) и акцептора (зеленый), что соответствует наблюдаемым колебаниям эффективности FRET (красный).

Рис. 8. Средние фоновые скорости донорного и акцепторного каналов.

(a) Гистограммы и гауссовы аппроксимации (сплошная пурпурная линия), связанные с фоновыми показателями Alexa Fluor 546 (донор) и Alexa Fluor 647 (акцептор). (b) Репрезентативные кривые, показывающие захват мономеров Rep, содержащих только донор (Alexa Fluor 546) и минимальное просачивание в канал обнаружения акцептора (Alexa Fluor 647).

Запись временных кривых доноров и акцепторов, полученных при обнаружении APD с интегрированием по времени 1 мс, обеспечивает сигналы FRET. Типичное отношение сигнал / шум варьировалось от 2: 1 до 3: 1 во время захвата. Временное окно измерения в 30 минут позволило нам собрать в среднем 300-500 событий захвата. Освещение было равномерным по всей области захвата (см. Рис. 5), и поэтому флуктуации интенсивности излучения были исключены из-за остаточного молекулярного движения. Как видно из репрезентативных кривых, показанных на фиг. 9a, антикорреляции между интенсивностями эмиссии донора и акцептора вызывают флуктуации кажущейся эффективности FRET E FRET .Мы отмечаем, что каждое событие захвата заканчивается переходом к фоновой флуоресценции, что указывает либо на фотообесцвечивание, либо на диффузию захваченной молекулы из ловушки. Иногда наблюдались кратковременные всплески интенсивности, указывающие на приближение второй молекулы Rep в окрестности ловушки.

Рис. 9. Репрезентативные трассы FRET и идеализированные траектории, полученные с помощью скрытого марковского моделирования.

Репрезентативные траектории (синие) и реконструированные HMM-аппроксимации (красные). б) соответствующие гистограммы эффективности FRET

Мы определили эффективность FRET E FRET с помощью где N D = N D, измерено - B D и N A = N A, измерено - B A - αN D . N D и N A представляют собой общие счета, полученные из донорного и акцепторного каналов, B D и B A представляют собой соответствующие фоновые счета и α - это доля утечки донорного излучения в акцепторный канал, определенная путем анализа траекторий, отображающих только донорные сигналы и восстановленных через. Чтобы определить среднюю среднюю фоновую скорость для донорного и акцепторного каналов, мы подгоняли гауссово распределение к гистограмме интенсивности из фоновых областей.В наших экспериментах восстановленные значения были: B D = 5,0 ± 0,1 (± стандартное отклонение) отсчетов мс −1 , B A = 11,0 ± 0,2 отсчетов мс −1 и α = 0,075 (см. Рисунок 8).

Временные траектории FRET от одиночных захваченных молекул Rep регистрируют конформационные флуктуации между открытой и закрытой формами - соответствующие состояниям с низким FRET и высоким FRET соответственно - вместе со скоростью взаимопревращений.Мы приспособили траектории FRET к временным траекториям, отображающие дискретные квантованные флуктуации состояния, с помощью скрытой марковской модели (HMM) [67] для извлечения времени пребывания в состоянии вероятностным образом, что является ценным высокопроизводительным аналитическим подходом для генерации объективных соответствий для больших массивов данных FRET. . Модель HMM представляет собой признанный метод восстановления скрытой в остальном идеализированной траектории и широко применяется в сообществе отдельных молекул для идентификации взаимодействий белок-нуклеиновая кислота [68], анализа траекторий фотообесцвечивания нескольких хромофоров [58] и различения между ними. состояния одиночной молекулы FRET.Вкратце, модель использует алгоритм Витерби для извлечения наиболее вероятной последовательности состояний для данного набора данных.

В этом приложении траектории FRET моделировались с помощью алгоритма HaMMY [67] с использованием максимум 10 различных предполагаемых состояний FRET. Основываясь на сходимости критерия согласия, мы находим, что Rep принимает по крайней мере четыре быстро взаимопревращающихся конформационных состояния в тестируемых условиях. Мы применили этот метод ко всем экспериментальным траекториям FRET, извлекая истинное число состояний.Репрезентативные траектории и реконструированные подгонки HMM показаны на рисунке 9.

4. Выводы и перспективы

Ловушка ABEL характеризует зависящие от времени изменения в отдельных захваченных молекулах в течение продолжительных периодов времени без необходимости функционализации поверхности для иммобилизации молекул. Методы флуктуации, такие как FCS, которые обеспечивают доступ только к нескольким миллисекундам, необходимым для диффузии молекулы через конфокальный объем, не могут разрешить молекулярные процессы, если они не происходят во времени, превышающем время диффузии.Обычные системы визуализации с широким полем зрения, такие как TIRF с временным разрешением обычно 10-50 мс, затрудняют доступ к короткоживущим переходам и полагаются на прикрепление белков к поверхности. Таким образом, ловушка ABEL открывает возможность для наблюдения ключевых молекулярных переходов, которые в противном случае могут быть скрыты. Его уникальная способность одновременно измерять интенсивность и эффективность FRET также позволяет идентифицировать агрегаты и виды, которые необходимо различать на основе сообщаемых уровней FRET. Это важно для однозначного выявления скрытой неоднородности в образцах.

Мы ожидаем, что этот молекулярный анализ на основе ловушек ABEL будет широко полезен в контексте исследования многих различных типов молекулярных машин в присутствии их физиологических кофакторов, а также изучения множества динамических молекулярных взаимодействий, как конформационные изменения внутримолекулярно и межмолекулярно.

5. Благодарности

Мы благодарим Михаэля Бёрша, Universitätsklinikum Jena, за доступ к техническим средствам. Мы выражаем признательность за поддержку Группе Physics of Life в Йоркском университете, Великобритания, BBSRC (BB / P000746 / 1, BB / R001235 / 1), Leverhulme Trust (RPG-2017-340) и Alzheimer's Research UK (ARUK- РФ2019А-001).

Шаг кинезина, рассеченный с помощью одномоторного FRET

Abstract

Моторный белок Kinesin-1 управляет внутриклеточным транспортом по микротрубочкам, причем каждый из двух его моторных доменов совершает шаги длиной 16 нм, передавая их из рук в руки. То, как двигается одномоторный домен во время шага, неизвестно. Здесь мы используем резонансный перенос энергии Ферстера (FRET) между флуоресцентными метками на обоих моторных доменах одного кинезина. Этот подход позволяет нам определить относительное расстояние между моторными доменами и их относительную ориентацию в субмиллисекундной шкале времени во время процессивного шага.Мы наблюдаем переходы между высокими и низкими значениями FRET для определенных конструкций кинезина, в зависимости от расположения меток. Эти результаты показывают, что во время шага моторный домен кинезина пребывает в четко определенном промежуточном положении в течение ≈3 мс.

Обычный кинезин, кинезин-1, управляет внутриклеточным транспортом везикул и органелл по микротрубочкам (МТ) (1). В результате согласованного действия двух идентичных моторных доменов кинезин перемещается с шагом 8 нм, гидролизуя один АТФ за шаг (2).Скорость мотора зависит от АТФ, соответствует кинетике Михаэлиса-Ментен и составляет 600-800 нм / с при насыщающих концентрациях АТФ, что соответствует ≈10 мс на шаг. Двигательные домены шагают «из рук в руки», каждый по очереди перемещается на 16 нм (3–5). Кинезин - это процессивный мотор, который делает сотни шагов, прежде чем отсоединиться от МТ. Считается, что процессивность достигается за счет удержания циклов АТФ-гидролиза обоих моторных доменов в противофазе с помощью стробирующего механизма, работающего через натяжение связи между двумя моторными доменами (6, 7).Не до конца понятно, предотвращает ли стробирование связывание АТФ с ведущим моторным доменом, высвобождение АДФ из ведомого домена или и то, и другое (6, 8). Напряжение также может потребоваться для высвобождения замыкающего, связанного с ADP моторного домена из MT (6, 7).

