Двигатели лады: какой мне нужен? Ответ эксперта — журнал За рулем

a) Пластина маски служит шаблоном, содержащим 26 идентичных рисунков микрожидкостных микросхем, каждый примерно 1,5 см в диаметре. б) Покрытие маски PDMS передает функции маски PDMS. Каналы глубиной 40 мкм ведут к мелкой зоне захвата 600 нм, доставляя аналит и электрическое поле к центру.c) Закаленный PDMS вырезан по форме с добавленными отверстиями для Pt электродов. г) Последующее прикрепление чипа PDMS к покровному стеклу микроскопа закрывает все микрофлюидные каналы, оставляя отверстия для электродов, чтобы заполнить чип и вставить электроды. д) Фотографии, показывающие пластину маски, микроскопическое изображение зоны захвата в центре чипа с единственным фокусом лазера и готовый чип, прикрепленный к покровному стеклу микроскопа.

После резки и штамповки стружки мы очищаем и собираем их следующим образом.

1. Мы встряхиваем чипы PDMS в ацетоне в течение одной минуты, промываем их деионизированной водой и сушим продувкой азотом. Для большинства экспериментов достаточно двух циклов промывки покровных стекол микроскопа изопропанолом и деионизированной водой с последующей сушкой с продувкой азотом, но на этом этапе возможна более тщательная очистка [58].

2. И чип, и покровное стекло — затем оставьте в вакууме в течение 10 минут перед плазменным травлением в течение одной минуты. Плазменное травление удаляет метильные группы с поверхности PDMS и заменяет их гидроксильными группами.Это изменяет поверхность с гидрофобной на гидрофильную и облегчает процесс связывания ПДМС со стеклом [59].

3. После извлечения микросхемы и покровного стекла из вакуума мы непосредственно помещаем чип PDMS поверх покровного стекла для склеивания.

4. Микрофлюидный чип готов к экспериментам. Заполнение образца в чип сразу после этапа вакуумирования позволяет использовать способность PDMS поглощать пузырьки воздуха, избегая необходимости в сложных насосных системах.

2.3 Ловушка ABEL

2.3.1 Основной принцип и моделирование электрического поля

Основной принцип ловушки ABEL основан на электрофорезе: создание электрофоретической силы для перемещения молекулы с зарядом q по желаемому пути путем экспонирования это к пространственно однородному электрическому полю. Полная электрокинетическая сила представляет собой комбинацию электрофоретических и электроосмотических сил, действующих на поверхностный заряд молекулы или всего буферного раствора соответственно.В отличие от диэлектрофореза [60, 61], электрофорез является полевым эффектом первого порядка и поэтому особенно подходит для приложения сил к заряженным наноразмерным объектам. Мы моделируем электрическое поле для нашей конкретной геометрии чипа, чтобы оценить его однородность по всей области захвата. Это вызывает необходимость в инструменте моделирования электродинамики, доступном далеко не каждому. Мы предлагаем альтернативный подход, использующий известную математическую аналогию между электростатикой и установившейся теплопроводностью [62].Большинство инструментов анализа методом конечных элементов включают анализ теплопроводности в качестве стандартной функции, неявно предоставляя инструменты для моделирования электрического поля. Следовательно, это открывает возможность оптимизировать геометрию чипа для определенного распределения поля по участку ловушки. Мы демонстрируем этот метод с помощью ANSYS Workbench для 2D-горизонтальной плоскости через ловушку.

Аналогия между электростатикой и теплопроводностью очевидна, но мы подчеркиваем, что это математическая, а не физическая аналогия.В таблице 1 представлен обзор того, как мы заменили электростатические переменные теплопроводности. Помимо замены закона Гаусса на закон термодинамики 1 ^st , необходимо также учитывать граничные условия на границах раздела материалов. В частности, нормальные компоненты электрического смещения и электрического потенциала φ должны быть непрерывными, что мы переводим на постоянную температуру T и нормальные компоненты теплового потока через границы раздела фаз.Мы приняли следующий рабочий процесс:

1. Расчетная геометрия с указанием областей электродов, PDMS и буферного раствора

2. Установка граничных условий: установка значений температуры в положениях электродов, которые соответствуют приложению напряжения к электродам

3. Моделирование температурного поля, которое соответствует электрическому потенциал

4. Рассчитайте электрическое поле согласно и получите соответствующие силовые линии на этапе постобработки в MATLAB

Результаты моделирования электрического поля в нашей ловушке ABEL представлены на рисунке 4 с типичными напряжениями обратной связи ± 1 В и электрической проницаемостью ε _r = 3 для PDMS, ε _r = 80 для воды и ε _r. = 1 для воздуха. Сначала мы рассмотрим одномерный случай приложения напряжения обратной связи +1 В на левом электроде и -1 В на правом электроде (верхний ряд рис. 4). Это создает электрическое поле, которое является однородным в центральной области захвата, как показывают параллельные силовые линии (белые).На практике напряжение обратной связи прикладывается в направлениях x и y одновременно с наложением результирующих электрических полей. Пример показан в нижнем ряду рисунка 4: мы прикладываем ± 1 В в направлениях x и y, что приводит к диагональному однородному электрическому полю (параллельные силовые линии в центре ловушки), подходящему для приложения силы к заряженной молекуле в обоих направлениях. x и y одновременно.

a) Напряжение обратной связи устанавливается равным +1 В и -1 В по направлению x, что приводит к однородному электрическому полю в области захвата, как показано крупным планом центральной области, показанной на b).c) Однородные электрические поля вдоль направлений x и y накладываются друг на друга, что приводит к диагонально ориентированным параллельным силовым линиям в зоне захвата для одновременного приложения ± 1 В по x и y (увеличенное изображение показано на d).

2.3.2 Улавливание обратной связи и приборы

Мы реализовали ловушку ABEL в конфигурации smFRET конфокального объема лазерного возбуждения, добавив специально созданный блок лазерного сканирования для управления лучом и микрожидкостный чип (описанный в разделе 2.2.1) с платиновыми электродами. для доставки электрического поля к ловушке.В основе нашей установки лежит программируемая вентильная матрица (FPGA 7852R, National Instruments): система управления с обратной связью в реальном времени, запускающая лазерное сканирование и вычисление необходимых напряжений обратной связи для захвата молекулы в соответствии с ее положением. Лазер возбуждения в ловушке ABEL перемещается по заранее заданному шаблону, большему, чем фокус луча, чтобы определить положение молекулы для захвата. Из-за степени и скорости броуновского движения белков и объектов размером менее ~ 100 нм отслеживание с помощью видеокамеры происходит слишком медленно [13, 52].Стандартная конфокальная система определяет наличие флуоресцентной молекулы в фокусном объеме возбуждающего луча, но предел разрешения не позволяет нам узнать ее точное положение. Создание нескольких участков обнаружения, разбросанных в пространстве с помощью лазерного сканирования, позволяет нам получить доступ к местоположению рассеивающейся молекулы, сохраняя при этом отличное соотношение сигнал / шум конфокальной системы. Поскольку зарегистрированные флуоресцентные фотоны и выполнение лазерного смещения имеют временную метку, мы можем определить положение молекулы в месте захвата (рис. 5).

Лазер сканирует заранее заданный 32-точечный шаблон с частотой 7 кГц (по 4,5 мкс в каждой точке), в то время как фотоны флуоресценции с меткой времени, исходящие из этой области сканирования, предоставляют информацию о положении молекулы для захвата. ПЛИС управляет лазерным сканированием, оценивает положение молекулы с помощью фильтра Калмана и отправляет необходимые напряжения обратной связи, чтобы уловить молекулу в центре диаграммы сканирования. Внизу слева показана рассчитанная усредненная по времени картина интенсивности для всего участка ловушки.

Для того, чтобы ловушка ABEL работала с одиночными молекулами, определение положения, основанное только на положении лазера, недостаточно точно; перетяжка лазерного фокуса имеет поперечный диаметр, который на два порядка больше, чем типичный эффективный диаметр захваченной молекулы, и молекула также продолжает совершать броуновское движение между этапами сканирования. Увеличение скорости сканирования ограничено характеристиками блока управления лучом (см. Раздел 2.3.1) и отношением сигнал / шум. Уменьшение скорости сканирования улучшает отношение сигнал / шум до точки, где размытость движения становится очевидной [63].Для достижения требуемой точности определения местоположения мы реализовали фильтр Калмана [11, 64]: стандартный инструмент для измерения зашумленных данных в сочетании с известной динамикой системы — в нашем случае броуновским движением и электрокинетическим откликом. Этот фильтр оценивает положение молекулы в ловушке ABEL на основе обнаруженных фотонов, положения лазера и предсказания броуновского движения молекулы с учетом ее предполагаемого коэффициента диффузии D и электрокинетической подвижности μ. Затем фильтр взвешивает информацию о местоположении необработанных данных (количество фотонов) с оценкой местоположения на основе транспортных параметров ( D, и μ) для прогнозирования обновленной оценки местоположения (рисунок 5).Чтобы преодолеть ограничения фильтра Калмана по фиксированным параметрам модели ( D , μ), можно расширить его, используя инновационное отбеливание, включая фоновый шум с оценкой максимального правдоподобия, и, таким образом, достичь полного онлайн-определения D и μ [14, 65].