Пошаговое движение происходит между конфигурациями с обоими моторными доменами, прочно связанными с МТ и на расстоянии 8 нм друг от друга, состояние «две головы-привязанные», которое наблюдалось при одномоторном резонансном переносе энергии Фёрстера (FRET) (9) и флуоресцентные поляризационные исследования (10).Не очень хорошо известно, что происходит во время шага между двумя последующими двумя состояниями, связанными с головой, и какую долю времени моторные домены проводят в такой конфигурации. При высоких концентрациях АТФ эксперименты по оптическому улавливанию с временным разрешением 50 мкс показали, что шарик, прикрепленный к хвосту кинезина, совершает мгновенные шаги, и никакие промежуточные соединения не могут быть разделены (11). Однако подэтапы были предсказаны на основе моделей механизма кинезина (12). При низких концентрациях АТФ кинезин проводит значительное время в «состоянии ожидания АТФ», прежде чем сделать шаг.В этом состоянии один моторный домен связан с МТ и «ожидает» АТФ, тогда как положение другого моторного домена, содержащего АДФ, в настоящее время обсуждается. Некоторые исследования показали, что последний моторный домен связан с МТ, аналогично состоянию с двумя головами (5, 10, 13). Напротив, совсем недавно на основании данных электронной микроскопии было предложено, что связанный с АДФ моторный домен состыкован с безнуклеотидным доменом и расположен немного впереди (14). В другом исследовании с использованием одномолекулярного FRET, АДФ-связанный моторный домен также был предложен не прикрепленным к МТ, а позади безнуклеотидного домена (9).В этом последнем исследовании, которое имело временное разрешение 10 мс, такое состояние одной головы не было обнаружено при физиологических насыщающих концентрациях АТФ. До сих пор отсутствовали эксперименты, которые могли бы напрямую разрешить движение отдельных двигательных доменов в субмиллисекундной шкале времени во время процессивного движения. Здесь мы применяем анализ одномоторной подвижности, сочетающий конфокальную флуоресцентную микроскопию (15) с FRET для достижения этого временного разрешения.

Результаты

Чтобы определить изменения расстояния между моторными доменами кинезина с помощью FRET, мы создали четыре гомодимерных кинезиновых конструкции с одиночными остатками цистеина в разных положениях на обоих моторных доменах (рис.1). К этим цистеинам мы присоединили Alexa Fluor 555 в качестве донора и Alexa Fluor 647 в качестве акцепторного флуорофора. Эта пара FRET имеет расстояние Ферстера 5,1 нм (молекулярные зонды). Мы ожидали, что FRET не будет происходить для меченых донорно-акцепторных кинезинов, когда оба моторных домена связаны с последующими сайтами связывания на расстоянии 8 нм друг от друга. FRET, однако, может возникать в потенциальном промежуточном продукте только с одним доменом, связанным с МТ, а другим - ближе (Fig. 1 A ). Мы выбрали конструкции с цистеинами в позиции 324, 215, 43 или 149 (рис.1 B ), так как сообщалось, что эти конструкции являются функциональными (16), что мы подтвердили их неизменной скоростью и процессивностью. FRET измеряли ранее с использованием аналогичной конструкции 324 (9).

Рисунок 1.

Схематическое изображение кинезиновых конструкций и анализ одномоторной конфокальной флуоресцентной микроскопии. ( A ) Два моторных домена кинезина (код PDB 2kin) в двух моторных доменах, связанных с МТ, слишком далеко друг от друга для FRET, и потенциальный промежуточный продукт с моторными доменами, достаточно близкими для FRET.Серые кружки представляют собой одну протофиламент MT, плюс-конец направлен вверх. Зеленая, оранжевая, красная и черная стрелки представляют свет возбуждения, излучение донора, излучение акцептора и FRET, соответственно. ( B ) Четыре позиции, куда вводили цистеины для специфической маркировки (зеленые сферы). ( C ) Экспериментальный анализ с флуоресцентно меченным кинезином, приземляющимся на MT и проходящим через конфокальный объем (оранжевый), где он определяет профиль интенсивности возбуждения гауссовой формы (зеленая кривая).Рисунок не в масштабе; FWHM профиля составляет ≈250 нм, что соответствует ≈30 ступеням кинезина.

Для обнаружения короткоживущих ступенчатых промежуточных продуктов требуется анализ одномоторной флуоресценции с субмиллисекундным временным разрешением, поскольку ступенчатый цикл кинезина занимает в среднем ≈12 мс при насыщающих концентрациях АТФ (17). Чтобы преодолеть ограниченное временное разрешение подходов к широкопольной флуоресценции (18), мы разработали анализ конфокальной флуоресцентной микроскопии, позволяющий измерять флуктуации интенсивности флуоресценции на ходячих кинезинах во временных масштабах вплоть до 100 мкс (15).Здесь мы используем этот анализ для измерения вариаций эффективности FRET путем размещения сфокусированного лазерного луча на МТ и сбора фотонов, испускаемых одним двигателем с маркировкой, проходящим через него (рис. 1 C ). Фотоны разделяются по длине волны на два канала, детектируются и маркируются по времени с точностью до 12,5 нс. Из-за постоянной скорости двигателя и гауссова профиля возбуждения его временной график интенсивности флуоресценции имеет гауссову форму (рис. 2 A и D и рис. S1 A и D ).Ширина этого гауссиана является прямой мерой скорости кинезина (15). Интенсивности флуоресценции донора и акцептора напрямую отражают стехиометрию мечения. Мы ограничили наш анализ событиями, возникающими из кинезинов, меченных одним донором и одним акцептором, и которые могут быть хорошо согласованы с гауссианой [во многих случаях усеченной фотообесцвечиванием, присоединением или отсоединением мотора от МТ в конфокальном пятне (15). )]. На временных записях A215C и S149C, полученных при насыщающей концентрации АТФ (2 мМ), интенсивность акцептора намного ниже, чем интенсивность донора, тогда как оба сигнала имеют одинаковую интенсивность в следах T324C и S43C (рис.2 и рис. S1). Кроме того, флуктуации интенсивности кажутся антикоррелированными для этих двух последних конструкций. Чтобы выяснить, связаны ли эти наблюдения с тем, что FRET встречается только в последних конструкциях, мы вычислили кажущуюся эффективность FRET (интенсивность акцептора, деленная на сумму интенсивностей донора и акцептора; рассчитано только для ограниченного количества временных следов, на которые не повлияла фотография. обесцвечивание или посадка в центральной 200 мс). Эффективность T324C и S43C показывает две популяции (рис.2 B и рис. S1 B ). Напротив, для A215C и S149C можно выделить только одну популяцию (рис. 2 E и рис. S1 E ), аналогичную по эффективности популяции с низким FRET для T324C и S43C. В редких случаях, когда акцептор фотообесцвечивался, мгновенное падение акцепторного сигнала сопровождалось повышением донорного сигнала для T324C и S43C, но не для A215C (рис.2 C и F и рис. S1 C ; обратите внимание, что эти события были получены при концентрациях АТФ, отличных от 2 мМ).Взятые вместе, эти результаты показывают, что во время процессивного движения кинезины T324C и S43C переключаются между состояниями низкого и высокого FRET. Напротив, для конструкций A215C и S149C не наблюдается состояния с высоким FRET.

Рис. 2.

FRET наблюдается для меченного донором акцептором кинезина T324C, но не для A215C. Концентрация АТФ: 2 мМ, если не указано иное ( C и F ). ( A ) График интенсивности флуоресценции T324C, разбитый на интервалы более 10 мс, показывает большие колебания.Черный - интенсивность флуоресценции донора; красный - интенсивность флуоресценции акцептора. ( B ) Гистограмма кажущейся эффективности FRET для T324C [I A / (I A + I D ), с интервалом более 2 мс, центральные 200 мс из 6 событий (другие события не учитывались. для этого анализа, потому что на них повлияло приземление или фотообесцвечивание в пределах этого временного интервала)], показывающих два пика (при эффективности FRET 0,353 ± 0,009 и 0,59 ± 0,01, полученной из двойного гауссова подбора). ( C ) График интенсивности одного события T324C.Зеленые линии представляют собой глобальные подгонки с двумя гауссианами (один для донорного канала и один для акцепторного канала) с общей шириной, смещением и центральным положением, а также с шагом амплитуды в момент фотообесцвечивания акцептора. Подгонка амплитуд показывает, что после фотообесцвечивания акцептора (при ≈2,2 с) интенсивность донора увеличилась в 2,6 ± 0,2 раза. Для этого графика концентрация АТФ составляла 20 мкМ. ( D ) График интенсивности флуоресценции A215C. Колебания интенсивности кажутся меньше, чем у A .( E ) Гистограмма кажущейся эффективности FRET для A215C (5 событий). Наблюдается только один пик, соответствующий низкому FRET в B (эффективность FRET = 0,325 ± 0,003). ( F ) График интенсивности одного события A215C. После фотообесцвечивания акцептора (≈38,5 с) интенсивность доноров практически не изменяется (увеличение в 1,07 ± 0,05 раза). Для этого графика концентрация АТФ составляла 50 мкМ.

Для дальнейшего подтверждения возникновения FRET и определения временной шкалы флуктуаций FRET мы проанализировали временные следы флуоресценции, используя методы корреляции (15), аналогичные флуоресцентной корреляционной спектроскопии (19).Автокорреляция интенсивности флуоресценции с запаздыванием по времени τ пропорциональна вероятности обнаружения фотона в момент времени t + τ, после того, как он уже был обнаружен при t . Автокорреляция, рассчитанная на основе временного графика флуоресценции донора одного события T324C, в диапазоне от 0,1 до 1000 мс (рис. 3 A ), имеет два вклада (15): ( i ) гауссиан с полушириной ≈ 250 мс, что отражает время прохождения через конфокальное пятно, и ( ii ) экспоненциальный спад в миллисекундном масштабе.Чтобы проверить, связан ли этот быстрый компонент с FRET, мы рассчитали взаимную корреляцию между донорными и акцепторными сигналами. Взаимная корреляция (рис. 3 B ) показывает те же два вклада, но быстрый имеет отрицательную амплитуду. Эта отрицательная амплитуда указывает на то, что быстрые флуктуации антикоррелированы в донорном и акцепторном сигналах, что является явным признаком FRET (20). Аналогичная примерно миллисекундная компонента FRET наблюдалась в кросс- и автокорреляциях S43C, но не A215C и S149C (рис.3 и рис. S2).

Рис 3.

Флуктуации интенсивности в миллисекундах из-за FRET наблюдаются для T324C, а не для A215C. Концентрация АТФ: 2 мМ. ( A ) Автокорреляция кривой времени интенсивности флуоресценции донора «пучка покрывающей шейки» на фиг. 2 A (T324C). Показано соответствие (красная кривая) данных по формуле. 2 , состоящий из гауссовой (прохождение через конфокальное пятно) и экспоненциальной (FRET) составляющей. Компонент FRET имеет амплитуду A , равную 0.22 ± 0,01 и время затухания T FRET 2,5 ± 0,3 мс. ( B ) Взаимная корреляция временных следов интенсивности донора и акцептора одного и того же события T324C. Спад корреляции, связанный с FRET, имеет амплитуду -0,20 ± 0,01 и время затухания 3,6 ± 0,6 мс. ( C ) Автокорреляция кривой времени интенсивности флуоресценции события A215C на фиг. 2 D . Никакого спада автокорреляции на приблизительной шкале времени в миллисекундах невозможно различить. ( D ) Взаимная корреляция временных следов интенсивности донора и акцептора одного и того же события A215C.На приблизительной шкале времени в миллисекундах не наблюдается ослабления корреляции, что указывает на отсутствие флуктуаций из-за изменений FRET.

Для дальнейшего количественного анализа мы сосредоточимся только на автокорреляциях доноров, поскольку флуктуации донорского сигнала являются прямой мерой эффективности FRET, на которую не влияют перекрестные помехи между донором и акцептором (21). Кривые взаимной корреляции использовались только в качестве дополнительной проверки качества: ни одно из использованных событий не показало положительной взаимной корреляции в масштабе времени приблизительно миллисекунды.Подгонка автокорреляций T324C ( n = 16, всего ≈500 шагов; см. Рис. S3 для дополнительных кривых) с уравнением. 2 дало амплитуду 0,18 ± 0,02 (среднее ± SEM) и время затухания 2,4 ± 0,4 мс для экспоненциального вклада FRET. Среднее время шага составило 15,0 ± 1,6 мс, что было получено с помощью гауссовой аппроксимации временных кривых (15). Для S43C ( n = 19) мы нашли амплитуду 0,17 ± 0,02, время затухания 2,5 ± 0,3 мс и время шага 12,1 ± 0,7 мс (см.рис.S4 для дополнительных кривых). Время затухания вклада FRET значительно короче, чем время шага, что указывает на то, что переключение между различными состояниями FRET происходит в пределах одного шага. Кинетическая модель требуется для преобразования амплитуд и времен затухания в эффективности FRET и время жизни отдельных состояний. В простейшей кинетической схеме с двумя состояниями кинезин переключается из состояния без FRET с обоими моторными доменами, связанными с MT, в состояние FRET и обратно, завершая шаг 8 нм. Используя эту модель (ур. 3 в материалах и методах ), мы вычисляем, что кинезин T324C (S43C) переключается между состоянием без FRET со временем жизни 12 ± 2 мс (7,9 ± 0,8 мс) и состоянием FRET со временем жизни 3,0 ± 0,9 мс ( 3,7 ± 0,6 мс) и эффективность FRET 0,88 ± 0,12 (0,69 ± 0,06). Эти значения указывают на то, что шаговый цикл кинезина включает пока неразрешенное промежуточное состояние с обоими моторными доменами в непосредственной близости, продолжающееся ≈3 мс при насыщающей концентрации АТФ.

Затем мы определили, как сигналы FRET кинезина S43C и T324C зависят от концентрации АТФ.По графикам интенсивности во времени мы рассчитали кажущуюся эффективность FRET и наблюдали, что она увеличивается с уменьшением концентрации АТФ для обеих конструкций (рис. S5), что согласуется с более ранними результатами для аналогичной конструкции 324 (9). Мы рассчитали автокорреляции донорных сигналов, подогнали их (рис. S3 и S4) и рассчитали время жизни и эффективность FRET, используя кинетическую схему с двумя состояниями. Обратите внимание, что для расчета срока службы и эффективности FRET из этой модели время шага двигателя требуется в качестве входного параметра (таблица S1): это не полная химио-механическая модель, которая также описывает зависимость скорости от концентрации АТФ.При использовании этого подхода время жизни как FRET, так и состояния без FRET изменяется с концентрацией АТФ (Таблица S1). Связывание АТФ ограничивает скорость при низких концентрациях (22), и можно было бы ожидать, что время жизни только одного из состояний зависит от АТФ. Это противоречие указывает на то, что хемо-механическая модель, включающая зависимость скоростей от концентрации АТФ, должна быть более сложной и включать дополнительные состояния. Наши данные изначально зашумлены из-за ограниченного числа обнаруженных фотонов.Более сложные модели создают несколько проблем: их автокорреляции во многих случаях сложнее, чем одинарная экспонента (23), и требуются дополнительные свободные параметры. Чтобы обойти эти проблемы, мы рассмотрели ограниченную циклическую химико-механическую модель с тремя состояниями (см. Материалы и методы ) с двумя состояниями, идентичными модели с двумя состояниями, использованной выше: состояние без FRET, с обоими моторными доменами MT -связанное и состояние FRET, промежуточное. Третье состояние имеет время жизни, зависящее от АТФ, рассчитанное с использованием кинетики Михаэлиса-Ментен (уравнение. 4 в Материалы и методы ). Это состояние является состоянием ожидания АТФ, описанным в справочниках. 9 и 14. При 2 мМ АТФ его время жизни пренебрежимо мало, и модель сводится к двум состояниям. Только эффективность FRET этого состояния была свободным параметром. Время жизни и эффективность FRET двух других состояний были взяты из моделирования двух состояний (при насыщении АТФ) и оставались постоянными. Автокорреляции были рассчитаны по временным графикам, созданным с использованием моделирования Монте-Карло, с использованием одной экспоненты (рис.S6), и полученные времена и амплитуды затухания сравнивались с экспериментально полученными. Хорошее описание экспериментально полученных параметров было достигнуто с использованием эффективности FRET 0,6 ± 0,1 (0,40 ± 0,15) для состояния ожидания АТФ T324C (S43C) (фиг. 4 и фиг. S7). Обратите внимание, что моделирование с эффективностью FRET состояния ожидания АТФ, равной эффективности состояния с высоким FRET или без FRET, несовместимо с нашими экспериментальными данными, что указывает на то, что АТФ-зависимое состояние является отдельным состоянием, структурно отличным от состояния без FRET. -FRET и состояния с высоким FRET.Взятые вместе, наши данные и анализ показывают, что шаг кинезина при различных концентрациях АТФ можно описать с помощью модели с тремя состояниями, с ( i ) состоянием без FRET со временем жизни ≈12 мс, ( ii ) средой. -FRET состояние с ATP-зависимым временем жизни и ( iii ) состояние с высоким FRET со временем жизни ≈3 мс.

Рис. 4.