Детали нашего оборудования следующие (Рисунок 6):

(L1-L6) переключают плоскости сопряжения и регулируют диаметр луча перед попаданием в линзу объектива (O).Вверху слева: управление лучом лазерного возбуждения, нижнее синее поле: обнаружение однофотонной флуоресценции

Линейно поляризованный луч непрерывного возбуждения с длиной волны 532 нм проходит полуволновую пластину и куб светоделителя (AHWP05M-600, PBS201, Thorlabs) для регулировки мощности лазера. до 20 мкВт перед попаданием в электрооптические дефлекторы (EOD, M310A, Conoptics), создающие шаблон сканирования в месте ловушки. Дихроичный светоделитель (z 532 RD, AHF) внутри корпуса промышленного инвертированного микроскопа (IX71, Olympus) направляет возбуждающий лазер в линзу объектива микроскопа (60x, масляная иммерсия, PlanApo N, NA 1.42, UIS2, Olympus), позволяя возвращающейся флуоресценции одновременно проходить на путь детектирующего луча. Точечное отверстие 300 мкм (P300D, Thorlabs) в первой плоскости изображения после линзы трубки больше по сравнению со стандартной конфокальной установкой, чтобы не отрезать какой-либо расширенный шаблон лазерного сканирования ловушки. Второй дихроичный светоделитель (F48-640, AHF) спектрально разделяет донорные и акцепторные фотоны по направлению к их соответствующему лавинному фотодиоду (APD SPCM-AQRH 14, Excilitas). После прохождения дополнительных фильтров (донорская полоса пропускания: F37-582 / 75, акцепторная полоса пропускания: F46-647, оба AHF) карта TCSPC (коррелированный по времени подсчет одиночных фотонов) (SPCM, DPC230, Becker & Hickl) и FPGA (7852R, National Instruments) одновременно обнаруживает донорные и акцепторные фотоны.Карта TCSPC отмечает входящие фотоны для дальнейшего анализа временной трассы.

FPGA оценивает положение захваченной флуоресцентной молекулы с помощью фильтра Калмана и подает соответствующее напряжение обратной связи, чтобы удерживать ее в ловушке. Усилитель напряжения обратной связи (VPP = 20 В, рабочая частота 80 МГц) соединяет выход обратной связи FPGA с четырьмя платиновыми электродами, создавая электрическое поле для захвата молекулы в микросхеме микрофлюидики. Пьезоэлемент (P-527.3CD, Physik Instrumente) удерживает микрожидкостный чип и позволяет нам точно регулировать осевое положение (пространственное разрешение 0.1 нм, повторяемость ± 1 нм по z) вдоль распространения возбуждающего лазера. Перед началом эксперимента мы используем камеру EMCCD (iXon ^{EM +} DU-897, Andor Technology), чтобы выровнять чип по лазерной схеме захвата, вставив светоделитель 50/50 в путь луча, который впоследствии удаляется из путь детектирующего луча снова.

2.3.3 Регулировка возбуждающего луча и управление лучом

Управление лучом в ловушке ABEL требует быстрого и точного метода лазерного сканирования.Хотя существует множество возможностей — от гальванических зеркал до пространственных модуляторов света — требования к скорости сужают наши возможности до двух устройств: электрооптических дефлекторов (EOD) и акустооптических дефлекторов (AOD). AOD имеют большие углы отклонения и являются более экономичным выбором. Они модулируют показатель преломления прозрачного кристалла акустическими волнами (применяя радиочастоты (RF) к кристаллу). Скорость отклонения луча зависит от диаметра луча (чем меньше, тем быстрее), с использованием продольных (более быстрых) или поперечных волн, а также от того, адресуется ли радиочастотный синтезатор с помощью аналогового генератора управления напряжением или прямого цифрового синтеза (быстрее).Кроме того, эффективность дифракции снижается для больших углов (максимальная ширина полосы модуляции) на практике до 50%, что необходимо скорректировать для однородного освещения всей картины захвата [57].

Электрооптические дефлекторы (EOD) быстрее, чем AOD, и работают на основе эффекта Поккельса, который изменяет оптические свойства электрооптического кристалла в ответ на приложенное электрическое поле. Угол отклонения не зависит от длины волны, как в AOD, а является функцией дисперсии показателя преломления и, следовательно, постоянным в видимом диапазоне длин волн.EOD отклоняют весь луч с эффективностью передачи, не зависящей от угла отклонения, и они позволяют лучу проходить прямо через них, когда они выключены. Эти свойства упрощают настройку нескольких длин волн возбуждения с помощью EOD. Хотя они, как правило, имеют меньший угол отклонения по сравнению с AOD, при больших углах отклонения не происходит уменьшения интенсивности, что делает поправку на однородную картину возбуждения излишней.

Мы используем пару связанных EOD (M310A, Conoptics) в сочетании с широкополосными усилителями мощности (7602M, Krohn-Hite Corporation), обеспечивающими необходимое высокое напряжение (± 200 В).Заявленный угол отклонения 1,5 мкм рад / В при апертуре 2,5 мм позволяет нам создать картину размером 2,3 мкм x 2,3 мкм с 6 разрешаемыми пятнами вдоль направлений x и y в плоскости нашего образца. В этом эксперименте мы выполняем ловушку с помощью EOD на частоте 7 кГц. Более быстрое сканирование требует лучшего отношения сигнал / шум, чтобы иметь возможность достаточно точно определить положение молекулы, чтобы уловить ее. После принятия решения о системе управления лучом единственным свободным параметром, определяющим размер диаграммы и количество разрешимых пятен, является диаметр луча.Уменьшение диаметра лазерного луча приводит к большему углу дифракции, но ограничивает количество разрешимых пятен и увеличивает перетяжку луча в плоскости образца. Лучший способ определить требуемый диаметр входного луча — начать с перетяжки луча и диапазона Рэлея в плоскости образца и вернуться к лазерному источнику.

На рис. 5 показан предполагаемый шаблон сканирования: шаблон обхода Найта с 32 точками, разделенными по диагонали на 0,47 мкм. Чтобы создать однородную интенсивность возбуждения по всей области захвата, мы стремимся к перетяжке пучка ω _b = 0.5 мкм. Ловушка ABEL активно ограничивает броуновское движение молекулы по осям x и y, ограничивая ее движение по оси z физическими пределами микрожидкостного чипа (высота = 600 нм). Следовательно, конфокальный параметр b луча должен оставаться постоянным по всей высоте чипа для получения одного и того же сигнала флуоресценции независимо от фактического положения молекулы по оси z вдоль луча возбуждения. Это условие выполняется при конфокальном параметре b = 2,95 мкм, полученном удвоением диапазона Рэлея (b = 2πω _b ² / λ).

Для определения диаметра луча d = 2ω _i , входящего в объектив нашего микроскопа, мы аппроксимируем распространение гауссова луча через линзу для малых углов с

Фокусное расстояние линзы объектива рассчитывается с помощью f _obj = f _tubelens / M с увеличением линзы объектива M — в нашем случае f _obj = 3,33 мм, что приводит к требуемому диаметру луча d = 1,13 мм. (обратите внимание, что эта обратная зависимость между шириной входного луча и выходной шириной в образце также используется в микроскопии одиночных молекул Slimfield [66]).Вышеприведенное уравнение для коллимирования гауссова пучка действительно только в том случае, если ω _i >> ω _b и если ω _i >> λ — требование параксиального приближения. Хотя эти уравнения дают только оценки, их обычно достаточно, и размер луча можно легко настроить с помощью подходящего кеплеровского телескопа. Наиболее важным аспектом использования телескопов является ретрансляция сопряженных плоскостей. Во-первых, это абсолютно необходимо для отображения отклонения луча по оси x на отклонение по оси y и далее в плоскость захвата, чтобы гарантировать, что манипулирование пучком по обеим осям происходит в одной плоскости, создавая шаблон 2D-сканирования.Во-вторых, нам нужно обеспечить, чтобы луч всегда попадал в заднюю апертуру объектива. Путем передачи сопряженных плоскостей отклонения x и y на заднюю апертуру объектива изменяется только угол луча, входящего в объектив, но не его пространственное положение. Задняя апертура объектива — это плоскость Фурье плоскости нашего образца, переводящая угловое отклонение в боковое движение. Дополнительный телескоп на нашем пути луча (L3 и L4) помогает выровнять всю систему. Это дает нам еще одну сопряженную плоскость, расположенную непосредственно на зеркале, чтобы точно выровнять фокус луча без необходимости повторного совмещения остальной части пути луча.