Модель с тремя состояниями описывает АТФ-зависимость сигналов FRET кинезина T324C. Амплитуды ( A ) и времена затухания ( B ) автокорреляционного затухания FRET.Символы представляют значения, полученные из автокорреляций измеренных временных кривых [среднее значение ± стандартная ошибка среднего, n = 16 (2 мМ АТФ), 9 (50 мкМ АТФ), 5 (20 мкМ АТФ)]. Линии представляют моделирование методом Монте-Карло с пятью различными значениями эффективности FRET состояния ожидания АТФ ( E FRET ATP ). Все остальные параметры оставались неизменными ( T NO FRET = 12,0 мс, E NO FRET = 0, T HIGH FRET = 3.0 мс, E HIGH FRET = 0,88, K M = 19 мкМ).

Обсуждение

Как эти три состояния вписываются в химико-механический цикл кинезина? Автокорреляционный анализ инвариантен к порядку состояний. Мы полагаем, однако, что промежуточное состояние с высоким FRET ≈3 мс следует за связыванием АТФ с безнуклеотидным двигательным доменом и предшествует высвобождению АДФ из другого двигательного домена, поскольку его время жизни соответствует времени высвобождения АДФ после погони за АТФ. (3.3 мс) (24). Кроме того, широко распространено мнение, что за связыванием АТФ следует быстрое изменение до «закрытой» конформации, обеспечивающее гидролиз (25, 26) и стыковку шейного линкера (27). Новое сформированное состояние может соответствовать наблюдаемому нами промежуточному продукту с высоким FRET. Это промежуточное состояние [3] (рис. 5) сопровождается смещением вперед и прикреплением несвязанного моторного домена к MT, высвобождая ADP. В результирующем состоянии [1], когда оба моторных домена связаны с МТ, длительностью ≈12 мс, АТФ гидролизуется и фосфат высвобождается из конечного моторного домена.Затем мотор находится в состоянии ожидания АТФ [2] со средней эффективностью FRET, указывая на то, что только один моторный домен тесно связан с МТ, что согласуется с некоторыми более ранними исследованиями (9, 14). Кроме того, промежуточное значение FRET предполагает, что связанный с АДФ моторный домен чередуется между конфигурациями [1] и [3], или что он привязан и может свободно перемещаться в пределах нескольких нанометров. В этом состоянии гибкость АДФ-связанного моторного домена может быть относительно большой, поскольку оба шейных линкера, которые вместе образуют связь между моторными доменами, скорее всего, отсоединены (27, 28).На основе наших результатов мы не можем различить, когда привязанный моторный домен находится в довольно фиксированном, промежуточном положении или является подвижным. Недавние исследования с использованием поляризации флуоресценции одной молекулы (29) и оптического захвата микросферы, прикрепленной непосредственно к одному из моторных доменов (30), предоставили доказательства гибкости привязанного моторного домена. Затем, после связывания АТФ, шейный линкер плотно связанного с МТ моторного домена стыкуется с последующим образованием пучка покров-шейка, притягивая АДФ-связанный моторный домен ближе, возвращаясь в состояние с высоким FRET [3] (27 , 31).Мы наблюдали FRET только с использованием кинезина, меченного в положениях 324 и 43, а не 149 и 215. Это открытие предполагает, что в состоянии с высоким FRET [3] только один моторный домен связан с МТ, а другой ориентирован. и транслируется таким образом, что расстояния 324–324 и 43–43 короче ≈4.5 нм, тогда как расстояния 149–149 и 215–215 больше ≈6 нм ( SI Text ). Эти ограничения по расстоянию выполняются конфигурациями, в которых оба основания шейного линкера относительно близко друг к другу, а фронты моторных доменов направлены друг от друга (рис.S8). Эффективность FRET в состоянии [3] выше, чем в состоянии ожидания АТФ [2], что указывает на то, что в среднем моторные домены расположены ближе друг к другу, что согласуется с шейным линкером АТФ-связанного моторного домена, который стыкуется, укорачивая связь между обоими моторными доменами (27, 31).

Рис. 5.

Химио-механическая интерпретация модели трех состояний. В состоянии без FRET [1] оба моторных домена прочно связаны с MT и находятся на расстоянии 8 нм друг от друга. АТФ гидролизуется, и фосфат высвобождается из конечного моторного домена, что приводит к состоянию ожидания АТФ [2] с промежуточной эффективностью FRET, когда один моторный домен тесно связан, а другой связан.Последующее связывание АТФ с передним моторным доменом вызывает стыковку его шейного линкера, перемещая хвост кинезина на 8 нм вперед, что приводит к промежуточному состоянию с высоким FRET [3]. В этом состоянии только один моторный домен связан с МТ, а другой близок, так что может возникнуть FRET. После этого промежуточного состояния несвязанный моторный домен (голубой) движется вперед к следующей стороне связывания на МТ, высвобождая АДФ. Указаны времена жизни ( T ) и эффективность FRET ( E FRET ) конструкции T324C.

В широкопольных исследованиях флуоресценции одиночных молекул, использующих нанометровую локализацию индивидуального моторного домена (5, 7), не удалось выявить ступенчатые промежуточные соединения, скорее всего, из-за ограниченного разрешения по времени. В недавнем широкомасштабном исследовании FRET одной пары с использованием конструкций, аналогичных нашей (9), было показано, что в состоянии ожидания АТФ только один моторный домен связан с МТ, а другой находится в пределах расстояния FRET, что согласуется с наши результаты. Однако этому исследованию не хватало временного разрешения для разрешения наблюдаемого здесь состояния FRET с высотой 3 мс.Они утверждали, что при высоких концентрациях АТФ кинезин совершает быстрые переходы из одного состояния, связанного с двумя моторными доменами, в другое без промежуточных звеньев. Напротив, наши данные показывают, что при насыщающих концентрациях АТФ кинезин проводит значительное количество времени (20-30%) в состоянии, связанном с одним моторным доменом (см. Ниже). Мы предпочитаем модель, в которой при всех концентрациях АТФ связывание АТФ с ведущим моторным доменом может происходить только после того, как замыкающий, связанный с АДФ моторный домен высвобождается из МТ, высвобождая напряжение между моторными доменами (8).После связывания АТФ связанный с АДФ моторный домен остается свободным от МТ в течение 3 мс перед связыванием со следующим сайтом связывания.

В отличие от наших данных, никаких подшагов не наблюдалось в экспериментах по оптическому захвату, измеряющих смещение микросферы, прикрепленной к хвосту кинезина, с временным разрешением 50 мкс (11, 32). Это кажущееся противоречие может указывать на то, что переходы в расположении моторных доменов не во всех случаях приводят к движению моторного хвоста. Наши данные не предоставляют прямых доказательств различения между 8-нм шагом кинезинового хвоста, происходящим после высвобождения АДФ (от [3] до [1]) или сразу после связывания АТФ (от [2] до [3]).Однако сильная поддержка последней точки зрения была предоставлена ​​в других исследованиях (8, 27, 32). Кроме того, недавнее моделирование молекулярной динамики показало, что за связыванием АТФ следует стыковка шейного линкера и последующее образование β-цепи с участием остатков шейного линкера и N-концевой покрывающей цепи (связка покров-шейка) (33). . Эксперименты по оптическому захвату подтвердили идею о том, что степпинг кинезина обеспечивается за счет образования этого пучка покров-шейка (29). Такой механизм со смещением на 8 нм, индуцированным АТФ-управляемым крупномасштабным конформационным изменением, согласуется с нашими выводами.В заключение, одномоторные эксперименты FRET, основанные на конфокальной флуоресцентной микроскопии, предоставили нам наблюдаемый параметр и временное разрешение, чтобы различить до сих пор скрытый промежуточный продукт в шаговом цикле Kinesin-1. Эта промежуточная конфигурация может играть ключевую роль в направлении домена шагового двигателя вперед, к плюсовому концу MT, к следующему сайту связывания.

Материалы и методы

Одномолекулярные эксперименты.

Были приготовлены четыре гомодимерных кинезиновых конструкции с одним цистеином, начиная с бесцистеиновой (cys, преобразованной в ala), повсеместно распространенной конструкции кинезина человека длиной 560 аминокислотных остатков (15).Цистеины были введены в положения 324, 43, 215 и 149 (Энтелехон), что подтверждено секвенированием. Кинезины экспрессировали, очищали и метили с пятикратным избытком как Alexa555, так и Alexa647 (Invitrogen), как описано в ссылке. 15. Экспериментальная установка и анализ (15) были модифицированы для одновременного обнаружения донорной и акцепторной флуоресценции. После прохождения через дихроичное зеркало 550DCLP (Chroma) флуоресценция была разделена на два канала вторым дихроичным зеркалом, 645DCXR (Chroma), и отфильтрована эмиссионными фильтрами HQ575 / 50 или HQ675 / 50 (Chroma).Вместо 4 мМ DTT мы использовали 5 мМ TROLOX (Sigma – Aldrich) в смеси образцов и не добавляли таксол. Система регенерации АТФ использовалась при всех концентрациях АТФ (15, 34).

Анализ данных.

Временные кривые интенсивности флуоресценции (с временными интервалами 10 мс) одиночных кинезинов, проходящих через конфокальное пятно, были подогнаны к гауссиану для получения амплитуды, ширины и смещения. Данные были ограничены фоновым сигналом ≈100 мс по обе стороны от события для подгонки и дальнейшего анализа.Соответствующее смещение (темновые подсчеты и фоновая флуоресценция) использовалось для коррекции фона, а амплитуды донорных и акцепторных каналов использовались для выбора событий, в которых присутствовали обе метки. Кроме того, в анализ включались события, в которых сигнал пропадал из-за обесцвечивания или отслоения, только когда они пересекали более половины конфокального объема. Для них применялись те же критерии, за исключением того, что не учитывались интенсивности флуоресценции после отслоения или фотообесцвечивания.Скорректированные по фону следы интенсивности флуоресценции донора, x i , и акцептора, x j , были объединены при Δ t = 0,1 мс и были перекрестными ( i j ) и автокоррелированной ( i = j ) с использованием: где N обозначает общее количество интервалов времени события. Кросс- и автокорреляции, полученные с использованием уравнения. 1 не нормализуются и затухают до нуля при больших временах запаздывания.Полученные таким образом корреляции были дополнены: где T FRET - постоянная затухания, а A - относительная амплитуда затухания из-за FRET, N - амплитуда корреляции, α - коэффициент, описывающий ширину нашего конфокального объема [мы зафиксировали до α = 760 (= 4 * σ пятно )], а T step - среднее время шага. Термин, включающий T T , является эмпирическим термином, добавленным для коррекции искажений от идеальной гауссовой формы временных следов из-за обесцвечивания фотографий, приземления, отслоения и стохастической природы шага (15).Все корреляционные кривые были нормализованы путем деления значений корреляции на амплитуду, N . Обратите внимание, что здесь мы переключились на непрерывную переменную времени задержки τ. При заданных условиях значения времени затухания ( T FRET ) и амплитуды ( A ) вклада FRET, полученные из подгонок к автокорреляциям, были усреднены. Эти средние значения были использованы для дальнейшего анализа с использованием модели с двумя и тремя состояниями (см. Ниже).

Автокорреляция стохастической кинетической схемы с двумя состояниями.

Теоретическое описание автокорреляции модели, в которой интенсивность флуоресценции донора циклически меняется между состоянием без FRET (NF) и состоянием с FRET (F), дается следующими уравнениями [заимствовано из Torres et al. (20)]: где k NF и k F - скорости выхода из состояния без FRET и FRET соответственно, E F - эффективность FRET состояния FRET, k step - скорость шага, а T step - среднее время шага проходящего двигателя.Здесь эффективность FRET состояния без FRET, E NF , установлена ​​на ноль. В наших экспериментах мы ожидали состояния с обоими моторными доменами, связанными с МТ и разделенными на 8 нм. Мы подсчитали, что для такого состояния ожидается эффективность FRET <0,05 [при условии, что расстояние Ферстера составляет 5,1 нм для пары FRET, Alexa Fluor 555 и 647 (молекулярные зонды)]. Кроме того, мы устанавливаем сумму времен жизни обоих состояний равной среднему времени шага (уравнение 3c ).

Расчет параметров модели с двумя состояниями на основе экспериментальных автокорреляций.

Из среднего времени затухания ( T FRET ) и амплитуды ( A ), полученных из подгонок к экспериментальным автокорреляциям, скорости и эффективности FRET были рассчитаны с использованием уравнения. 3 а - в . Таким образом были получены два набора решений. Два раствора различаются по их усредненным по времени относительным интенсивностям доноров. «Правильный» раствор был выбран после сравнения относительных донорных интенсивностей двух растворов с экспериментально полученными значениями.Экспериментальные значения были определены путем деления средней донорной интенсивности событий, связанных с кинезинами, меченными как донором, так и акцептором, на интенсивность событий, связанных с кинезинами, меченными только одним донором.

Моделирование Монте-Карло зависимости сигналов FRET от АТФ с использованием циклической трехуровневой химико-механической модели.

Мы предположили циклическую модель с тремя состояниями без обратных реакций. Чтобы ограничить количество свободных параметров, мы зафиксировали время пребывания и интенсивности двух состояний на значениях, полученных с помощью модели двух состояний при концентрациях 2 мМ АТФ.Мы позволили времени жизни третьего состояния изменяться в зависимости от концентрации АТФ (так, чтобы его время жизни было незначительным при 2 мМ АТФ), и оставили только эффективность FRET этого состояния ожидания АТФ в качестве свободного параметра. Время жизни состояния ожидания АТФ, T Ожидание АТФ , было получено из следующей производной уравнения Михаэлиса-Ментен: где k cat - максимальная скорость шага двигателя, K M - концентрация, при которой двигатель движется с половинной скоростью, а [ ATP ] - концентрация АТФ.Константа Михаэлиса ( K, M, , = 19 ± 8 мкМ) была получена из подбора комбинированных средних скоростей обеих конструкций (T324C и S43C).

Используя эту модель, мы создали временные кривые интенсивности доноров с помощью программного обеспечения для моделирования, написанного в LabVIEW (National Instruments), на основе подхода Монте-Карло. Как правило, моделировалось 15 000 циклов. Следы были получены для 20 концентраций АТФ и различной эффективности FRET в состоянии ожидания АТФ.По смоделированным временным графикам были рассчитаны автокорреляции, которые были аппроксимированы экспоненциальной функцией, дающей амплитуду и время затухания.

Благодарности

Эта работа была поддержана стипендией Види Исследовательского совета по наукам о Земле и о жизни и является частью исследовательской программы Stichting voor Fundamenteel Onderzoek der Materie, которая финансируется Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek.

Сноски

  • 2 Кому следует направлять корреспонденцию.Эл. Почта: erwinp {at} nat.vu.nl
  • Вклад авторов: E.J.G.P. спланированное исследование; С.В. и З.Л. проведенное исследование; С.В. и З.Л. проанализированные данные; и S.V., Z.L. и E.J.G.P. написал газету.

  • Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

  • Эта статья представляет собой прямое представление PNAS.

  • Эта статья содержит вспомогательную информацию на сайте www.pnas.org/cgi/content/full/07106/DCSupplemental.

Автомобильную промышленность беспокоят большие провалы в расходе топлива, такие как признание Hyundai

Hyundai Motor Co о завышении заявлений об экономии топлива на некоторых из своих самых продаваемых автомобилей, что обеспокоило отрасль, и среди руководителей и аналитиков в Лос-Анджелесе появилось много спекуляций. Авто покажет, что другим автопроизводителям, возможно, придется сделать то же самое.

Четыре недели назад Hyundai и ее дочерняя компания Kia Motors Corp признали, что они завысили экономию топлива по крайней мере на милю на галлон более чем 1 миллиона недавно проданных автомобилей.

«Я думаю, мы могли бы увидеть больше этого», - сказал Джейк Фишер, руководитель отдела автомобильных испытаний Consumer Reports. «Есть и другие автомобили, которые не соответствуют оценкам Агентства по охране окружающей среды».

Hyundai, маркетинговые кампании которой были сосредоточены на превосходной экономии топлива, говорит, что до сих пор ее U.На продажи S. допуск не повлиял. Но ему пришлось провести компенсационную кампанию, которая, по оценкам Moody's Investors Service, может стоить им 100 миллионов долларов в год до тех пор, пока автомобили не будут отправлены на слом. Он также сталкивается с судебными исками по этому поводу.

Для отрасли есть смысл подвергаться тщательной проверке, - сказал Гэри Силберг, лидер национальной автомобильной промышленности КПМГ.

«Мы из аудиторской фирмы. В ходе аудита вы узнаете, что если вы обнаружите одно отклонение от нормы, вам придется протестировать еще несколько», - сказал Силберг.«Могу ли я предположить, что есть и другие».