Калибровка шаблона сканирования EOD.

1. Установите начальное значение шкалы отклонения EOD. Удостоверьтесь, что нет вызванного усилением ограничения напряжения усиления усилителя мощности.

2. Задайте 4-точечный квадратный шаблон сканирования и измерьте их расстояние на разных заранее заданных расстояниях с помощью камеры. Камера также должна быть откалибрована, чтобы сделать вывод о шагах по расстоянию в пикселях.

3. Сравните установленное расстояние с измеренным расстоянием и соответствующим образом отрегулируйте масштаб отклонения EOD.Повторяйте итерацию до тех пор, пока установленное расстояние и измеренное расстояние не совпадут.

Юстировка трактов обнаружения лавинных фотодиодов (ЛФД)

И донорский, и акцепторный ЛФД присоединены к одному микрометровому преобразователю x-y-z, включая фильтры, линзы, дихроичный светоделитель и точечное отверстие. Оба детектора имеют дополнительную свободу микрометрового перемещения по x и y относительно оси распространения луча.

1. Поместите автофлуоресцентное пластиковое предметное стекло (Chroma) или каплю раствора флуоресцентного красителя, изготовленного на заказ, на покровное стекло объектива микроскопа для выравнивания после добавления иммерсионного масла.

2. Сначала выровняйте APD по прямому пути луча (акцепторный APD в нашем случае), неоднократно регулируя положения x, y, z главной ступени трансляции, правильно позиционируя точечное отверстие на пути детектирующего луча с последующей точной регулировкой по x и y положение APD.

3. После максимизации скорости счета фотонов на акцепторном APD повторите то же самое для донорского APD, стараясь не смещать точечное отверстие.

4. Положение точечного отверстия по оси z, а также APD в нашем случае немного менее критично, поскольку перетяжка луча возбуждающего лазера немного расширена, а точечное отверстие больше по сравнению с конфокальной установкой.Окончательную настройку положения по оси Z APD лучше всего проводить с помощью работающего датчика FRET — того, с которым мы собираемся поэкспериментировать.

5. Наиболее важным для отношения сигнал / шум не менее 2: 1 и способности захвата является правильное осевое позиционирование микрожидкостного чипа, которое мы достигаем с помощью пьезостадиона (P-527.3CD, Physik Instrumente) удерживая пробный столик.

3. Сбор данных FRET: общая стратегия для выявления конформационных флуктуаций в Rep

10 мкл раствора, содержащего 150 пМ помеченного Rep (Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 647), были приготовлены и немедленно введены в предварительно изготовленный ABEL чип.Условия буфера (10 мМ трицин, 10 мМ сукцинат, 1,25 мМ MgCl ₂ , 0,03 мМ KCl, 10 мМ NaCl, pH 8) были выбраны для облегчения улавливания ABEL, а также обеспечения конформационной свободы между состояниями высокого и низкого FRET. В отсутствие обратной связи одиночные молекулы Rep диффундируют через шаблон лазерного сканирования с типичным временем диффузии около 30-40 мс (рис. 7a). Однако при применении обратной связи молекулы Rep, которые диффундировали в ловушку, быстро подталкивались к центру и удерживались примерно полсекунды до фотообесцвечивания или выхода из ловушки (Рисунок 7b и Рисунок 8c).Мы отметили, что> 10% всех захваченных молекул Rep находились в области захвата в течение> 1 с. Мы зарегистрировали в среднем около 27000 донорных и акцепторных фотонов за 1 секунду захвата.

(a) При отсутствии обратной связи на временах флуоресценции донора и акцептора наблюдались короткие всплески длительностью обычно несколько десятков мс над фоном. (b) При наличии обратной связи время пребывания молекулы обычно составляло полсекунды, но иногда и несколько секунд.(c) Гистограмма записанных длительностей ловушек. (d) Захват Rep показал антикорреляции между траекториями флуоресценции донора (синий) и акцептора (зеленый), что соответствует наблюдаемым колебаниям эффективности FRET (красный).

(a) Гистограммы и гауссовы аппроксимации (сплошная пурпурная линия), связанные с фоновыми показателями Alexa Fluor 546 (донор) и Alexa Fluor 647 (акцептор). (b) Репрезентативные кривые, показывающие захват мономеров Rep, содержащих только донор (Alexa Fluor 546) и минимальное просачивание в канал обнаружения акцептора (Alexa Fluor 647).

Запись временных кривых доноров и акцепторов, полученных при обнаружении APD с интегрированием по времени 1 мс, обеспечивает сигналы FRET. Типичное отношение сигнал / шум варьировалось от 2: 1 до 3: 1 во время захвата. Временное окно измерения в 30 минут позволило нам собрать в среднем 300-500 событий захвата. Освещение было равномерным по всей области захвата (см. Рис. 5), и поэтому флуктуации интенсивности излучения были исключены из-за остаточного молекулярного движения. Как видно из репрезентативных кривых, показанных на фиг. 9a, антикорреляции между интенсивностями эмиссии донора и акцептора вызывают флуктуации кажущейся эффективности FRET E _FRET .Мы отмечаем, что каждое событие захвата заканчивается переходом к фоновой флуоресценции, что указывает либо на фотообесцвечивание, либо на диффузию захваченной молекулы из ловушки. Иногда наблюдались кратковременные всплески интенсивности, указывающие на приближение второй молекулы Rep в окрестности ловушки.

Репрезентативные траектории (синие) и реконструированные HMM-аппроксимации (красные). б) соответствующие гистограммы эффективности FRET

Мы определили эффективность FRET E ^FRET с помощью где N _D = N _{D, измерено} — B _D и N _A = N _{A, измерено} — B _A — αN _D . N _D и N _A представляют собой общие счета, полученные из донорного и акцепторного каналов, B _D и B _A представляют собой соответствующие фоновые счета и α — это доля утечки донорного излучения в акцепторный канал, определенная путем анализа траекторий, отображающих только донорные сигналы и восстановленных через. Чтобы определить среднюю среднюю фоновую скорость для донорного и акцепторного каналов, мы подгоняли гауссово распределение к гистограмме интенсивности из фоновых областей.В наших экспериментах восстановленные значения были: B _D = 5,0 ± 0,1 (± стандартное отклонение) отсчетов мс ⁻¹ , B _A = 11,0 ± 0,2 отсчетов мс ⁻¹ и α = 0,075 (см. Рисунок 8).

Временные траектории FRET от одиночных захваченных молекул Rep регистрируют конформационные флуктуации между открытой и закрытой формами — соответствующие состояниям с низким FRET и высоким FRET соответственно — вместе со скоростью взаимопревращений.Мы приспособили траектории FRET к временным траекториям, отображающие дискретные квантованные флуктуации состояния, с помощью скрытой марковской модели (HMM) [67] для извлечения времени пребывания в состоянии вероятностным образом, что является ценным высокопроизводительным аналитическим подходом для генерации объективных соответствий для больших массивов данных FRET. . Модель HMM представляет собой признанный метод восстановления скрытой в остальном идеализированной траектории и широко применяется в сообществе отдельных молекул для идентификации взаимодействий белок-нуклеиновая кислота [68], анализа траекторий фотообесцвечивания нескольких хромофоров [58] и различения между ними. состояния одиночной молекулы FRET.Вкратце, модель использует алгоритм Витерби для извлечения наиболее вероятной последовательности состояний для данного набора данных.

В этом приложении траектории FRET моделировались с помощью алгоритма HaMMY [67] с использованием максимум 10 различных предполагаемых состояний FRET. Основываясь на сходимости критерия согласия, мы находим, что Rep принимает по крайней мере четыре быстро взаимопревращающихся конформационных состояния в тестируемых условиях. Мы применили этот метод ко всем экспериментальным траекториям FRET, извлекая истинное число состояний.Репрезентативные траектории и реконструированные подгонки HMM показаны на рисунке 9.