Автопроизводители тоже отметили давление.

«Я думаю, что каждый производитель сделал то, что делали мы, вернулся и сказал:« Это реальные цифры? »- сказал Аль Кастинетти, вице-президент одноименного бренда Nissan Motor Co в США.

Кастинетти и руководители автомобильных компаний General Motors Co, Toyota Motor Corp, Honda Motor Co, Mazda Motor Corp, Chrysler Group LLC и североамериканского подразделения Fiat SpA заявили, что они уверены, что их заявления о пробеге верны.

ЛЮБОЙ ПРОБЛЕМ

Измерение экономии топлива может быть непростым делом - проблема хорошо освещена седаном Ford Motor Co Fusion, победившим в номинации «Зеленый автомобиль года» на автосалоне в Лос-Анджелесе.

Гибрид Fusion оценивается в 47 миль на галлон, хотя ранние тесты, проведенные журналом Consumer Reports, показывают, что гибрид Fusion, как и другие гибриды, которые были протестированы, не приблизился к этой цифре.

Представитель Ford Уэс Шервуд сказал, что компания ожидает увидеть более широкий диапазон экономии топлива на своих гибридах нового поколения, поскольку не требует от водителей компромиссов в отношении характеристик автомобиля.

«Если вы хотите ездить с максимальной экономией топлива, у машины есть инструменты. Вы можете это сделать», - сказал Шервуд. «Если вы хотите ехать со скоростью 80 миль в час по шоссе, вы не получите 47 миль на галлон».

Гибрид - это автомобиль с более чем одним источником энергии, таким как электродвигатель и двигатель внутреннего сгорания, или электродвигатель с аккумулятором и топливными элементами для хранения энергии.

HYUNDAI MEA CULPA

Во время одного из первых публичных выступлений руководителя Hyundai по проблеме пробега, глава Hyundai Motor America Джон Крафчик в среду выступил на автосалоне, подчеркнув, как много сделал автопроизводитель, чтобы исправить ситуацию. .

«Мы разослали письма владельцам всех пострадавших автомобилей», - сказал Крафчик. «Мы разговаривали с тысячами по телефону, электронной почте и лично в наших представительствах».

Фишер из Consumer Reports сказал, что в конце концов потребители не откажутся от Hyundai. По его словам, для большинства потребителей не имеет значения, составляет ли пробег по шоссе 38 миль на галлон или 40 миль на галлон.

Однако, добавил он, некоторые люди обратили на это внимание, и он сказал, что для всех автопроизводителей было бы разумно убедиться, что их заявления соответствуют действительности.

«Фактическая экономия топлива, это действительно не так уж важно, - сказал Фишер. «Вопрос в том, доверяете ли вы этому автопроизводителю? Строят ли они безопасные автомобили? Собираются ли они обмануть где-нибудь еще, что касается безопасности или чего-то еще?»

Автомобильная промышленность обеспокоена большими потерями в расходе топлива, как у Hyundai

ЛОС-АНДЖЕЛЕС (Рейтер) - <005380.KS> Hyundai Motor Co завышает требования об экономии топлива на нескольких своих самых продаваемых автомобилях, что обеспокоило отрасль, поскольку среди руководителей и аналитиков на автосалоне в Лос-Анджелесе распространялись слухи о том, что больше автопроизводителям, возможно, придется сделать то же самое.

Четыре недели назад Hyundai и ее дочерняя компания Kia Motors Corp <000270.KS> признали, что они завысили экономию топлива по крайней мере на милю на галлон более чем 1 миллиона недавно проданных автомобилей.

«Я думаю, мы могли бы увидеть больше этого», - сказал Джейк Фишер, руководитель отдела автомобильных испытаний Consumer Reports. «Есть и другие автомобили, которые не соответствуют оценкам Агентства по охране окружающей среды».

Hyundai, маркетинговые кампании которой были сосредоточены на превосходной экономии топлива, заявляет, что до сих пор ее U.На продажи S. допуск не повлиял. Но ему пришлось провести компенсационную кампанию, которая, по оценкам Moody's Investors Service, может стоить им 100 миллионов долларов в год до тех пор, пока автомобили не будут отправлены на слом. Он также сталкивается с судебными исками по этому поводу.

«Для отрасли есть смысл подвергаться тщательному анализу», - сказал Гэри Силберг, лидер национальной автомобильной промышленности КПМГ.

«Мы из аудиторской фирмы. В ходе аудита вы узнаете, что если вы обнаружите одно отклонение от нормы, вам придется протестировать еще несколько», - сказал Силберг.«Могу ли я предположить, что есть и другие».

Автопроизводители тоже отметили давление.

«Я думаю, что каждый производитель сделал то же, что и мы, вернулся и сказал:« Это реальные цифры? »- сказал Аль Кастинетти, вице-президент одноименного бренда Nissan Motor Co в США.

Кастинетти, а также руководители автомобильных компаний General Motors Co, Toyota Motor Corp <7203.T>, Honda Motor Co <7267.T>, Mazda Motor Corp <7261.T>, Chrysler Group LLC и североамериканского подразделения Fiat SpA. они уверены, что их заявления о пробеге верны.

ЛЮБОЙ ПРОБЛЕМ

Измерение экономии топлива может быть непростым делом - проблема хорошо освещена седаном Ford Motor Co Fusion, выигравшим «Зеленый автомобиль года» на автосалоне в Лос-Анджелесе.

Гибрид Fusion оценивается в 47 миль на галлон, хотя ранние тесты, проведенные журналом Consumer Reports, показывают, что гибрид Fusion, как и другие гибриды, которые были протестированы, не приблизился к этой цифре.

Представитель Ford

Уэс Шервуд сказал, что компания ожидает увидеть более широкий диапазон экономии топлива на своих гибридах нового поколения, поскольку не требует от водителей компромиссов в отношении характеристик автомобиля.

«Если вы хотите ездить с максимальной экономией топлива, у машины есть инструменты. Вы можете это сделать», - сказал Шервуд. «Если вы хотите ехать со скоростью 80 миль в час по шоссе, вы не получите 47 миль на галлон».

Гибрид - это автомобиль с более чем одним источником энергии, таким как электродвигатель и двигатель внутреннего сгорания, или электродвигатель с аккумулятором и топливными элементами для хранения энергии.

HYUNDAI MEA CULPA

Во время одного из первых публичных выступлений руководителя Hyundai по проблеме пробега, Джон Крафчик, глава Hyundai Motor America, выступил на автосалоне в среду, подчеркнув, как много автопроизводитель сделал, чтобы исправить ситуацию. .

«Мы разослали письма владельцам всех пострадавших автомобилей», - сказал Крафчик. «Мы разговаривали с тысячами по телефону, электронной почте и лично в наших представительствах».

Фишер из Consumer Reports сказал, что в конце концов потребители не откажутся от Hyundai. По его словам, для большинства потребителей не имеет значения, составляет ли пробег по шоссе 38 миль на галлон или 40 миль на галлон.

Однако, добавил он, некоторые люди обратили на это внимание, и он сказал, что для всех автопроизводителей было бы разумно убедиться, что их утверждения соответствуют действительности.

«Фактическая экономия топлива, на самом деле это не так уж важно, - сказал Фишер. «Вопрос в том, доверяете ли вы этому автопроизводителю? Строят ли они безопасные автомобили? Собираются ли они обмануть где-нибудь еще, что касается безопасности или чего-то еще?»

(Дополнительный отчет Николая Грум; редактирование Эдвины Гиббс)

Несмотря на беспокойство, автоаукционы могли соединить между собой

САН-ДИЕГО. Некоторые продавцы автомобилей упали в обморок от идеи объединения автомобильных аукционов в Интернете для создания крупных взаимосвязанных аукционов.Других эта мысль раздражает.

Поддержка Avid поступает от грузоотправителей на оптовом рынке, которые продают большое количество подержанных автомобилей, многие из которых сданы в аренду.

Аукционные дома менее озабочены перспективами сотрудничества с конкурентами для проведения совместных интернет-аукционов на общих платформах или на тех, которые связаны современными технологиями.

Из-за разговоров между сторонниками, недоброжелателями и посредниками этот вопрос стал горячей темой на Национальной конференции по ремаркетингу в этом году.

Продавцы согласны с этой идеей, потому что они предвидят увеличение числа участников торгов, в основном дилеров, стремящихся пополнить запасы своих подержанных автомобилей.

Покупателям могут понравиться перспективы более широкого выбора транспортных средств и экрана, на котором можно делать ставки по клику. Но активизация аукционов может привести к увеличению затрат на приобретение товарно-материальных запасов.

Аукционные фирмы опасаются, что соответствующие бренды и репутация, которую они создавали на протяжении многих лет, могут внезапно потеряться в толпе. Они также предупреждают, что разные бизнес-модели и присущая им конкурентоспособность могут противоречить концепции множественных списков и широко открытых, перекрестных онлайн-аукционов.

«Это потребует совместной работы аукционов как дружественных конкурентов», - говорит Дэн Хейнрих, вице-президент GM Financial по ремаркетингу активов. «Грузоотправители чувствуют необходимость в этом. Вопрос в том, чтобы надеть танцевальную обувь.

«Мы хотели бы видеть перекрестные ставки», - говорит Лесли Рухе, старший менеджер по работе с клиентами US Bank Asset Remarketing. «Когда мы начали говорить об этом, все сказали:« Да, мы можем это сделать »».

Теперь волнующиеся задаются вопросом, нужно ли это делать.«Некоторые люди в аукционном сообществе смотрят на это с недоумением», - говорит участник конференции.

«Дилеры будут во многом руководить этим», - говорит Дэн Кеннеди, менеджер по ремаркетингу General Motors. «Люди, которые покупают автомобили, будут решать больше, чем мы, как грузоотправители».

В настоящее время три онлайн-авто аукциона участвуют в ограниченных совместных усилиях. Но в настройке есть недостатки. Например, если участник торгов на одном веб-сайте соответствует заранее установленной минимальной цене грузоотправителя, два других веб-сайта будут заблокированы.Возможные технические сбои включают непреднамеренную продажу одного и того же автомобиля разным участникам торгов по разным каналам.

«Мы приблизились, но еще не достигли цели», - говорит Джон Манчин, менеджер по ремаркетингу национального парка автомобилей Subaru в Америке, о технологии, которая выводит ее на новый уровень. «Давай перестанем об этом говорить и начнем делать это».

Оговорки озвучивает Том Корнелье, менеджер Ford по аукционным операциям и электронному бизнесу. «Мы продаем большую часть наших автомобилей дилерам Ford и Lincoln, и я должен беспокоиться о них.Ненавижу непредвиденных последствий.

Роберт Шталь, исполнительный вице-президент Ally по ремаркетингу, изо всех сил пытается понять возможные последствия проведения заочных аукционов под одной кибер-крышей.

«Я обдумывал это 100 раз и каждый раз придумывал новый сценарий», - говорит он. «Если я являюсь дилером, который вошел в одну систему и покупаю в другой, с кем мне ее настроить? Кто занимается оформлением документов? Подключаемся ли мы к каждой платформе или используем единую платформу? »

Задача состоит в том, чтобы стандартизировать процесс, - говорит Генрих.Это потребует от аукционных фирм, особенно крупных игроков, таких как ADESA и Manheim, «сесть за стол и договориться о чем-то, даже если они являются конкурентами».

Это сложный заказ, - говорит Корнелье. «И я бы не стал недооценивать технические проблемы».

Пьер Понс, генеральный директор ServiNet, компании, занимающейся онлайн-аукционами, добавляет: «Вы не хотите выходить на рынок с чем-то, что не работает».

Мульти-листинг - самая простая задача, - говорит Джей Кэдиган, вице-президент Manheim по связям с отраслью.«А как насчет расчетов, арбитражей, сборов и поставок? Не все аукционы работают одинаково ».

Боб МакКонки, президент аукциона DAA Northwest, добавляет: «Мы сотрудничали по стандартам, но не по продаже автомобилей. На первый взгляд это кажется выполнимым, но грузоотправители не осознают, насколько это сложно. Но мы работаем над этим ».

Создание связанной системы, объединяющей все процессы отдельных аукционных домов, - прекрасное занятие, - говорит Понс. «Я получаю то, что хотят грузоотправители.Но приходите на вечеринку с чем-то большим, чем просто список желаний. Приходите с чековыми книжками, потому что это будет стоить больших денег ».

Все дело в деньгах, - говорит Джеймс МакИвер, генеральный директор American Auto Auction Group.

Это включает в себя чистую конкурентоспособность бизнеса, - говорит он. «Могу ли я зайти в Sam’s Club и использовать свою карту Costco? Хочу ли я за свой счет строить другие аукционы? Конечно, нет. Немного расслабься.

Subaru’s Manchin признает мотивы для поиска онлайн-аукциона.«Я хочу продавать автомобили по большинству каналов за как можно больше денег и как можно быстрее».

Все стороны должны получить выгоду, иначе совместное предприятие такого рода не будет работать, - говорит Леви Маккой, директор по ремаркетингу LeasePlan USA. «Убедитесь, что каждый получит кусок пирога. Если кого-то вырежут, он потеряет энтузиазм ».

Оптовые онлайн-аукционы автомобилей теперь являются стандартным способом покупки и продажи. Когда они впервые появились около десяти лет назад, скептики задались вопросом, будут ли дилеры делать ставки на автомобили, не видя их вживую на аукционных дорожках.

Дилеры чаще делают ставки онлайн, если автомобиль двух- или трехлетней давности. Около двух третей автомобилей Subaru последних моделей, снятых с продажи, продаются на интернет-аукционах. «Это почти новые автомобили, - говорит Манчин. «Дилеры не считают, что им нужно их проверять».

С другой стороны, дилеры обычно ездят на обычные аукционы, чтобы лично убедиться, как выглядят старые автомобили, прежде чем делать ставки.

«Десять лет назад Интернет-аукционы вызывали большие сомнения, - говорит Эллис Шталь.«Теперь нет».

Маккой говорит: «То, через что мы тогда прошли с идеей удаленного назначения ставок, похоже на то, что мы переживаем сейчас с многоплатформенными обсуждениями».

Некоторые участники конференции говорят, что лучше всего провести физический аукцион. «Никто не зарабатывает на онлайн-аукционах. Вы делаете это по переулкам, - говорит МакКонки.

Реальные аукционы никуда не денутся, - говорит Кэдиган. «Когда-то люди думали, что мы будем продавать 75% автомобилей (выставленных на аукционе) через Интернет. Этого не произошло.”

МакИвер добавляет: «Нет ничего прекраснее, чем видеть, как два участника торгов бодаются друг с другом, а аукционист поднимает всех».

Что касается перспектив создания одного большого блока онлайн-аукционов, он говорит: «Я хочу действовать, как дикобразы, занимающиеся любовью. Очень осторожно."

[адрес электронной почты защищен]

Флуоресцентный резонансный перенос энергии - Chemistry LibreTexts

Флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET) - это специальный метод измерения расстояния между двумя хромофорами, называемый парой донор-акцептор.Ограничение FRET состоит в том, что этот процесс переноса эффективен только тогда, когда расстояние между донорно-акцепторной парой меньше 10 нанометров. Однако FRET - это явление, сильно зависящее от расстояния, и поэтому он стал популярным инструментом для измерения динамической активности биологических молекул в наномасштабе.

Введение

FRET - это аббревиатура от Förster (флуоресценция) резонансной передачи энергии. Передача энергии по Фёрстеру - это явление, при котором возбужденный донор передает энергию (не электрон) акцепторной группе посредством безызлучательного процесса.Этот процесс сильно зависит от расстояния, что позволяет исследовать биологические структуры. Одним из распространенных приложений является простое измерение расстояния между двумя интересующими позициями на большой молекуле, обычно биологической макромолекуле, путем присоединения соответствующих донорно-акцепторных групп к большой молекуле. Если большая молекула включает только одного донора и одну акцепторную группу, расстояние между донором и акцептором можно легко измерить, если в этом процессе нет конформационных изменений.Кроме того, если молекула имеет огромное конформационное изменение, можно также измерить динамическую активность между двумя сайтами на этой макромолекуле, например, взаимодействия белков. Сегодня этот метод широко применяется во многих областях, таких как эксперименты с одной молекулой, молекулярные двигатели, биосенсоры и механические движения ДНК. FRET также называют «спектроскопической линейкой» из-за его внутреннего удобства.