4. Выводы и перспективы

Ловушка ABEL характеризует зависящие от времени изменения в отдельных захваченных молекулах в течение продолжительных периодов времени без необходимости функционализации поверхности для иммобилизации молекул. Методы флуктуации, такие как FCS, которые обеспечивают доступ только к нескольким миллисекундам, необходимым для диффузии молекулы через конфокальный объем, не могут разрешить молекулярные процессы, если они не происходят во времени, превышающем время диффузии.Обычные системы визуализации с широким полем зрения, такие как TIRF с временным разрешением обычно 10-50 мс, затрудняют доступ к короткоживущим переходам и полагаются на прикрепление белков к поверхности. Таким образом, ловушка ABEL открывает возможность для наблюдения ключевых молекулярных переходов, которые в противном случае могут быть скрыты. Его уникальная способность одновременно измерять интенсивность и эффективность FRET также позволяет идентифицировать агрегаты и виды, которые необходимо различать на основе сообщаемых уровней FRET. Это важно для однозначного выявления скрытой неоднородности в образцах.

Мы ожидаем, что этот молекулярный анализ на основе ловушек ABEL будет широко полезен в контексте исследования многих различных типов молекулярных машин в присутствии их физиологических кофакторов, а также изучения множества динамических молекулярных взаимодействий, как конформационные изменения внутримолекулярно и межмолекулярно.

5. Благодарности

Мы благодарим Михаэля Бёрша, Universitätsklinikum Jena, за доступ к техническим средствам. Мы выражаем признательность за поддержку Группе Physics of Life в Йоркском университете, Великобритания, BBSRC (BB / P000746 / 1, BB / R001235 / 1), Leverhulme Trust (RPG-2017-340) и Alzheimer’s Research UK (ARUK- РФ2019А-001).

Шаг кинезина, рассеченный с помощью одномоторного FRET

Abstract

Моторный белок Kinesin-1 управляет внутриклеточным транспортом по микротрубочкам, причем каждый из двух его моторных доменов совершает шаги длиной 16 нм, передавая их из рук в руки. То, как двигается одномоторный домен во время шага, неизвестно. Здесь мы используем резонансный перенос энергии Ферстера (FRET) между флуоресцентными метками на обоих моторных доменах одного кинезина. Этот подход позволяет нам определить относительное расстояние между моторными доменами и их относительную ориентацию в субмиллисекундной шкале времени во время процессивного шага.Мы наблюдаем переходы между высокими и низкими значениями FRET для определенных конструкций кинезина, в зависимости от расположения меток. Эти результаты показывают, что во время шага моторный домен кинезина пребывает в четко определенном промежуточном положении в течение ≈3 мс.

Обычный кинезин, кинезин-1, управляет внутриклеточным транспортом везикул и органелл по микротрубочкам (МТ) (1). В результате согласованного действия двух идентичных моторных доменов кинезин перемещается с шагом 8 нм, гидролизуя один АТФ за шаг (2).Скорость мотора зависит от АТФ, соответствует кинетике Михаэлиса-Ментен и составляет 600-800 нм / с при насыщающих концентрациях АТФ, что соответствует ≈10 мс на шаг. Двигательные домены шагают «из рук в руки», каждый по очереди перемещается на 16 нм (3–5). Кинезин — это процессивный мотор, который делает сотни шагов, прежде чем отсоединиться от МТ. Считается, что процессивность достигается за счет удержания циклов АТФ-гидролиза обоих моторных доменов в противофазе с помощью стробирующего механизма, работающего через натяжение связи между двумя моторными доменами (6, 7).Не до конца понятно, предотвращает ли стробирование связывание АТФ с ведущим моторным доменом, высвобождение АДФ из ведомого домена или и то, и другое (6, 8). Напряжение также может потребоваться для высвобождения замыкающего, связанного с ADP моторного домена из MT (6, 7).

Пошаговое движение происходит между конфигурациями с обоими моторными доменами, прочно связанными с МТ и на расстоянии 8 нм друг от друга, состояние «две головы-привязанные», которое наблюдалось при одномоторном резонансном переносе энергии Фёрстера (FRET) (9) и флуоресцентные поляризационные исследования (10).Не очень хорошо известно, что происходит во время шага между двумя последующими двумя состояниями, связанными с головой, и какую долю времени моторные домены проводят в такой конфигурации. При высоких концентрациях АТФ эксперименты по оптическому улавливанию с временным разрешением 50 мкс показали, что шарик, прикрепленный к хвосту кинезина, совершает мгновенные шаги, и никакие промежуточные соединения не могут быть разделены (11). Однако подэтапы были предсказаны на основе моделей механизма кинезина (12). При низких концентрациях АТФ кинезин проводит значительное время в «состоянии ожидания АТФ», прежде чем сделать шаг.В этом состоянии один моторный домен связан с МТ и «ожидает» АТФ, тогда как положение другого моторного домена, содержащего АДФ, в настоящее время обсуждается. Некоторые исследования показали, что последний моторный домен связан с МТ, аналогично состоянию с двумя головами (5, 10, 13). Напротив, совсем недавно на основании данных электронной микроскопии было предложено, что связанный с АДФ моторный домен состыкован с безнуклеотидным доменом и расположен немного впереди (14). В другом исследовании с использованием одномолекулярного FRET, АДФ-связанный моторный домен также был предложен не прикрепленным к МТ, а позади безнуклеотидного домена (9).В этом последнем исследовании, которое имело временное разрешение 10 мс, такое состояние одной головы не было обнаружено при физиологических насыщающих концентрациях АТФ. До сих пор отсутствовали эксперименты, которые могли бы напрямую разрешить движение отдельных двигательных доменов в субмиллисекундной шкале времени во время процессивного движения. Здесь мы применяем анализ одномоторной подвижности, сочетающий конфокальную флуоресцентную микроскопию (15) с FRET для достижения этого временного разрешения.

Результаты

Чтобы определить изменения расстояния между моторными доменами кинезина с помощью FRET, мы создали четыре гомодимерных кинезиновых конструкции с одиночными остатками цистеина в разных положениях на обоих моторных доменах (рис.1). К этим цистеинам мы присоединили Alexa Fluor 555 в качестве донора и Alexa Fluor 647 в качестве акцепторного флуорофора. Эта пара FRET имеет расстояние Ферстера 5,1 нм (молекулярные зонды). Мы ожидали, что FRET не будет происходить для меченых донорно-акцепторных кинезинов, когда оба моторных домена связаны с последующими сайтами связывания на расстоянии 8 нм друг от друга. FRET, однако, может возникать в потенциальном промежуточном продукте только с одним доменом, связанным с МТ, а другим — ближе (Fig. 1 A ). Мы выбрали конструкции с цистеинами в позиции 324, 215, 43 или 149 (рис.1 B ), так как сообщалось, что эти конструкции являются функциональными (16), что мы подтвердили их неизменной скоростью и процессивностью. FRET измеряли ранее с использованием аналогичной конструкции 324 (9).

Схематическое изображение кинезиновых конструкций и анализ одномоторной конфокальной флуоресцентной микроскопии. ( A ) Два моторных домена кинезина (код PDB 2kin) в двух моторных доменах, связанных с МТ, слишком далеко друг от друга для FRET, и потенциальный промежуточный продукт с моторными доменами, достаточно близкими для FRET.Серые кружки представляют собой одну протофиламент MT, плюс-конец направлен вверх. Зеленая, оранжевая, красная и черная стрелки представляют свет возбуждения, излучение донора, излучение акцептора и FRET, соответственно. ( B ) Четыре позиции, куда вводили цистеины для специфической маркировки (зеленые сферы). ( C ) Экспериментальный анализ с флуоресцентно меченным кинезином, приземляющимся на MT и проходящим через конфокальный объем (оранжевый), где он определяет профиль интенсивности возбуждения гауссовой формы (зеленая кривая).Рисунок не в масштабе; FWHM профиля составляет ≈250 нм, что соответствует ≈30 ступеням кинезина.

Для обнаружения короткоживущих ступенчатых промежуточных продуктов требуется анализ одномоторной флуоресценции с субмиллисекундным временным разрешением, поскольку ступенчатый цикл кинезина занимает в среднем ≈12 мс при насыщающих концентрациях АТФ (17). Чтобы преодолеть ограниченное временное разрешение подходов к широкопольной флуоресценции (18), мы разработали анализ конфокальной флуоресцентной микроскопии, позволяющий измерять флуктуации интенсивности флуоресценции на ходячих кинезинах во временных масштабах вплоть до 100 мкс (15).Здесь мы используем этот анализ для измерения вариаций эффективности FRET путем размещения сфокусированного лазерного луча на МТ и сбора фотонов, испускаемых одним двигателем с маркировкой, проходящим через него (рис. 1 C ). Фотоны разделяются по длине волны на два канала, детектируются и маркируются по времени с точностью до 12,5 нс. Из-за постоянной скорости двигателя и гауссова профиля возбуждения его временной график интенсивности флуоресценции имеет гауссову форму (рис. 2 A и D и рис. S1 A и D ).Ширина этого гауссиана является прямой мерой скорости кинезина (15). Интенсивности флуоресценции донора и акцептора напрямую отражают стехиометрию мечения. Мы ограничили наш анализ событиями, возникающими из кинезинов, меченных одним донором и одним акцептором, и которые могут быть хорошо согласованы с гауссианой [во многих случаях усеченной фотообесцвечиванием, присоединением или отсоединением мотора от МТ в конфокальном пятне (15). )]. На временных записях A215C и S149C, полученных при насыщающей концентрации АТФ (2 мМ), интенсивность акцептора намного ниже, чем интенсивность донора, тогда как оба сигнала имеют одинаковую интенсивность в следах T324C и S43C (рис.2 и рис. S1). Кроме того, флуктуации интенсивности кажутся антикоррелированными для этих двух последних конструкций. Чтобы выяснить, связаны ли эти наблюдения с тем, что FRET встречается только в последних конструкциях, мы вычислили кажущуюся эффективность FRET (интенсивность акцептора, деленная на сумму интенсивностей донора и акцептора; рассчитано только для ограниченного количества временных следов, на которые не повлияла фотография. обесцвечивание или посадка в центральной 200 мс). Эффективность T324C и S43C показывает две популяции (рис.2 B и рис. S1 B ). Напротив, для A215C и S149C можно выделить только одну популяцию (рис. 2 E и рис. S1 E ), аналогичную по эффективности популяции с низким FRET для T324C и S43C. В редких случаях, когда акцептор фотообесцвечивался, мгновенное падение акцепторного сигнала сопровождалось повышением донорного сигнала для T324C и S43C, но не для A215C (рис.2 C и F и рис. S1 C ; обратите внимание, что эти события были получены при концентрациях АТФ, отличных от 2 мМ).Взятые вместе, эти результаты показывают, что во время процессивного движения кинезины T324C и S43C переключаются между состояниями низкого и высокого FRET. Напротив, для конструкций A215C и S149C не наблюдается состояния с высоким FRET.

FRET наблюдается для меченного донором акцептором кинезина T324C, но не для A215C. Концентрация АТФ: 2 мМ, если не указано иное ( C и F ). ( A ) График интенсивности флуоресценции T324C, разбитый на интервалы более 10 мс, показывает большие колебания.Черный — интенсивность флуоресценции донора; красный — интенсивность флуоресценции акцептора. ( B ) Гистограмма кажущейся эффективности FRET для T324C [I _A / (I _A + I _D ), с интервалом более 2 мс, центральные 200 мс из 6 событий (другие события не учитывались. для этого анализа, потому что на них повлияло приземление или фотообесцвечивание в пределах этого временного интервала)], показывающих два пика (при эффективности FRET 0,353 ± 0,009 и 0,59 ± 0,01, полученной из двойного гауссова подбора). ( C ) График интенсивности одного события T324C.Зеленые линии представляют собой глобальные подгонки с двумя гауссианами (один для донорного канала и один для акцепторного канала) с общей шириной, смещением и центральным положением, а также с шагом амплитуды в момент фотообесцвечивания акцептора. Подгонка амплитуд показывает, что после фотообесцвечивания акцептора (при ≈2,2 с) интенсивность донора увеличилась в 2,6 ± 0,2 раза. Для этого графика концентрация АТФ составляла 20 мкМ. ( D ) График интенсивности флуоресценции A215C. Колебания интенсивности кажутся меньше, чем у A .( E ) Гистограмма кажущейся эффективности FRET для A215C (5 событий). Наблюдается только один пик, соответствующий низкому FRET в B (эффективность FRET = 0,325 ± 0,003). ( F ) График интенсивности одного события A215C. После фотообесцвечивания акцептора (≈38,5 с) интенсивность доноров практически не изменяется (увеличение в 1,07 ± 0,05 раза). Для этого графика концентрация АТФ составляла 50 мкМ.

Для дальнейшего подтверждения возникновения FRET и определения временной шкалы флуктуаций FRET мы проанализировали временные следы флуоресценции, используя методы корреляции (15), аналогичные флуоресцентной корреляционной спектроскопии (19).Автокорреляция интенсивности флуоресценции с запаздыванием по времени τ пропорциональна вероятности обнаружения фотона в момент времени t + τ, после того, как он уже был обнаружен при t . Автокорреляция, рассчитанная на основе временного графика флуоресценции донора одного события T324C, в диапазоне от 0,1 до 1000 мс (рис. 3 A ), имеет два вклада (15): ( i ) гауссиан с полушириной ≈ 250 мс, что отражает время прохождения через конфокальное пятно, и ( ii ) экспоненциальный спад в миллисекундном масштабе.Чтобы проверить, связан ли этот быстрый компонент с FRET, мы рассчитали взаимную корреляцию между донорными и акцепторными сигналами. Взаимная корреляция (рис. 3 B ) показывает те же два вклада, но быстрый имеет отрицательную амплитуду. Эта отрицательная амплитуда указывает на то, что быстрые флуктуации антикоррелированы в донорном и акцепторном сигналах, что является явным признаком FRET (20). Аналогичная примерно миллисекундная компонента FRET наблюдалась в кросс- и автокорреляциях S43C, но не A215C и S149C (рис.3 и рис. S2).

Флуктуации интенсивности в миллисекундах из-за FRET наблюдаются для T324C, а не для A215C. Концентрация АТФ: 2 мМ. ( A ) Автокорреляция кривой времени интенсивности флуоресценции донора «пучка покрывающей шейки» на фиг. 2 A (T324C). Показано соответствие (красная кривая) данных по формуле. 2 , состоящий из гауссовой (прохождение через конфокальное пятно) и экспоненциальной (FRET) составляющей. Компонент FRET имеет амплитуду A , равную 0.22 ± 0,01 и время затухания T _FRET 2,5 ± 0,3 мс. ( B ) Взаимная корреляция временных следов интенсивности донора и акцептора одного и того же события T324C. Спад корреляции, связанный с FRET, имеет амплитуду -0,20 ± 0,01 и время затухания 3,6 ± 0,6 мс. ( C ) Автокорреляция кривой времени интенсивности флуоресценции события A215C на фиг. 2 D . Никакого спада автокорреляции на приблизительной шкале времени в миллисекундах невозможно различить. ( D ) Взаимная корреляция временных следов интенсивности донора и акцептора одного и того же события A215C.На приблизительной шкале времени в миллисекундах не наблюдается ослабления корреляции, что указывает на отсутствие флуктуаций из-за изменений FRET.

Для дальнейшего количественного анализа мы сосредоточимся только на автокорреляциях доноров, поскольку флуктуации донорского сигнала являются прямой мерой эффективности FRET, на которую не влияют перекрестные помехи между донором и акцептором (21). Кривые взаимной корреляции использовались только в качестве дополнительной проверки качества: ни одно из использованных событий не показало положительной взаимной корреляции в масштабе времени приблизительно миллисекунды.Подгонка автокорреляций T324C ( n = 16, всего ≈500 шагов; см. Рис. S3 для дополнительных кривых) с уравнением. 2 дало амплитуду 0,18 ± 0,02 (среднее ± SEM) и время затухания 2,4 ± 0,4 мс для экспоненциального вклада FRET. Среднее время шага составило 15,0 ± 1,6 мс, что было получено с помощью гауссовой аппроксимации временных кривых (15). Для S43C ( n = 19) мы нашли амплитуду 0,17 ± 0,02, время затухания 2,5 ± 0,3 мс и время шага 12,1 ± 0,7 мс (см.рис.S4 для дополнительных кривых). Время затухания вклада FRET значительно короче, чем время шага, что указывает на то, что переключение между различными состояниями FRET происходит в пределах одного шага. Кинетическая модель требуется для преобразования амплитуд и времен затухания в эффективности FRET и время жизни отдельных состояний. В простейшей кинетической схеме с двумя состояниями кинезин переключается из состояния без FRET с обоими моторными доменами, связанными с MT, в состояние FRET и обратно, завершая шаг 8 нм. Используя эту модель (ур. 3 в материалах и методах ), мы вычисляем, что кинезин T324C (S43C) переключается между состоянием без FRET со временем жизни 12 ± 2 мс (7,9 ± 0,8 мс) и состоянием FRET со временем жизни 3,0 ± 0,9 мс ( 3,7 ± 0,6 мс) и эффективность FRET 0,88 ± 0,12 (0,69 ± 0,06). Эти значения указывают на то, что шаговый цикл кинезина включает пока неразрешенное промежуточное состояние с обоими моторными доменами в непосредственной близости, продолжающееся ≈3 мс при насыщающей концентрации АТФ.

Затем мы определили, как сигналы FRET кинезина S43C и T324C зависят от концентрации АТФ.По графикам интенсивности во времени мы рассчитали кажущуюся эффективность FRET и наблюдали, что она увеличивается с уменьшением концентрации АТФ для обеих конструкций (рис. S5), что согласуется с более ранними результатами для аналогичной конструкции 324 (9). Мы рассчитали автокорреляции донорных сигналов, подогнали их (рис. S3 и S4) и рассчитали время жизни и эффективность FRET, используя кинетическую схему с двумя состояниями. Обратите внимание, что для расчета срока службы и эффективности FRET из этой модели время шага двигателя требуется в качестве входного параметра (таблица S1): это не полная химио-механическая модель, которая также описывает зависимость скорости от концентрации АТФ.При использовании этого подхода время жизни как FRET, так и состояния без FRET изменяется с концентрацией АТФ (Таблица S1). Связывание АТФ ограничивает скорость при низких концентрациях (22), и можно было бы ожидать, что время жизни только одного из состояний зависит от АТФ. Это противоречие указывает на то, что хемо-механическая модель, включающая зависимость скоростей от концентрации АТФ, должна быть более сложной и включать дополнительные состояния. Наши данные изначально зашумлены из-за ограниченного числа обнаруженных фотонов.Более сложные модели создают несколько проблем: их автокорреляции во многих случаях сложнее, чем одинарная экспонента (23), и требуются дополнительные свободные параметры. Чтобы обойти эти проблемы, мы рассмотрели ограниченную циклическую химико-механическую модель с тремя состояниями (см. Материалы и методы ) с двумя состояниями, идентичными модели с двумя состояниями, использованной выше: состояние без FRET, с обоими моторными доменами MT -связанное и состояние FRET, промежуточное. Третье состояние имеет время жизни, зависящее от АТФ, рассчитанное с использованием кинетики Михаэлиса-Ментен (уравнение. 4 в Материалы и методы ). Это состояние является состоянием ожидания АТФ, описанным в справочниках. 9 и 14. При 2 мМ АТФ его время жизни пренебрежимо мало, и модель сводится к двум состояниям. Только эффективность FRET этого состояния была свободным параметром. Время жизни и эффективность FRET двух других состояний были взяты из моделирования двух состояний (при насыщении АТФ) и оставались постоянными. Автокорреляции были рассчитаны по временным графикам, созданным с использованием моделирования Монте-Карло, с использованием одной экспоненты (рис.S6), и полученные времена и амплитуды затухания сравнивались с экспериментально полученными. Хорошее описание экспериментально полученных параметров было достигнуто с использованием эффективности FRET 0,6 ± 0,1 (0,40 ± 0,15) для состояния ожидания АТФ T324C (S43C) (фиг. 4 и фиг. S7). Обратите внимание, что моделирование с эффективностью FRET состояния ожидания АТФ, равной эффективности состояния с высоким FRET или без FRET, несовместимо с нашими экспериментальными данными, что указывает на то, что АТФ-зависимое состояние является отдельным состоянием, структурно отличным от состояния без FRET. -FRET и состояния с высоким FRET.Взятые вместе, наши данные и анализ показывают, что шаг кинезина при различных концентрациях АТФ можно описать с помощью модели с тремя состояниями, с ( i ) состоянием без FRET со временем жизни ≈12 мс, ( ii ) средой. -FRET состояние с ATP-зависимым временем жизни и ( iii ) состояние с высоким FRET со временем жизни ≈3 мс.

Модель с тремя состояниями описывает АТФ-зависимость сигналов FRET кинезина T324C. Амплитуды ( A ) и времена затухания ( B ) автокорреляционного затухания FRET.Символы представляют значения, полученные из автокорреляций измеренных временных кривых [среднее значение ± стандартная ошибка среднего, n = 16 (2 мМ АТФ), 9 (50 мкМ АТФ), 5 (20 мкМ АТФ)]. Линии представляют моделирование методом Монте-Карло с пятью различными значениями эффективности FRET состояния ожидания АТФ ( E _{FRET ATP} ). Все остальные параметры оставались неизменными ( T _{NO FRET} = 12,0 мс, E _{NO FRET} = 0, T _{HIGH FRET} = 3.0 мс, E _{HIGH FRET} = 0,88, K _M = 19 мкМ).

Обсуждение

Как эти три состояния вписываются в химико-механический цикл кинезина? Автокорреляционный анализ инвариантен к порядку состояний. Мы полагаем, однако, что промежуточное состояние с высоким FRET ≈3 мс следует за связыванием АТФ с безнуклеотидным двигательным доменом и предшествует высвобождению АДФ из другого двигательного домена, поскольку его время жизни соответствует времени высвобождения АДФ после погони за АТФ. (3.3 мс) (24). Кроме того, широко распространено мнение, что за связыванием АТФ следует быстрое изменение до «закрытой» конформации, обеспечивающее гидролиз (25, 26) и стыковку шейного линкера (27). Новое сформированное состояние может соответствовать наблюдаемому нами промежуточному продукту с высоким FRET. Это промежуточное состояние [3] (рис. 5) сопровождается смещением вперед и прикреплением несвязанного моторного домена к MT, высвобождая ADP. В результирующем состоянии [1], когда оба моторных домена связаны с МТ, длительностью ≈12 мс, АТФ гидролизуется и фосфат высвобождается из конечного моторного домена.Затем мотор находится в состоянии ожидания АТФ [2] со средней эффективностью FRET, указывая на то, что только один моторный домен тесно связан с МТ, что согласуется с некоторыми более ранними исследованиями (9, 14). Кроме того, промежуточное значение FRET предполагает, что связанный с АДФ моторный домен чередуется между конфигурациями [1] и [3], или что он привязан и может свободно перемещаться в пределах нескольких нанометров. В этом состоянии гибкость АДФ-связанного моторного домена может быть относительно большой, поскольку оба шейных линкера, которые вместе образуют связь между моторными доменами, скорее всего, отсоединены (27, 28).На основе наших результатов мы не можем различить, когда привязанный моторный домен находится в довольно фиксированном, промежуточном положении или является подвижным. Недавние исследования с использованием поляризации флуоресценции одной молекулы (29) и оптического захвата микросферы, прикрепленной непосредственно к одному из моторных доменов (30), предоставили доказательства гибкости привязанного моторного домена. Затем, после связывания АТФ, шейный линкер плотно связанного с МТ моторного домена стыкуется с последующим образованием пучка покров-шейка, притягивая АДФ-связанный моторный домен ближе, возвращаясь в состояние с высоким FRET [3] (27 , 31).Мы наблюдали FRET только с использованием кинезина, меченного в положениях 324 и 43, а не 149 и 215. Это открытие предполагает, что в состоянии с высоким FRET [3] только один моторный домен связан с МТ, а другой ориентирован. и транслируется таким образом, что расстояния 324–324 и 43–43 короче ≈4.5 нм, тогда как расстояния 149–149 и 215–215 больше ≈6 нм ( SI Text ). Эти ограничения по расстоянию выполняются конфигурациями, в которых оба основания шейного линкера относительно близко друг к другу, а фронты моторных доменов направлены друг от друга (рис.S8). Эффективность FRET в состоянии [3] выше, чем в состоянии ожидания АТФ [2], что указывает на то, что в среднем моторные домены расположены ближе друг к другу, что согласуется с шейным линкером АТФ-связанного моторного домена, который стыкуется, укорачивая связь между обоими моторными доменами (27, 31).

Химио-механическая интерпретация модели трех состояний. В состоянии без FRET [1] оба моторных домена прочно связаны с MT и находятся на расстоянии 8 нм друг от друга. АТФ гидролизуется, и фосфат высвобождается из конечного моторного домена, что приводит к состоянию ожидания АТФ [2] с промежуточной эффективностью FRET, когда один моторный домен тесно связан, а другой связан.Последующее связывание АТФ с передним моторным доменом вызывает стыковку его шейного линкера, перемещая хвост кинезина на 8 нм вперед, что приводит к промежуточному состоянию с высоким FRET [3]. В этом состоянии только один моторный домен связан с МТ, а другой близок, так что может возникнуть FRET. После этого промежуточного состояния несвязанный моторный домен (голубой) движется вперед к следующей стороне связывания на МТ, высвобождая АДФ. Указаны времена жизни ( T ) и эффективность FRET ( E _FRET ) конструкции T324C.

В широкопольных исследованиях флуоресценции одиночных молекул, использующих нанометровую локализацию индивидуального моторного домена (5, 7), не удалось выявить ступенчатые промежуточные соединения, скорее всего, из-за ограниченного разрешения по времени. В недавнем широкомасштабном исследовании FRET одной пары с использованием конструкций, аналогичных нашей (9), было показано, что в состоянии ожидания АТФ только один моторный домен связан с МТ, а другой находится в пределах расстояния FRET, что согласуется с наши результаты. Однако этому исследованию не хватало временного разрешения для разрешения наблюдаемого здесь состояния FRET с высотой 3 мс.Они утверждали, что при высоких концентрациях АТФ кинезин совершает быстрые переходы из одного состояния, связанного с двумя моторными доменами, в другое без промежуточных звеньев. Напротив, наши данные показывают, что при насыщающих концентрациях АТФ кинезин проводит значительное количество времени (20-30%) в состоянии, связанном с одним моторным доменом (см. Ниже). Мы предпочитаем модель, в которой при всех концентрациях АТФ связывание АТФ с ведущим моторным доменом может происходить только после того, как замыкающий, связанный с АДФ моторный домен высвобождается из МТ, высвобождая напряжение между моторными доменами (8).После связывания АТФ связанный с АДФ моторный домен остается свободным от МТ в течение 3 мс перед связыванием со следующим сайтом связывания.

В отличие от наших данных, никаких подшагов не наблюдалось в экспериментах по оптическому захвату, измеряющих смещение микросферы, прикрепленной к хвосту кинезина, с временным разрешением 50 мкс (11, 32). Это кажущееся противоречие может указывать на то, что переходы в расположении моторных доменов не во всех случаях приводят к движению моторного хвоста. Наши данные не предоставляют прямых доказательств различения между 8-нм шагом кинезинового хвоста, происходящим после высвобождения АДФ (от [3] до [1]) или сразу после связывания АТФ (от [2] до [3]).Однако сильная поддержка последней точки зрения была предоставлена ​​в других исследованиях (8, 27, 32). Кроме того, недавнее моделирование молекулярной динамики показало, что за связыванием АТФ следует стыковка шейного линкера и последующее образование β-цепи с участием остатков шейного линкера и N-концевой покрывающей цепи (связка покров-шейка) (33). . Эксперименты по оптическому захвату подтвердили идею о том, что степпинг кинезина обеспечивается за счет образования этого пучка покров-шейка (29). Такой механизм со смещением на 8 нм, индуцированным АТФ-управляемым крупномасштабным конформационным изменением, согласуется с нашими выводами.В заключение, одномоторные эксперименты FRET, основанные на конфокальной флуоресцентной микроскопии, предоставили нам наблюдаемый параметр и временное разрешение, чтобы различить до сих пор скрытый промежуточный продукт в шаговом цикле Kinesin-1. Эта промежуточная конфигурация может играть ключевую роль в направлении домена шагового двигателя вперед, к плюсовому концу MT, к следующему сайту связывания.

Материалы и методы

Одномолекулярные эксперименты.

Были приготовлены четыре гомодимерных кинезиновых конструкции с одним цистеином, начиная с бесцистеиновой (cys, преобразованной в ala), повсеместно распространенной конструкции кинезина человека длиной 560 аминокислотных остатков (15).Цистеины были введены в положения 324, 43, 215 и 149 (Энтелехон), что подтверждено секвенированием. Кинезины экспрессировали, очищали и метили с пятикратным избытком как Alexa555, так и Alexa647 (Invitrogen), как описано в ссылке. 15. Экспериментальная установка и анализ (15) были модифицированы для одновременного обнаружения донорной и акцепторной флуоресценции. После прохождения через дихроичное зеркало 550DCLP (Chroma) флуоресценция была разделена на два канала вторым дихроичным зеркалом, 645DCXR (Chroma), и отфильтрована эмиссионными фильтрами HQ575 / 50 или HQ675 / 50 (Chroma).Вместо 4 мМ DTT мы использовали 5 мМ TROLOX (Sigma – Aldrich) в смеси образцов и не добавляли таксол. Система регенерации АТФ использовалась при всех концентрациях АТФ (15, 34).

Анализ данных.

Временные кривые интенсивности флуоресценции (с временными интервалами 10 мс) одиночных кинезинов, проходящих через конфокальное пятно, были подогнаны к гауссиану для получения амплитуды, ширины и смещения. Данные были ограничены фоновым сигналом ≈100 мс по обе стороны от события для подгонки и дальнейшего анализа.Соответствующее смещение (темновые подсчеты и фоновая флуоресценция) использовалось для коррекции фона, а амплитуды донорных и акцепторных каналов использовались для выбора событий, в которых присутствовали обе метки. Кроме того, в анализ включались события, в которых сигнал пропадал из-за обесцвечивания или отслоения, только когда они пересекали более половины конфокального объема. Для них применялись те же критерии, за исключением того, что не учитывались интенсивности флуоресценции после отслоения или фотообесцвечивания.Скорректированные по фону следы интенсивности флуоресценции донора, x _i , и акцептора, x _j , были объединены при Δ t = 0,1 мс и были перекрестными ( i ≠ j ) и автокоррелированной ( i = j ) с использованием: где N обозначает общее количество интервалов времени события. Кросс- и автокорреляции, полученные с использованием уравнения. 1 не нормализуются и затухают до нуля при больших временах запаздывания.Полученные таким образом корреляции были дополнены: где T _FRET — постоянная затухания, а A — относительная амплитуда затухания из-за FRET, N — амплитуда корреляции, α — коэффициент, описывающий ширину нашего конфокального объема [мы зафиксировали до α = 760 (= 4 * σ _пятно )], а T _step — среднее время шага. Термин, включающий T _T , является эмпирическим термином, добавленным для коррекции искажений от идеальной гауссовой формы временных следов из-за обесцвечивания фотографий, приземления, отслоения и стохастической природы шага (15).Все корреляционные кривые были нормализованы путем деления значений корреляции на амплитуду, N . Обратите внимание, что здесь мы переключились на непрерывную переменную времени задержки τ. При заданных условиях значения времени затухания ( T _FRET ) и амплитуды ( A ) вклада FRET, полученные из подгонок к автокорреляциям, были усреднены. Эти средние значения были использованы для дальнейшего анализа с использованием модели с двумя и тремя состояниями (см. Ниже).

Автокорреляция стохастической кинетической схемы с двумя состояниями.

Теоретическое описание автокорреляции модели, в которой интенсивность флуоресценции донора циклически меняется между состоянием без FRET (NF) и состоянием с FRET (F), дается следующими уравнениями [заимствовано из Torres et al. (20)]: где k _NF и k _F — скорости выхода из состояния без FRET и FRET соответственно, E _F — эффективность FRET состояния FRET, k _step — скорость шага, а T _step — среднее время шага проходящего двигателя.Здесь эффективность FRET состояния без FRET, E _NF , установлена ​​на ноль. В наших экспериментах мы ожидали состояния с обоими моторными доменами, связанными с МТ и разделенными на 8 нм. Мы подсчитали, что для такого состояния ожидается эффективность FRET <0,05 [при условии, что расстояние Ферстера составляет 5,1 нм для пары FRET, Alexa Fluor 555 и 647 (молекулярные зонды)]. Кроме того, мы устанавливаем сумму времен жизни обоих состояний равной среднему времени шага (уравнение 3c ).

Расчет параметров модели с двумя состояниями на основе экспериментальных автокорреляций.

Из среднего времени затухания ( T _FRET ) и амплитуды ( A ), полученных из подгонок к экспериментальным автокорреляциям, скорости и эффективности FRET были рассчитаны с использованием уравнения. 3 а — в . Таким образом были получены два набора решений. Два раствора различаются по их усредненным по времени относительным интенсивностям доноров. «Правильный» раствор был выбран после сравнения относительных донорных интенсивностей двух растворов с экспериментально полученными значениями.Экспериментальные значения были определены путем деления средней донорной интенсивности событий, связанных с кинезинами, меченными как донором, так и акцептором, на интенсивность событий, связанных с кинезинами, меченными только одним донором.

Моделирование Монте-Карло зависимости сигналов FRET от АТФ с использованием циклической трехуровневой химико-механической модели.

Мы предположили циклическую модель с тремя состояниями без обратных реакций. Чтобы ограничить количество свободных параметров, мы зафиксировали время пребывания и интенсивности двух состояний на значениях, полученных с помощью модели двух состояний при концентрациях 2 мМ АТФ.Мы позволили времени жизни третьего состояния изменяться в зависимости от концентрации АТФ (так, чтобы его время жизни было незначительным при 2 мМ АТФ), и оставили только эффективность FRET этого состояния ожидания АТФ в качестве свободного параметра. Время жизни состояния ожидания АТФ, T _{Ожидание АТФ} , было получено из следующей производной уравнения Михаэлиса-Ментен: где k _cat — максимальная скорость шага двигателя, K _M — концентрация, при которой двигатель движется с половинной скоростью, а [ ATP ] — концентрация АТФ.Константа Михаэлиса ( K, _M, , = 19 ± 8 мкМ) была получена из подбора комбинированных средних скоростей обеих конструкций (T324C и S43C).

Используя эту модель, мы создали временные кривые интенсивности доноров с помощью программного обеспечения для моделирования, написанного в LabVIEW (National Instruments), на основе подхода Монте-Карло. Как правило, моделировалось 15 000 циклов. Следы были получены для 20 концентраций АТФ и различной эффективности FRET в состоянии ожидания АТФ.По смоделированным временным графикам были рассчитаны автокорреляции, которые были аппроксимированы экспоненциальной функцией, дающей амплитуду и время затухания.

Благодарности

Эта работа была поддержана стипендией Види Исследовательского совета по наукам о Земле и о жизни и является частью исследовательской программы Stichting voor Fundamenteel Onderzoek der Materie, которая финансируется Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek.

Сноски

• ² Кому следует направлять корреспонденцию.Эл. Почта: erwinp {at} nat.vu.nl

• Вклад авторов: E.J.G.P. спланированное исследование; С.В. и З.Л. проведенное исследование; С.В. и З.Л. проанализированные данные; и S.V., Z.L. и E.J.G.P. написал газету.

• Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

• Эта статья представляет собой прямое представление PNAS.

• Эта статья содержит вспомогательную информацию на сайте www.pnas.org/cgi/content/full/07106/DCSupplemental.

Автомобильную промышленность беспокоят большие провалы в расходе топлива, такие как признание Hyundai

Hyundai Motor Co о завышении заявлений об экономии топлива на некоторых из своих самых продаваемых автомобилей, что обеспокоило отрасль, и среди руководителей и аналитиков в Лос-Анджелесе появилось много спекуляций. Авто покажет, что другим автопроизводителям, возможно, придется сделать то же самое.

Четыре недели назад Hyundai и ее дочерняя компания Kia Motors Corp признали, что они завысили экономию топлива по крайней мере на милю на галлон более чем 1 миллиона недавно проданных автомобилей.

«Я думаю, мы могли бы увидеть больше этого», — сказал Джейк Фишер, руководитель отдела автомобильных испытаний Consumer Reports. «Есть и другие автомобили, которые не соответствуют оценкам Агентства по охране окружающей среды».

Hyundai, маркетинговые кампании которой были сосредоточены на превосходной экономии топлива, говорит, что до сих пор ее U.На продажи S. допуск не повлиял. Но ему пришлось провести компенсационную кампанию, которая, по оценкам Moody’s Investors Service, может стоить им 100 миллионов долларов в год до тех пор, пока автомобили не будут отправлены на слом. Он также сталкивается с судебными исками по этому поводу.

Для отрасли есть смысл подвергаться тщательной проверке, — сказал Гэри Силберг, лидер национальной автомобильной промышленности КПМГ.

«Мы из аудиторской фирмы. В ходе аудита вы узнаете, что если вы обнаружите одно отклонение от нормы, вам придется протестировать еще несколько», — сказал Силберг.«Могу ли я предположить, что есть и другие».

Автопроизводители тоже отметили давление.

«Я думаю, что каждый производитель сделал то, что делали мы, вернулся и сказал:« Это реальные цифры? »- сказал Аль Кастинетти, вице-президент одноименного бренда Nissan Motor Co в США.

Кастинетти и руководители автомобильных компаний General Motors Co, Toyota Motor Corp, Honda Motor Co, Mazda Motor Corp, Chrysler Group LLC и североамериканского подразделения Fiat SpA заявили, что они уверены, что их заявления о пробеге верны.

ЛЮБОЙ ПРОБЛЕМ

Измерение экономии топлива может быть непростым делом — проблема хорошо освещена седаном Ford Motor Co Fusion, победившим в номинации «Зеленый автомобиль года» на автосалоне в Лос-Анджелесе.

Гибрид Fusion оценивается в 47 миль на галлон, хотя ранние тесты, проведенные журналом Consumer Reports, показывают, что гибрид Fusion, как и другие гибриды, которые были протестированы, не приблизился к этой цифре.

Представитель Ford Уэс Шервуд сказал, что компания ожидает увидеть более широкий диапазон экономии топлива на своих гибридах нового поколения, поскольку не требует от водителей компромиссов в отношении характеристик автомобиля.

«Если вы хотите ездить с максимальной экономией топлива, у машины есть инструменты. Вы можете это сделать», — сказал Шервуд. «Если вы хотите ехать со скоростью 80 миль в час по шоссе, вы не получите 47 миль на галлон».

Гибрид — это автомобиль с более чем одним источником энергии, таким как электродвигатель и двигатель внутреннего сгорания, или электродвигатель с аккумулятором и топливными элементами для хранения энергии.

HYUNDAI MEA CULPA

Во время одного из первых публичных выступлений руководителя Hyundai по проблеме пробега, глава Hyundai Motor America Джон Крафчик в среду выступил на автосалоне, подчеркнув, как много сделал автопроизводитель, чтобы исправить ситуацию. .

«Мы разослали письма владельцам всех пострадавших автомобилей», — сказал Крафчик. «Мы разговаривали с тысячами по телефону, электронной почте и лично в наших представительствах».

Фишер из Consumer Reports сказал, что в конце концов потребители не откажутся от Hyundai. По его словам, для большинства потребителей не имеет значения, составляет ли пробег по шоссе 38 миль на галлон или 40 миль на галлон.

Однако, добавил он, некоторые люди обратили на это внимание, и он сказал, что для всех автопроизводителей было бы разумно убедиться, что их заявления соответствуют действительности.

«Фактическая экономия топлива, это действительно не так уж важно, — сказал Фишер. «Вопрос в том, доверяете ли вы этому автопроизводителю? Строят ли они безопасные автомобили? Собираются ли они обмануть где-нибудь еще, что касается безопасности или чего-то еще?»

Автомобильная промышленность обеспокоена большими потерями в расходе топлива, как у Hyundai

ЛОС-АНДЖЕЛЕС (Рейтер) — <005380.KS> Hyundai Motor Co завышает требования об экономии топлива на нескольких своих самых продаваемых автомобилях, что обеспокоило отрасль, поскольку среди руководителей и аналитиков на автосалоне в Лос-Анджелесе распространялись слухи о том, что больше автопроизводителям, возможно, придется сделать то же самое.

Четыре недели назад Hyundai и ее дочерняя компания Kia Motors Corp <000270.KS> признали, что они завысили экономию топлива по крайней мере на милю на галлон более чем 1 миллиона недавно проданных автомобилей.

«Я думаю, мы могли бы увидеть больше этого», — сказал Джейк Фишер, руководитель отдела автомобильных испытаний Consumer Reports. «Есть и другие автомобили, которые не соответствуют оценкам Агентства по охране окружающей среды».

Hyundai, маркетинговые кампании которой были сосредоточены на превосходной экономии топлива, заявляет, что до сих пор ее U.На продажи S. допуск не повлиял. Но ему пришлось провести компенсационную кампанию, которая, по оценкам Moody’s Investors Service, может стоить им 100 миллионов долларов в год до тех пор, пока автомобили не будут отправлены на слом. Он также сталкивается с судебными исками по этому поводу.

«Для отрасли есть смысл подвергаться тщательному анализу», — сказал Гэри Силберг, лидер национальной автомобильной промышленности КПМГ.

«Мы из аудиторской фирмы. В ходе аудита вы узнаете, что если вы обнаружите одно отклонение от нормы, вам придется протестировать еще несколько», — сказал Силберг.«Могу ли я предположить, что есть и другие».

Автопроизводители тоже отметили давление.

«Я думаю, что каждый производитель сделал то же, что и мы, вернулся и сказал:« Это реальные цифры? »- сказал Аль Кастинетти, вице-президент одноименного бренда Nissan Motor Co в США.

Кастинетти, а также руководители автомобильных компаний General Motors Co, Toyota Motor Corp <7203.T>, Honda Motor Co <7267.T>, Mazda Motor Corp <7261.T>, Chrysler Group LLC и североамериканского подразделения Fiat SpA. они уверены, что их заявления о пробеге верны.

ЛЮБОЙ ПРОБЛЕМ

Измерение экономии топлива может быть непростым делом — проблема хорошо освещена седаном Ford Motor Co Fusion, выигравшим «Зеленый автомобиль года» на автосалоне в Лос-Анджелесе.

Гибрид Fusion оценивается в 47 миль на галлон, хотя ранние тесты, проведенные журналом Consumer Reports, показывают, что гибрид Fusion, как и другие гибриды, которые были протестированы, не приблизился к этой цифре.