Теоретический анализ был хорошо разработан Теодором Фёрстером. Этот механизм безызлучательного переноса схематически показан на рисунке \ (\ PageIndex {1} \).Донорная группа (D) возбуждается фотоном, а затем релаксирует в самое низкое возбужденное синглетное состояние, S 1 (по правилу Каша). Если акцепторная группа находится не слишком далеко, энергия, высвобождаемая, когда электрон возвращается в основное состояние (S 0 ), может одновременно возбуждать донорную группу. Этот безызлучательный процесс называется «резонансом». После возбуждения возбужденный акцептор излучает фотон и возвращается в основное состояние, если другие состояния тушения не существуют.

Рисунок \ (\ PageIndex {1} \): Принципиальная схема передачи энергии резонанса Фёрстера.(CC BY; LibreTexts)

Резонансный механизм связан с кулоновским взаимодействием между электронами. Таким образом, относительное расстояние кулоновского взаимодействия между парой донор-акцептор может быть больше, чем передача энергии электронного обмена, которая требует перекрытия волновых функций, а именно передачи энергии Декстера. Кулоновское взаимодействие требует только перекрытия спектра, что означает идентичность резонансной энергии. Рисунок \ (\ PageIndex {2} \) здесь должен дать представление о том, что такое резонансный механизм.(Обратите внимание, что зазор HOMO-LUMO не равен разности энергий между основным состоянием и самым низким возбужденным состоянием молекулы.)

Рисунок \ (\ PageIndex {2} \): схематическая диаграмма кулоновских взаимодействий. (CC BY; LibreTexts)

Факторы, влияющие на FRET

Эффективность FRET (\ (E \)) - квантовый выход перехода с переносом энергии; т.е. доля события передачи энергии, приходящаяся на событие возбуждения донора. Эффективность FRET определяется как

.

\ [\ E = \ dfrac {k_ {ET}} {k_f + k_ {ET} + \ sum k_i} \ label {1} ​​\]

где \ (k_ {ET} \) - скорость FRET, \ (k_f \) - скорость радиационной релаксации (т.е.6} \ label {2} \]

где \ (r \) - расстояние между донорными и акцепторными хромофорами, а \ (R_o \) - характерное расстояние (расстояние Ферстера или радиус Ферстера) с эффективностью переноса 50%.

Перекрытие спектра

Для повышения эффективности FRET группа доноров должна иметь хорошие способности поглощать фотоны и излучать фотоны. Это означает, что донорная группа должна иметь высокий коэффициент экстинкции и высокий квантовый выход. Наложение спектра излучения донора и спектра поглощения акцептора означает, что энергия, потерянная от возбужденного донора до основного состояния, может возбуждать акцепторную группу.4 \, d \ lambda \ label {3} \]

где \ (F_D (λ) \) - нормированный спектр излучения донора, \ (\ epsilon_ {A} \) стандарты для молярного коэффициента поглощения акцептора, а \ (λ \) - длина волны.

Рисунок \ (\ PageIndex {3} \): Схема спектрального перекрытия. (CC BY; LibreTexts)

Ориентация переходных диполей

На резонансный механизм передачи энергии также влияют ориентации диполя эмиссионного перехода донора и диполя поглощения акцептора.{-4} \ label {4} \]

Таблица \ (\ PageIndex {1} \): расстояния Ферстера различных донорно-акцепторных пар. Сокращения: BPE, B-фикоэритрин; CY5, карбоксиметилиндоцианин; Дансил, просто дансильная группа; EM, эозин малеимид; FITC, фторцеин-5-изотиоцианат; LY - желтый люцифер, ODR - октадецилродамин; TNP-ATP, тринитрофенил-ATP.
Донор Приемник

Расстояние Ферстера (\ (R_0 \), нм)

Нафталин Дансил 2.2
LY TNP-ATP 3,5
Дансил ODR 4,3
LY EM 5,3
FITC EM 6,0
BPE CY5 7.2

Заключение и ограничения FRET

FRET обеспечивает эффективный способ измерения расстояния между донорным и акцепторным хромофором. На эффективность передачи энергии сильно влияет соотношение \ (R \) и \ (R_0 \) из-за экспоненты 6. Таким образом, измеряя эффективность FRET, можно легко получить точное расстояние между донором и акцептором. При правильном выборе донора и акцептора этот эксперимент также можно провести in vivo .Однако FRET дает информацию только о расстояниях. Если происходит резкое конформационное изменение, такое как удлинение или изгиб, невозможно узнать точное движение донора и акцептора. Кроме того, прикрепление хромофоров к точным участкам макромолекулы также важно, как по количеству хромофоров, так и по положению макромолекулы, иначе FRET может создавать шумовые сигналы. (См. Вопрос 5)

Упражнение \ (\ PageIndex {1} \)

Нить F-актина состоит из мономеров G-актина.Прикрепив хоромофор донора (D) или акцептора (A) к мономеру G-актина и измерив эффективность передачи энергии, чтобы измерить среднее расстояние между мономерами G-актина в филаменте F-актина (при условии, что мономеры находятся в хорошем состоянии). расположены в последовательности DADADADA ....), и обнаруживается, что средняя эффективность передачи энергии составляет 23%. Если \ (R_0 \) составляет 4,5 нм, каково среднее расстояние между мономерами в нити?

Ответ

5.5 нм.

Упражнение \ (\ PageIndex {2} \)

На основании вопроса 1, если последовательность филамента состоит из 8 мономеров в порядке DADADADA, сколько видов эффективности может быть обнаружено, если филамент не изгибается и \ (R_0 \) достаточно велик, чтобы увидеть все их?

Ответ

Будет обнаружено 4 вида эффективности.

Упражнение \ (\ PageIndex {3} \)

Пара cy3-дорнор и cy5-акцептор прикреплена к финалам последовательности ДНК.Если игнорировать ориентацию переходных диполей донора и акцептора, постройте зависимость между отношением (\ (R / R_0 \)) и эффективностью передачи энергии.

Ответ

Пожалуйста, посетите сайт профессора Тэкджип Ха. https://netfiles.uiuc.edu/tjha/www/newTechnique.html

Упражнение \ (\ PageIndex {4} \)

Воспользуйтесь примером из вопроса 3, а теперь рассмотрите ориентацию переходных диполей.Постройте зависимость между разделяющим расстоянием донорно-акцепторной пары и эффективностью передачи энергии. (Помните, что при удлинении ДНК путем добавления пар оснований ориентация донорных и акцепторных хромофоров изменится) (Вопросы 3 и 4 переработаны из статьи, в которой измерялась зависимость ориентации в процессе FRET с использованием спирали ДНК.

Ответ

См. PNAS, август 2008 г., 105 (32), 11176-11181, DOI: 10.1073 / пнас.0801707105

Упражнение \ (\ PageIndex {5} \)

Одна из самых сложных проблем в области ионных каналов - это наблюдение за тем, как канал работает in vivo, и конформационные изменения канала, встроенного в клеточную мембрану. Если ученый хочет исследовать движение ворот ионного канала с помощью FRET, какие факторы следует учитывать? Например, как правильно привязать донор и акцептор к точным позициям затвора канала.

Ответ

Открытый вопрос. Пожалуйста, обратитесь к этой вводной статье об использовании FRET для исследования движений ионных каналов. Биофизический журнал, 2003 г., январь, 84 (1), 1-2, DOI: 10.1016 / S0006-3495 (03) 74827-9

Сноски

  1. PNAS, декабрь 2006 г., 103 (49), 18458-18463, DOI: 10.1073 / pnas.0605422103
  2. PNAS, ноябрь 2008 г., 105 (47), 18337-18342, DOI: 10.1073 / pnas.0800977105
  3. Nature Biotechnology 2003, 21, 1387-1395, DOI: 10.1038 / nbt896
  4. PNAS, октябрь 2009 г., 106 (42), 17741-17746, DOI: 10.1073 / pnas. 07106
  5. Nature, 1997 Август, 388, 882-887
  6. PNAS, декабрь 2006 г., 103 (51) 19217-19218, DOI: 10.1073 / pnas.0609223103
  7. PNAS, 1967 августа, 58 (2), 719-26. DOI: 10.1073 / pnas.58.2.719
  8. Аналитическая биохимия, апрель 1994 г., 218 (1), 1-13, DOI: 10.1006 / abio.1994.1134
  9. Протоколы природы, 2006 г., 1 августа, 911–919, DOI: 10.1038 / nprot.2006.122
  10. PNAS, август 2008 г., 105 (32), 11176-11181, DOI: 10.1073 / пнас.0801707105
  11. Biophysical Journal, 2003, январь, 84 (1), 1-2, DOI: 10.1016 / S0006-3495 (03) 74827-9
.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *