Какие двигатели ставят на лада х рей: Двигатели Лада Икс Рей | Какие моторы, проблемы, масло

Джулия Надь

¹ Институт биофизики, Ульмский университет

Йенс Михаэлис

¹ Институт биофизики, Ульмский университет

¹ Институт биофизики, Ульмский университет

Abstract

Одномолекулярный резонансный перенос энергии Фёрстера (smFRET) можно использовать для получения структурной информации о биомолекулярных комплексах в реальном времени. Таким образом, несколько измерений smFRET используются для локализации неизвестного положения красителя внутри белкового комплекса посредством трилатерации. Для получения количественной информации система нанопозиционирования (NPS) использует вероятностный анализ данных для объединения структурной информации из рентгеновской кристаллографии с данными флуоресценции одиночных молекул для расчета не только наиболее вероятного положения, но и полного трехмерного распределения вероятностей. , названный апостериорным, что указывает на экспериментальную неопределенность.Эта концепция была обобщена для анализа сетей smFRET, содержащих множество молекул красителя. Последняя версия NPS, Fast-NPS, включает новый алгоритм, использующий оценку байесовских параметров на основе выборки методом Монте-Карло цепи Маркова и параллельного темперирования, что позволяет анализировать большие сети smFRET за сравнительно короткое время. Более того, Fast-NPS позволяет рассчитать апостериор, выбирая одну из пяти различных моделей для каждого красителя, которые учитывают различное пространственное и ориентационное поведение, демонстрируемое молекулами красителя из-за их локального окружения.

Здесь мы представляем подробный протокол для получения данных smFRET и применения Fast-NPS. Мы предоставляем подробные инструкции для получения трех входных параметров Fast-NPS: значений smFRET, а также квантового выхода и анизотропии молекул красителя. Недавно NPS использовался для выяснения архитектуры открытого промоторного комплекса архей. Эти данные используются для демонстрации влияния пяти различных моделей красителей на апостериорное распределение.

Ключевые слова: Биохимия, Выпуск 120, Система нанопозиционирования, Fast-NPS, флуоресценция одиночных молекул, резонансный перенос энергии Фёрстера одиночных молекул, структурная биология

Введение

Определение структуры биомолекулы является ключевым предварительным условием для понимания его функции.Два хорошо зарекомендовавших себя метода определения структуры — это криоэлектронная микроскопия и рентгеновская кристаллография1,2. Сегодня оба метода предоставляют структурную информацию с высоким разрешением и разрешением вплоть до ангстрема. Эти два метода широко используются для выяснения структуры больших биомолекул, таких как белковые комплексы. Хотя существующие методы постоянно совершенствовались на протяжении последних десятилетий, сложность биологических структур по-прежнему представляет собой серьезную проблему для структурной биологии, особенно при исследовании больших, динамических и переходных комплексов3.

Чтобы изучить динамику макромолекулярных комплексов и, в частности, взаимосвязь между структурой и функцией, методологии исследования отдельных молекул предоставили полезную информацию4. Было разработано несколько новых стратегий, обеспечивающих ортогональный подход к получению структурной и динамической информации. Примерами являются высокоскоростной AFM5, механические манипуляции6, флуоресцентная микроскопия локализации7, а также одномолекулярный резонансный перенос энергии Ферстера (smFRET) 8,9. С самого начала FRET был назван молекулярной линейкой из-за зависимости расстояния от масштаба биомакромолекул10.

Одним из особенно интересных приложений smFRET является использование информации о расстоянии, полученной из измерений smFRET, для вывода структурной информации11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23. Благодаря высокому временному разрешению smFRET положение мобильных частей белковой структуры может быть локализовано. Однако, чтобы извлечь количественную информацию из данных smFRET, во время измерения необходимо определить важные поправочные параметры о молекулах красителя24. С этими поправочными коэффициентами эффективность FRET E _FRET может быть рассчитана по формуле

,

, где I _A и I _D — интенсивности флуоресценции молекулы донора и акцептора. соответственно (см. Рисунок 2 ).Β-фактор учитывает перекрестные помехи, утечку излучения донора в канал акцептора и рассчитывается по формуле

, где I ‘ _A и I’ _D — интенсивности флуоресценции донора и молекула-акцептор после фотообесцвечивания молекулы-акцептора.

γ-фактор корректирует разницу в относительной эффективности обнаружения в двух каналах, а также разницу в квантовом выходе флуоресценции донорного и акцепторного красителей.Он рассчитывается по каждому индивидуальному временному графику с помощью

. Обратите внимание, что это описание не учитывает прямое возбуждение акцепторной молекулы, которое иногда становится важным и также требует корректировки. Для определения этих поправочных коэффициентов полезно возбуждать как донор, так и акцептор по чередующейся схеме25, чтобы различать фотофизические изменения и структурную динамику.

Для получения не только количественной эффективности smFRET, но и количественной структурной информации, в 2008 году была введена система нанопозиционирования (NPS).Название было выбрано на основе его сходства со спутниковой системой глобального позиционирования (GPS). NPS — это гибридный метод, объединяющий данные smFRET и рентгеновской кристаллографии для локализации неизвестных положений красителя в биомакромолекулярных комплексах. Кристаллическая структура служит опорным кадром, а результаты smFRET используются для получения информации о расстоянии между неизвестным положением флуорофора (антенна , ) и положением, известным из кристаллической структуры (спутник , ).В последовательных экспериментах измеряются расстояния между антенной и несколькими спутниками, и положение антенны определяется с помощью статистически строгой схемы анализа, основанной на оценке байесовских параметров. В результате вычисляется не только наиболее вероятное положение антенны, но и ее полное трехмерное распределение неопределенности, так называемое апостериорное, визуализируемое с помощью достоверных объемов. Кроме того, NPS был расширен, чтобы обеспечить возможность анализа полных сетей smFRET27.

NPS использовался для решения ряда важных вопросов эукариотической транскрипции, а именно, прохождения восходящей ДНК, нематричной ДНК и возникающей мРНК внутри комплекса элонгации РНК-полимеразы II12,28, что также демонстрирует эффект факторы инициации транскрипции26 и динамическая архитектура открытого промоторного комплекса29.Более того, NPS использовали для выяснения структуры открытого комплекса РНК-полимеразы архей 30 и, в частности, положения фактора инициации транскрипции TFE, который конкурентно связывается с тем же сайтом, что и фактор элонгации транскрипции Spt4 / 531.

С тех пор было опубликовано несколько структурных подходов на основе smFRET15,18,21,23. При сравнении различных структурных методов на основе smFRET становится ясно, что кажущаяся точность метода сильно зависит от конкретного выбора моделей красителя.Следует отметить, что молекулы красителя могут демонстрировать различное пространственное и ориентационное поведение в зависимости от их локального окружения.

С этой целью был введен Fast-NPS32. Fast-NPS использует расширенный алгоритм выборки, значительно сокращающий время вычислений. Кроме того, Fast-NPS позволяет выполнять структурный анализ, и для каждой молекулы красителя пользователь может выбрать из набора из пяти различных моделей красителя, которые будут описаны ниже. Самая консервативная модель, получившая название classic , предполагает, что краситель занимает только одну, но неизвестную позицию.В этом положении флуорофор может свободно вращаться внутри конуса, размер которого определяется его соответствующей (зависящей от времени) анизотропией флуоресценции. Ориентация конуса неизвестна, что приводит к большой погрешности при преобразовании измеренной эффективности smFRET в расстояния. В этом отношении модель консервативна, так как она дает наименьшую точность по сравнению с другими моделями красителей. Только для очень коротких расстояний допущения, сделанные классической моделью, должны приводить к заметно неправильному определению местоположения.Для типичных значений smFRET правильная позиция всегда заключена в сравнительно большой достоверный объем.

Однако, поскольку желательна более высокая точность, важно разработать и испытать альтернативные модели красителей, которые могут помочь повысить точность. Если краситель вращается намного быстрее, чем время его собственной флуоресценции, можно применить так называемую модель iso . Здесь коэффициент ориентации κ ² (необходимый для расчета характеристического изотропного радиуса Ферстера

) установлен равным 2/3.В результате рассчитанные достоверные объемы почти на два порядка меньше, чем в классической модели32. В случае, если флуорофор находится в среде, которая обеспечивает не только быструю переориентацию, но и дополнительное быстрое движение во всем доступном объеме, следует использовать модель meanpos-iso . В этой модели краситель эффективно занимает только одно среднее положение, где пространственное усреднение учитывается путем преобразования полиномиального расстояния15. Эта модель применима, например, если (обычно гидрофобный) краситель прикреплен к гидрофильной области, e.г., ДНК. Применение модели meanpos-iso приводит к дальнейшему уменьшению размера достоверных объемов примерно в два раза. Однако краситель, связанный с белком, может обратимо связываться с несколькими гидрофобными участками в своем стерически доступном объеме (AV). Флуорофор, который мгновенно переключается между этими областями, но внутри одной области подвергается свободному вращению и быстрому локализованному движению, лучше всего описывается моделью var-meanpos-iso . Для аналогичной ситуации, в которой краситель не может свободно вращаться, применяется модель var-meanpos .Более подробную информацию об этих моделях можно найти в нашей недавней публикации32.

Эти модели обладают обширным репертуаром, специально предназначенным для учета различных сред, с которыми может столкнуться краситель, и их разумное применение оптимизирует точность его локализации. В Fast-NPS каждая молекула красителя, прикрепленная к определенному положению, может быть отнесена к отдельной модели, так что FRET-партнерам разрешено иметь разные модели. Это обеспечивает безграничное моделирование, приближенное к природе. Однако важно проводить строгие статистические тесты, чтобы гарантировать, что результат, полученный с помощью окончательной комбинации моделей, по-прежнему согласуется с экспериментальными данными.Эти тесты включены в программное обеспечение Fast-NPS.

Чтобы применить Fast-NPS к экспериментальным данным, требуется измерение (только) трех входных параметров. Во-первых, необходимо определить изотропные радиусы Фёрстера для каждой пары красителей (

). Следовательно, необходимо измерять квантовый выход (QY) донорного красителя, спектры излучения донорной флуоресценции и спектры поглощения акцептора. Эти измерения можно проводить в большом количестве, используя стандартный спектрометр и стандартный флуоресцентный спектрометр.Для каждой пары затем вычисляется R ₀ с помощью бесплатного программного обеспечения PhotochemCAD и может использоваться в анализе NPS. Более того, анизотропия флуоресценции (с временным разрешением) молекул красителя должна быть получена с использованием поляризационного (и временного) флуоресцентного спектрометра. Однако наиболее важными входными параметрами для Fast-NPS являются эффективности smFRET, измеренные на установке для флуоресцентной микроскопии одиночных молекул, такой как флуоресцентный микроскоп полного внутреннего отражения (TIRFM).

Здесь мы представляем пошаговый протокол для получения данных smFRET и применения Fast-NPS (, рис. 1, ).

Протокол

1. Предварительные условия и лабораторное оборудование

ПРИМЕЧАНИЕ: Сборка измерительной камеры изображена на Рис. 3 . Сэндвич-конструкция измерительной камеры состоит из трех основных компонентов: предметного стекла из кварцевого стекла (плавленого кварца), герметизирующей пленки и покровного стекла, закрывающего проточную камеру. Измерительная камера устанавливается на специальный держатель образца.Размеры камеры для образцов и металлического держателя соответствуют стандартному предметному стеклу из кварцевого стекла для микроскопии (76 мм x 26 мм).

1. Вырежьте предметные стекла из кварцевого стекла с помощью алмазного сверла (0,75 мм) в положениях, указанных на Рисунок 4 . Конструкция слайдов из кварцевого стекла асимметрична, чтобы различать две стороны каждого слайда. ПРИМЕЧАНИЕ. Кварцевые предметные стекла можно использовать повторно после измерения до появления царапин на поверхности.

2. Для установки камер используйте индивидуальные металлические держатели образцов, как показано на Рисунок 5 .Держатели образцов имеют две резьбы (M4) для соединения впускной и выпускной трубок для проточной камеры. Кроме того, используйте резьбу (M3), чтобы установить камеру для образца на металлический держатель, а также резьбу (M3), чтобы закрепить держатель призмы на нижней половине металлического держателя.

3. Выполните измерения smFRET на флуоресцентном микроскопе полного внутреннего отражения призменного типа (TIRFM) (, рис. 6, ). ПРИМЕЧАНИЕ: TIRFM включает три лазера: зеленый (532 нм, Nd: YAG-лазер) и красный лазер (643 нм, диодный лазер) для возбуждения донорных и акцепторных молекул красителя, а также синий лазер (491 нм. , твердотельный лазер с диодной накачкой) для обесцвечивания фоновых флуоресцентных примесей на камере для образца перед измерением smFRET.Три лазерных луча пространственно объединены и могут быть выбраны с помощью акустооптического перестраиваемого фильтра (AOTF). Флуоресцентный свет собирается объективом с высокой апертурой, разделяется на донорный и акцепторный каналы с помощью дихроичного зеркала и проецируется на две камеры EM-CCD. Камера для образца прикреплена к микрометрическому столику, позволяющему перемещаться в направлениях x и y с помощью двух шаговых двигателей. Третий пьезодвигатель используется вместе с ИК-лазером и позиционно-чувствительным детектором для создания системы автоматической фокусировки, обеспечивающей оптимальную фокусировку на протяжении всего эксперимента.

   1. Используйте переменное лазерное возбуждение (ALEX), когда наблюдается динамика временных траекторий FRET ²⁵ . Такая динамика может быть вызвана либо конформационными изменениями внутри молекул, либо флуктуациями яркости акцептора и мерцанием акцептора. ПРИМЕЧАНИЕ: ALEX позволяет различать эти две возможные причины и предотвращает неправильную интерпретацию динамических траекторий FRET. Однако из соображений простоты протокольная часть ограничивается анализом фильмов, снятых без ALEX.Внимание: лазеры класса 3B используются в установке флуоресценции одиночных молекул. Перед запуском системы убедитесь, что приняты соответствующие меры безопасности при работе с лазером в соответствии с постановлениями местного правительства.

4. Выполните измерение поглощения, используемое для определения квантового выхода на спектрометре UV-VIS (см. Материалы и методы).

5. Выполните измерение спектра излучения донорной флуоресценции, спектра поглощения акцептора и анизотропии флуоресценции на флуоресцентном спектрометре (см. Материалы и методы).

6. Подготовьте камеры для проб в соответствии с опубликованными процедурами 33. В качестве альтернативы можно использовать процедуру, описанную в [34].

7. Пометьте исследуемые образцы парой молекул донорно-акцепторного красителя, подходящей для smFRET, и убедитесь, что на поверхности камеры для образцов имеется фрагмент биотина для иммобилизации. ПРИМЕЧАНИЕ. Чтобы локализовать неизвестное положение красителя антенны с помощью программного обеспечения Fast-NPS, необходимы различные образцы конструкций. Каждая конструкция должна иметь одну метку в неизвестном положении окраски антенны и одну метку в спутниковой позиции, известной из кристаллической структуры.Для получения точных результатов требуются по крайней мере три различных конструкции с красителями, прикрепленными к позиции антенны, и три различных позиции спутника. Измерения между антеннами, а также между спутниками также полезны для повышения точности, однако для этого требуется обмен молекулами красителя, который необходимо правильно ввести в анализ.

2. Установка проточных камер в специальный держатель

1. Протяните силиконовую трубку (внутренний диаметр 0,8 мм, внешний диаметр 2,4 мм) в полые винты с выступом (M4) и обрежьте трубку с обоих концов ровно, оставив выступ 1 см с обеих сторон острым лезвием бритвы.Отрегулируйте выступ трубки примерно на 2 мм с одной стороны винта с выступом.

2. Установите проточную камеру в держатель образца таким образом, чтобы отверстия в предметном стекле из кварцевого стекла совпадали с резьбой держателя образца. Осторожно затяните впускные и выпускные винты, чтобы убедиться, что вход и выход камеры для пробы по-прежнему проницаемы. Осторожно затяните четыре винта держателя акрилового стекла, чтобы зафиксировать положение проточной камеры.

3. Обрезанная силиконовая трубка (0.58 мм ВД, 0,96 мм ВД) на куски длиной 20 см. Вставьте одну из частей во входной и выходной винт измерительной камеры. Закройте впускной и выпускной трубопровод с помощью зажима. ПРИМЕЧАНИЕ. Собранные камеры для проб можно хранить при комнатной температуре до двух недель.

3. Измерение smFRET на микроскопе TIRF

1. Используйте шприц, чтобы промыть камеру для образца 500 мкл PBS. Постоянно предотвращайте попадание пузырьков воздуха в камеру для образцов, создавая каплю на конце впускной трубки перед переходом на другой буферный раствор.

2. Промойте камеру для образцов раствором 100 мкл нейтравидина (0,5 мг / мл в PBS) и инкубируйте 15 мин при комнатной температуре.

3. Промойте раствор нейтравидина 500 мкл PBS.

4. Навинтите металлический держатель призмы на камеру для образца.

5. Установите камеру для образца на микрометрический столик TIRF-микроскопа. Убедитесь, что камера для образцов установлена ​​горизонтально как можно прямее перед объективом, чтобы избежать расфокусировки во время сканирования.

6. Запустите программное обеспечение для управления камерами EM-CCD и программное обеспечение для управления пьезодвигателями сцены.

7. Отрегулируйте фокусировку объектива микроскопа, глядя на отражение ИК-лазера.

8. Поместите призму (PS991, n = 1,52) поверх металлического держателя призмы. Отрегулируйте боковое положение призмы, чтобы лазерные лучи попадали на призму, затем используйте клей и инкубируйте с УФ-светом в течение 5 мин.ПРИМЕЧАНИЕ. Установленную призму можно повторно использовать после очистки.

9. В программном обеспечении управления камерой нажмите «Настройка сбора данных» и определите следующие параметры сбора данных: время интегрирования 100 мс, 401 кадр / видеоролик (зеленая камера), 400 кадров / видеоролик (красная камера), коэффициент усиления электронного умножителя 225, предварительный — усиление 5x и скорость считывания 3 МГц при 14 битах.

10. Создайте папку на локальном жестком диске для измерения. Выберите желаемое имя для файлов измерений, e.грамм. , год-месяц-день. В настройках программы зайдите в райдер «Автосохранение», включите «Автосохранение» и выберите формат файла * .sif для получения фильма. Выберите папку на жестком диске. Используйте имя папки как файл.

11. Включите функцию «Автоинкремент» (установите начальное значение на 1). Разрешить присоединение оператора к имени файла. Используйте «ДОН» и «АСС» для донорного и акцепторного каналов соответственно. Выберите «_» в качестве разделителя.

12. В программном обеспечении управления камерой нажмите «Видео», чтобы запустить прямое изображение с камеры и обесцветить фоновую флуоресценцию путем сканирования камеры для образца с использованием максимальной интенсивности лазера всех трех лазеров (вместе ≈ 3000 Вт / см ² для 10 с на поле зрения).

13. Выключите синий лазер. Уменьшите интенсивность зеленого лазера примерно до 200 Вт / см ² и примерно до 40 мВт / см ² для красного лазера, если используется переменное лазерное возбуждение (ALEX).

14. Разбавьте биотинилированный флуоресцентный образец до концентрации 50–100 пМ. Загрузите 100 мкл раствора. При связывании образец иммобилизируется на поверхности камеры. ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за тем, чтобы не перегружать камеру. Соседние молекулы должны быть отделены друг от друга.

15. При необходимости загрузите в камеру дополнительные 100 мкл пробы, в 2 раза более концентрированной.

16. Закройте впускную и выпускную трубки измерительной камеры зажимами после завершения загрузки.

17. Выключите все лазеры и используйте пьезодвигатели для перемещения проточной камеры на два поля зрения дальше.

18. В программном обеспечении управления камерой щелкните «Take signal», чтобы начать запись видео и одновременно включить лазер.Убедитесь, что к концу пленки обесцвечивается более 80% молекул, регулируя мощность лазера.

19. Повторите шаги 3.17 и 3.18 для всей области предварительно обесцвеченной камеры для образца.

4. Получение карты трансформации («beadmap»)

1. Подготовьте проточную камеру, как описано в разделах 1.1, 1.2 и 2.

2. Используйте флуоресцентные мультиспектральные шарики, покрытые авидином, которые показывают флуоресцентное излучение в донорный и акцепторный каналы.Вихревую смесь в течение 1 мин, затем разбавьте 50 мкл смеси в 50 мкл ddH ₂ O. Снова встряхните на вортексе в течение 1 мин, обработайте ультразвуком 1-2 мин, затем встряхните еще 10 сек.

3. Выполните шаги, описанные для измерений smFRET (Раздел 3.5–3.10).

4. Загрузите 100 мкл (1 объем камеры) разбавленных 1: 2 флуоресцентных шариков в проточную камеру. Подождите 10 минут, чтобы флуоресцентные шарики связались с поверхностью.

5. Используйте параметры сбора данных в 3.9, но измените длину видеоролика на 26 (зеленая камера) и 25 (красная камера), а коэффициент усиления электронного умножителя на 10.

6. Установите интенсивность зеленого лазера на значение 20 Вт / см ² .

7. Сделайте один видеоролик в поле зрения примерно с 50-100 бусин.

5. Обработка и анализ данных smFRET

1. Используйте специально написанное программное обеспечение SM FRET для анализа диаграммы направленности (см. Материалы и методы) и полученных фильмов. Запустите программу viewPlot1.m.

2. Щелкните «Анализ» | «Анализ партии», снимите флажок «ALEX», если он не использовался.Для лучшей производительности выберите «высокий» порог нахождения пика. Нажимаем «ОК».

3. Выберите «НЕТ», когда вас спросят, анализировалась ли карта уже. Просмотрите папку, содержащую полученный beadmap, и выберите файл * .sif (дважды щелкнув по нему). В следующем диалоговом окне нажмите «ОК». ПРИМЕЧАНИЕ. Если диаграмма направленности уже была проанализирована в ходе предыдущего измерения, выберите здесь «ДА» и выберите сохраненную карту разброса, перейдя в нужную папку и дважды щелкнув файл карты разметки * .map.Продолжите с шага 5.8.

4. Выберите два одиночных шарика, расположенных в противоположных углах поля зрения. Интенсивность пикселей имеет цветовую кодировку от темно-синего (низкая интенсивность) до темно-красного (высокая интенсивность).

5. Щелкните по центру первой бусинки. Если центр молекулы можно четко определить по цветовой кодировке, выберите «ДА» или нажмите «НЕТ» и выберите другую пару молекул.

6. Поместите перекрестие на пиксель, показывающий максимальную интенсивность, и нажмите «СОХРАНИТЬ».Повторите процесс со вторым каналом.

7. Щелкните по молекуле в противоположном углу и повторите шаги 5.5 и 5.6. ПРИМЕЧАНИЕ. Относительный сдвиг пикселей двух каналов отображается в командном окне, и карта преобразования автоматически сохраняется как файл * .map в папку, содержащую файл beadmap * .sif.

8. Чтобы загрузить фильмы-доноры и акцепторы (* .sif) для «пакетного анализа», перейдите в папку, выберите все фильмы, которые необходимо проанализировать, и нажмите «ОК».В следующем диалоговом окне нажмите «ОК». ПРИМЕЧАНИЕ. Пакетный анализ завершен, когда последняя дорожка, отображаемая в командном окне, начинается с «Завершенный анализ…». Обнаруженные молекулы отображаются в новом окне, в котором также указывается относительный сдвиг донорного и акцепторного каналов, определенный из карты трансформации.

9. Чтобы загрузить пакетные файлы фильмов, щелкните Файл | Загрузить. Снимите отметку с опции «ALEX», если она не использовалась. Установите гладкость на 10 и нажмите «ОК».Выберите папку, содержащую файлы * .ttr, и нажмите «выбрать все» и «ОК» в следующем контекстном меню.

10. Если отображаемая кривая имеет характерные фазы smFRET ( Рисунок 2 ), нажмите кнопку переключения «Не выбрано» и сначала выберите момент времени начала события FRET, перемещая линию с помощью курсора мыши и щелкнув левой кнопкой мыши. Затем выберите момент времени обесцвечивания молекулы-акцептора и, наконец, момент времени обесцвечивания молекулы-донора.

11. В следующем окне эффективность FRET отображается синим цветом. Чтобы выбрать кривую, нажмите кнопку «Да», в противном случае выберите «Нет». Чтобы повторно получить доступ к временной шкале, нажмите кнопку «Назад».

12. Повторяйте процедуру до последней молекулы фильма.

13. После анализа последней молекулы в фильме сохраните выбранные следы, нажав «Файл | Сохранить». Сохраните выбранные трассы в той же папке, что и файлы * .sif.

14. Повторите шаги 5.10-5,13 за все приобретенные фильмы.

15. Выполнить программу comb_fret_results.m . Выберите папку, содержащую файлы * .res и все файлы * .FRETonly_trace. Сохраните молекулярные файлы FRET и FRET как файлы MW.dat и FRW.dat соответственно. ПРИМЕЧАНИЕ. Файлы * .dat сохраняются как файлы ASCII. Файл FRW.dat содержит шесть столбцов и одну строку для каждого кадра FRET. Шестой столбец содержит скорректированную покадровую эффективность FRET. Файл MW.dat содержит 21 столбец и одну строку для каждой выбранной молекулы FRET.Третий столбец содержит молекулярную эффективность FRET.

6. Отображение данных smFRET в гистограммах

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы извлечь среднюю эффективность smFRET всех записанных данных smFRET, покадровые данные или данные по молекулам наносятся на гистограммы и анализируются с использованием гауссовских аппроксимаций для ( множественные) пики. Далее протокол использует коммерческое программное обеспечение для анализа данных (см. Список материалов). Однако вместо этого можно использовать любое другое доступное программное обеспечение.

1. Откройте программное обеспечение для анализа данных (см. Список материалов). Щелкните File | Import | multiple ASCII. Выберите папку, содержащую файл FRW.dat. Выберите файл и нажмите «ОК». Подтвердите вариант ввода нажатием «ОК» без изменений.

2. Выберите третий столбец C (Y), содержащий исправленные значения эффективности FRET, щелкните столбец правой кнопкой мыши и выберите «График | Статистика | Гистограмма». В окне гистограммы дважды щелкните столбцы и снимите флажок «автоматическое разбиение» и выберите желаемый размер интервала e.грамм. , 0,05. Также выберите начальное и конечное значения, , например, -0,025 и 1,025.

3. Выберите столбцы гистограммы, щелкнув по ним левой кнопкой мыши. Затем щелкните правой кнопкой мыши и выберите «Перейти к рабочему листу корзины». Выберите столбец «Количество», щелкнув его левой кнопкой мыши, а затем щелкните правой кнопкой мыши и выберите «График | Столбец / столбец / круговая диаграмма | Столбец».

4. На столбчатой ​​диаграмме перейдите в диалоговое окно Анализ | Подгонка | Подгонка нелинейной кривой | Открыть. Выберите «Гауссиан» в разделе «Функция», затем перейдите к набору «Параметры».Отмените выбор автоматической инициализации параметров. Зафиксируйте значение смещения (y0) на 0. Нажмите «Подогнать». ПРИМЕЧАНИЕ. Функция подгонки, а также детали подгонки теперь отображаются на столбчатой ​​диаграмме. Значение «xc» дает центр функции соответствия, , то есть — средний КПД FRET, который служит входным параметром для программного обеспечения NPS.

7. Измерение квантового выхода

1. Выполните определение квантового выхода относительным методом, аналогичным процедуре, описанной Würth et al. 35, используя в качестве стандарта родамин 101, растворенный в этаноле (QY = 91,5%).

2. Запишите спектры поглощения на спектрометре UV-VIS, используя объем 80 мкл в кювете для поглощения с длиной пути 1 см. Поглощение на длине волны, которая будет использоваться для возбуждения флуоресценции, должно быть ≤ 0,05.

3. Запишите спектры излучения на спектрометре с ламповой калибровкой, работающем в режиме счета фотонов. Выполните измерения с поляризаторами Глана-Томпсона в возбуждении (0 °) и эмиссии (54.7 °) (условия магического угла) с использованием спектральной ширины полосы около 5 нм и 2,5 нм для монохроматора возбуждения и излучения соответственно. Измерьте образцы после их переноса во флюоресцентную кювету с длиной пути 3 мм, следя за тем, чтобы скорость счета не превышала 10 ⁶ с ^-1 .

   1. Рассчитайте квантовый выход согласно

, где n и n _Std — показатели преломления растворителя образца и стандарта, соответственно.f (λ) и f_Std (λ) — интенсивности флуоресценции образца и стандарта на длине волны λ. A (λ _от ) и A ^std (λ _от ) — это оптическая плотность образца и эталона на длине волны возбуждения, а Φ _std — квантовый выход стандарта.

8. Расчет изотропного радиуса Ферстера

1. Рассчитайте изотропный радиус Ферстера (

   ) из ​​спектра излучения молекулы донора, спектра поглощения молекулы акцептора, квантового выхода донора и показателя преломления среды.Используйте бесплатную программу PhotochemCAD для расчета

   . Однако вместо этого можно использовать любое другое доступное программное обеспечение36.

9. Измерение анизотропии

1. Определите стационарную анизотропию флуоресценции по записям спектров флуоресценции с различными настройками поляризатора возбуждения / излучения (V / V, V / H, H / V, H / H) 36 .

2. Рассчитайте G-фактор, который корректирует артефакты поляризации прибора, для каждой длины волны из отношения

и используйте его для вычисления значения анизотропии для каждой длины волны:

, где I _xy указывает интенсивность для поляризации возбуждения x и поляризации излучения y .

1. Усредните значения по спектральному диапазону излучения для расчета анизотропии стационарной флуоресценции.

10. Установка программного обеспечения Fast-NPS

1. Загрузите UCSF Chimera с http://www.cgl.ucsf.edu/chimera и следуйте инструкциям по установке.

2. Перейдите на сайт «Института биофизики» при Ульмском университете: https://www.uni-ulm.de/en/nawi/institute-of-biophysics/software.html. Загрузите текущую версию Fast-NPS и распакуйте ее в любую папку.Откройте подпапку «Распространяемый компонент» и установите распространяемый пакет Visual C ++, который подходит для системы.

11. Центрирование файла pdb

1. Откройте интересующие файлы pdb в Chimera. Выберите все атомы макромолекулярного комплекса и вычислите координаты центроида (Инструменты | Анализ структуры | Оси / Плоскости / Центроиды | Определить центроид… | Хорошо).

2. Откройте журнал ответов (Избранное | Журнал ответов) и инструмент преобразования (Инструменты | Движение | Трансформировать координаты).Введите координаты центроида, показанного в журнале ответов, в текстовое поле «Сдвиг» окна преобразования координат и измените знак каждой координаты. Нажмите «Применить» и сохраните файл с помощью «Сохранить PDB» (Файл | Сохранить PDB).

12. Настройка приоритетных позиций

ПРИМЕЧАНИЕ. Все значения указаны в ангстремах.

1. Запустите язык технических вычислений и измените текущую папку на локальную папку Fast-NPS. Введите в командном окне: FastNPS.

2. Создайте новый файл вакансии в Менеджере проектов (Проект | Новый).

3. Установите предыдущую позицию (Инструменты | Модель красителя до).

4. В панели «Предыдущие основы» определите пространственное разрешение предыдущей позиции, введя ее значение (рекомендуется 2).

5. Исключите внутреннюю часть макромолекулы, установив флажок и нажав кнопку «загрузить PDB». Выберите и загрузите центрированный файл PDB, как описано в Разделе 11.

6. Укажите приблизительный диаметр (рекомендуется 13 Å, см. Обсуждение) красителя, указав его значение.

7. Введите расстояние скелетонизации, , т. Е. расстояние, на которое молекула красителя может проникнуть в макромолекулу (рекомендуется 2 Å).

8. В панели «Максимальный предыдущий размер» введите минимальные и максимальные координаты предыдущей позиции (рекомендуется: x в [-150,150], y в [-150,150] и z в [-150,150]).

9. При определении сателлита активируйте флажок «присоединение через гибкий линкер» на панели «предыдущие основы» и введите в панель «линкер» координаты атома (в центрированном файле pdb), в котором находится молекула красителя. прилагается.Далее укажите длину и диаметр линкера, введя их значения (рекомендуются 13 Å и 4,5 Å, см. Обсуждение). В случае антенны пропустите этот пункт.

10. Нажать кнопку «рассчитать доступный объем».

11. Сохраните предыдущее положение и при желании экспортируйте его для целей визуализации с помощью такого программного обеспечения, как Chimera.

13. Определение сетевой геометрии

1. Откройте окно определения измерений (Режим | Редактировать геометрию).

2. Создайте новую молекулу красителя, нажав кнопку «Новый» в панели «Красители».

3. Задайте анизотропию флуоресценции (Раздел 9), введя значение и выбрав модель красителя в раскрывающемся меню «Модель красителя».

4. Нажмите кнопку «Загрузить», выберите соответствующую позицию и установите флажок активировать краситель. Повторите эту процедуру для всех красок, , то есть для всех антенн, а также для всех спутников.

5. После создания всех красителей определите размеры.Создайте новое измерение, нажав «Создать» на панели «Измерения».

6. Выберите партнеров FRET в раскрывающихся меню «Dye1» и «Dye2» ниже.

7. Введите эффективность smFRET с ошибкой и изотропный радиус Ферстера этой пары красителей.

8. Наконец, отметьте флажок активации измерения. Повторите эту процедуру для всех измерений. ПРИМЕЧАНИЕ. Часто сеть становится все более сложной, так что пользователь может запутаться.Во избежание ошибок проверьте сеть визуально, нажав кнопку «Проверить сеть». На рисунке показаны активированные красители и измерения с помощью линий, соединяющих красители FRET.

14. Расчет

1. Откройте окно расчета (режим | Расчет).

2. Если каждому красителю в сети назначена определенная модель, выберите «Определено пользователем» и запустите расчет, нажав «Расчет». Чтобы использовать все красители в одной модели, выберите одну из пяти моделей (классическая, iso, meanpos-iso, var-meanpos-iso и var-meanpos) и продолжайте.ПРИМЕЧАНИЕ. В командном окне будет отображаться ход расчета. Fast-NPS сделает это во всплывающем сообщении, когда расчет будет завершен.

15. Визуализация результатов

1. Чтобы экспортировать достоверные объемы красителей, откройте окно просмотра результатов (Модель | Просмотр результатов).

2. Экспортные плотности красителей:

   1. Экспортные красители по отдельности или все одновременно. Чтобы экспортировать отдельный краситель, выберите его в панели «Отображаемые красители» и нажмите «Экспорт плотности».Введите разрешение (рекомендуется 2) и выберите тип файла для экспорта. Справа отображается плотность и некоторые ее математические характеристики.

   2. Чтобы экспортировать все красители одновременно, нажмите «Пакетный экспорт».

3. Откройте полученные файлы плотности в Chimera.

16. Проверка согласованности выбранной комбинации моделей

1. Откройте окно просмотра результатов (Модель | Просмотр результатов).Если на панели «Информация о расчетах» в текстовом поле «Согласованность» отображается значение ниже 90%, текущая модель не отражает в достаточной степени измеренную эффективность smFRET и, таким образом, является несовместимой.

2. В случае несоответствия нажмите кнопку «Детальная согласованность». Найдите измерения со значением ниже 90%. Если в этих измерениях преимущественно задействованы один или несколько красителей, их модели могут вызвать несоответствие. Рассмотрите различные модели красителей для этих красителей и повторно запустите расчет Fast-NPS.

Типичные результаты

Транскрипция — это первый шаг в экспрессии генов у всех организмов. У архей транскрипция осуществляется одной РНК-полимеразой (РНКП). По сравнению с эукариотами, RNAP архей имеет поразительное структурное сходство со своими эукариотическими аналогами, но при этом имеет более простой механизм транскрипции. Таким образом, археи можно использовать в качестве модельной системы для изучения инициации транскрипции эукариот с помощью РНК-полимеразы II (Pol II). Недавно полная архитектура открытого комплекса РНК-полимеразы архей была определена из одномолекулярных FRET и NPS.Данные анализа NPS были использованы для построения модели полного открытого промоторного комплекса архей, которая дает полезные сведения о механизме инициации транскрипции.

Чтобы выяснить эту структуру, была измерена эффективность smFRET между неизвестными молекулами антенного красителя, расположенными внутри открытого промоторного комплекса, и несколькими известными молекулами красителя-сателлита, которые были включены в пять ссылочных сайтов в RNAP, положения которых известны из кристаллографических структур (pdb-ID : 2WAQ) 37.Антенные красители были прикреплены к любому из различных положений нематричной ДНК, TFB, TBP или TFE. Полная сеть, использованная в этом исследовании, состояла из более чем 60 измеренных расстояний.

Рисунок 7 изображает модель полного комплекса открытого промотора архей, построенного на основе анализа NPS. Он состоит из двухцепочечной промоторной ДНК (светлый и темно-синий), РНК-полимеразы (серый) и факторов инициации транскрипции TBP (фиолетовый), TFB (зеленый) и TFE (желтый).Модель накладывается на результаты анализа NPS, достоверные объемы, которые были рассчитаны с использованием классической модели (A), модели iso (B), модели meanpos-iso (C), модели var-meanpos-iso. (D) и модель var-meanpos (E).

Рисунок 1: Рабочий процесс сбора и обработки параметров, необходимых для расчета Fast-NPS. Щелкните здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Примерная временная диаграмма интенсивности флуоресценции для события smFRET. Интенсивности флуоресценции донора (зеленый) и молекулы акцептора (красный), показывающие три характерные фазы, а именно: I: smFRET, II: флуоресценция донора после фотообесцвечивания акцептора, III: фоновая флуоресценция после фотообесцвечивания донора. Щелкните здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Схематическое изображение проточной камеры для экспериментов smFRET. Проточная камера устанавливается на индивидуальный металлический держатель с держателями из акрилового стекла.Сэндвич-конструкция проточной камеры состоит из предметного стекла из кварцевого стекла (плавленого кварца) с двумя отверстиями для крепления впускной и выпускной трубок, герметизирующей пленки и покровного стекла, закрывающего проточную камеру. Призма для освещения TIRF устанавливается на нижнюю половину проточной камеры. Полые винты с язычком обеспечивают вход и выход для проточной камеры. Щелкните здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Подготовка предметного стекла из кварцевого стекла и герметизирующей пленки. Механический чертеж предметного стекла из кварцевого стекла с указанием положения отверстий (в миллиметрах). Щелкните здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Механический чертеж проточной камеры. Размеры алюминиевого держателя призмы, держателя акрилового стекла и алюминиевой монтажной рамы указаны в миллиметрах. Щелкните здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рис. 6: Схематическое изображение призменной установки TIRF, используемой для экспериментов smFRET. Сокращения для обозначения оптических компонентов: A — диафрагма; DM — дихроичное зеркало; F, эмиссионный фильтр; L, линза; М, зеркало; О, объективный; П — призма; PSD, позиционно-чувствительный фотодиод; S, образец; PS, этап позиционирования; Т, телескоп. Щелкните здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 7: Результаты моделирования различных допущений модели. Все изображения показывают полимеразу РНК архей (pdb-ID: 2WAQ, вид сверху) вместе с моделью промоторной ДНК (тДНК и нтДНК синим и голубым соответственно), TBP (фиолетовый), TFB (зеленый) и TFE (желтый). ) в археологическом открытом комплексе 30.Надежные объемы накладываются на результаты моделирования NPS ( A ) классической модели, ( B ) iso-модели, ( C ) meanpos-iso модели, ( D ) var-meanpos- iso и ( E ) модель var-meanpos. Все объемы показаны с достоверностью 68%. Классическая сеть и сеть var-meanpos согласуются с данными smFRET. Напротив, сети, в которых для всех красителей выбрана модель iso, meanpos-iso или var-meanpos-iso, не соответствуют измеренным данным.Щелкните здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

Мы представляем установку и экспериментальную процедуру для точного определения эффективности FRET между красителями, прикрепленными через гибкие линкеры к биомакромолекулам, , то есть , нуклеиновым кислотам и / или белкам.

Для обеспечения точных измерений smFRET (Раздел 3) очень важно исключить воздух из проточной камеры в любой момент во время измерения. Кроме того, следите за тем, чтобы не перегружать проточную камеру флуорофорами.Флуорофоры должны быть четко разделены для обеспечения правильного анализа. Поскольку пары smFRET, которые не показывают обесцвечивание донора, должны быть исключены из анализа, убедитесь, что> 80% молекул в поле зрения обесцвечиваются в конце фильма. Чтобы учесть неоднородности в образце, β-фактор и γ-фактор, корректирующие перекрестные помехи и относительную эффективность обнаружения донорного и акцепторного каналов, соответственно, рассчитываются для каждой пары FRET отдельно.

Настройки камеры (время интегрирования, коэффициент усиления электронного умножителя, коэффициент усиления предварительного усилителя и скорость считывания, описанные в разделе 3.9) должны быть установлены на значения, обеспечивающие наилучший компромисс между отношением сигнал / шум, динамическим диапазоном и временным разрешением. Их необходимо перенастроить для разных экспериментов или при использовании другого оборудования. Количество кадров должно быть достаточно большим, чтобы обеспечить обесцвечивание большинства донорных молекул в течение времени наблюдения.

Для измерений на флуоресцентном спектрометре (разделы с 7 по 9) должен быть найден хороший компромисс между интенсивностью сигнала и спектральным разрешением записанных данных.С этой целью щели на пути возбуждения и излучения флуоресцентного спектрометра должны быть адаптированы в зависимости от используемого инструмента и концентрации образца.

Кроме того, мы представляем метод анализа Fast-NPS для получения структурной информации о переходных или динамических макромолекулярных комплексах. NPS был применен для выявления пути нематричной цепи ДНК и положения факторов инициации транскрипции в открытом комплексе РНК-полимеразы архей. Используя сеть из более чем 60 различных измерений расстояний, мы показали, что Fast-NPS, оснащенный недавно реализованным механизмом отбора проб (Eilert, T., Beckers, M., Drechsler, F., & Michaelis, J. в стадии подготовки), сокращает время, необходимое для анализа этой сложной сети smFRET, примерно на 2 порядка по сравнению с исходным глобальным методом NPS27. Надежность алгоритма основана на сэмплере «Метрополис внутри Гиббса» в сочетании с параллельной схемой темперирования. Fast-NPS показывает точную воспроизводимость сетевых результатов и согласуется с результатами, опубликованными ранее30.

Было опубликовано несколько различных методов, нацеленных на вывод структурной информации из измерений smFRET11,12,13,14,15,16,17,18.Все эти подходы обеспечивают только одну конкретную модель красителя. Таким образом, красители, которые не соответствуют предположениям, сделанным соответствующей моделью, не могут быть использованы или приводят к ложной структурной информации. Fast-NPS, напротив, позволяет подбирать для каждой молекулы красителя отдельную модель. Это помогает учесть различное конформационное поведение как самой молекулы красителя, так и линкера, используемого для ее прикрепления. Локальное молекулярное окружение молекулы красителя, а также ее физические свойства будут определять, какая модель является наиболее подходящей.

Для анализируемой сети smFRET комплекса инициации архей изотропное предположение для всех молекул красителя приводит к резкому уменьшению размера вероятных объемов по сравнению с классической моделью. В сочетании с динамическим усреднением положения для всех молекул красителя медиана всех вероятных размеров объема (при 95%) уменьшается до менее 0,5 нм ³ . Однако эти задние молекулы красителя больше не согласуются с их измерениями smFRET, указывая на то, что сделанные предположения приводят к ложной структурной информации.Напротив, апостериорные уровни, определенные в классической модели, согласуются с определенной эффективностью smFRET.

Поскольку предположение об изотропном и / или динамическом усреднении положения для всех красителей приводит к несоответствиям, Fast-NPS позволяет использовать априорные молекулы красителя, в которых каждому красителю может быть назначена одна из пяти моделей. В каждой модели используется один и тот же доступный объем. Алгоритм расчета АВ красителя делает несколько предположений. Сначала пространственная форма флуорофора аппроксимируется сферой.Таким образом, следует использовать диаметр, учитывающий ширину, высоту и толщину флуорофора (раздел 12). Далее форма линкера аппроксимируется гибким стержнем. Значения, представленные в разделе 12, были вычислены для красителя Alexa 647, присоединенного через линкер 12-C. На сегодняшний день невозможно точно определить априори, какая модель наиболее подходит, учитывая геометрию эксперимента, и поэтому все модели должны быть протестированы. Как правило, выбирают модель, которая дает наименьший возможный апостериорный размер, но при этом согласуется с данными.Чтобы проверить, согласуется ли выбор моделей с данными smFRET, мы вычисляем как апостериорную, так и вероятность. Согласованность означает, что более 90% образцов, собранных в апостериорной области, находятся в пределах 95% доверительного интервала правдоподобия.

Хотя верно, что чем ниже анизотропия, тем меньше неопределенность расстояния, в сети smFRET также необходимо учитывать геометрическое расположение молекул красителя. Таким образом, хотя представление молекул красителя с низкой анизотропией флуоресценции с помощью изомодели является типичным первым выбором, тест на консистенцию предоставляет более прямые средства для выбора правильной модели красителя.Оптимальный выбор моделей красителей может привести к резкому увеличению точности локализации и в то же время сохранить согласованность сети с ее данными FRET.

Таким образом, Fast-NPS позволяет получать структурную и динамическую информацию о крупных макромолекулярных комплексах. В отличие от обычных структурных методов, таких как рентгеновская кристаллография или криоэлектронная микроскопия, это позволяет отслеживать очень гибкие или переходные комплексы, что значительно расширяет наше понимание механизмов сложных биологических процессов.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы благодарят Б. Грюхманна за механические чертежи проточной камеры. Кроме того, мы хотим выразить нашу благодарность Максу Бекерсу и Флориану Дрекслеру за содержательные комментарии и обсуждения, касающиеся NPS и базового механизма выборки.

Ссылки

• Cheng Y. Крио-ЭМ одиночных частиц с кристаллографическим разрешением. Клетка. 2015; 161: 450–457.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Гарман Э. Ф. Разработки в области рентгеноструктурного определения структуры биологических макромолекул. Наука. 2014. 343 (6175): 1102–1108. [PubMed] [Google Scholar]
• Сали А. Итоги первого семинара рабочей группы по гибридным / интеграционным методам wwPDB. Состав. 2015; 23: 1156–1167. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Хопфнер К.П., Михаэлис Дж. Механизмы транслоказ нуклеиновых кислот: уроки структурной биологии и биофизики одиночных молекул.Curr Opin Struct Biol. 2007; 17: 87–95. [PubMed] [Google Scholar]
• Андо Т., Учихаши Т., Кодера Н. Высокоскоростной АСМ и приложения к биомолекулярным системам. Анну Рев Биофиз. 2013; 42: 393–414. [PubMed] [Google Scholar]
• Нойман К.К.С., Надь А. Силовая спектроскопия одиночных молекул: оптический пинцет, магнитный пинцет и атомно-силовая микроскопия. Нат методы. 2008; 5: 491–505. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Йилдиз А. Миозин V ходит из рук в руки: визуализация одного флуорофора с помощью 1.5-нм локализация. Наука. 2003. 300 (5628): 2061–2065. [PubMed] [Google Scholar]
• Джу К., Бальчи Х., Ишицука Й., Бураначай С., Ха Т. Достижения в методах флуоресценции одиночных молекул для молекулярной биологии. Анну Рев Биохим. 2008. 77 (1): 51–76. [PubMed] [Google Scholar]
• Hohlbein J, Craggs TD, Cordes T. Возбуждение переменного лазера: FRET одной молекулы и не только. Chem Soc Rev.2014; 43 (4): 1156–1171. [PubMed] [Google Scholar]
• Страйер Л., Хаугланд Р.П. Передача энергии: спектроскопическая линейка.Proc Natl Acad Sci U S. A. 1967; 58 (2): 719–726. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Rasnik I, Myong S, Cheng W., Lohman TM, Ha T. Ориентация связывания ДНК и конформация домена мономера Helicase Rep E. coli, связанного с частичным дуплексным соединением : Одномолекулярные исследования флуоресцентно меченых ферментов. J Mol Biol. 2004. 336 (2): 395–408. [PubMed] [Google Scholar]
• Андрека Дж. Одномолекулярное отслеживание мРНК, выходящей из РНК-полимеразы II. Proc Natl Acad Sci U S A.2008. 105 (1): 135–140. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Шредер Г.Ф., Грубмюллер Х. FRETsg: Построение модели биомолекулярной структуры на основе нескольких экспериментов FRET. Comput Phys Commun. 2004. 158 (3): 150–157. [Google Scholar]
• Маргиттай М. Одномолекулярный резонансный перенос энергии флуоресценции обнаруживает динамическое равновесие между закрытой и открытой конформациями синтаксина 1. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2003; 100 (26): 15516–15521. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Калинин С.Набор инструментов и эталонное исследование для высокоточного структурного моделирования с ограничениями FRET. Нат методы. 2012. 9 (12): 1218–1227. [PubMed] [Google Scholar]
• Choi J. N6-метиладенозин в мРНК нарушает отбор тРНК и динамику удлинения трансляции. Nat Struct Mol Biol. 2015; 23 (август 2015): 110–115. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Свенссон Б. Трилатерация зондов, связанных с функциональными рианодиновыми рецепторами, на основе FRET. Biophys J. 2014; 107 (9): 2037–2048. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Стивенсон Дж. Д., Кеньон Дж. К., Симмонс М. Ф., Lever AML.Характеристика трехмерной структуры РНК с помощью одиночной молекулы FRET. Методы. 2016. С. 1–11.
• Ли Н.К. Точные измерения FRET в одиночных диффундирующих биомолекулах с использованием переменного лазерного возбуждения. Биофиз Дж. 2005; 88 (4): 2939–2953. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• McCann JJ, Choi UB, Zheng L, Weninger K, Bowen ME. Оптимизация методов восстановления абсолютной эффективности FRET от иммобилизованных одиночных молекул. Биофиз Дж. 2010; 99 (3): 961–970. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Brunger AT, Strop P, Vrljic M, Chu S, Weninger KR.Трехмерное молекулярное моделирование с помощью FRET одной молекулы. J Struct Biol. 2011; 173: 497–505. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Шулер Б. Одномолекулярный FRET структуры и динамики белка — праймер. J нанобоитехнология. 2013; 11 (Приложение 1): 1–17. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Choi UB. Одномолекулярная модель слитого комплекса синаптотагмин 1-SNARE, полученная из FRET. Nat Struct Mol Biol. 2010. 17 (3): 318–324. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Dale RE, Eisinger J, Blumberg WE.Ориентационная свобода молекулярных зондов. Фактор ориентации при внутримолекулярном переносе энергии. Биофиз Дж. 1979; 26 (2): 161–193. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Kapanidis AN. Переменное лазерное возбуждение одиночных молекул. Acc Chem Res. 2005. 38 (7): 523–533. [PubMed] [Google Scholar]
• Muschielok A. Система нанопозиционирования для анализа структуры макромолекул. Нат методы. 2008. 5 (11): 965–971. [PubMed] [Google Scholar]
• Muschielok A, Michaelis J.Применение системы нано-позиционирования для анализа сетей флуоресцентного резонансного переноса энергии. J. Phys Chem B. 2011; 115 (41): 11927–11937. [PubMed] [Google Scholar]
• Andrecka J. Система нано-позиционирования выявляет ход восходящей и неэлементной ДНК внутри комплекса элонгации РНК-полимеразы II. Nucleic Acids Res. 2009. 37 (17): 5803–5809. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Трейтлейн Б. Динамическая архитектура комплекса открытого промотора с минимальной РНК-полимеразой II.Mol Cell. 2012. 46 (2): 136–146. [PubMed] [Google Scholar]
• Надь Дж. Полная архитектура открытого комплекса РНК-полимеразы архей из одной молекулы. FRET и NPS. Nat Commun. 2015; 6: 6161. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Grohmann D, et al. Фактор инициации TFE и фактор элонгации Spt4 / 5 конкурируют за зажим RNAP во время инициации и удлинения транскрипции. Mol Cell. 2011. 43 (2): 263–274. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Beckers M, Drechsler F, Eilert T., Nagy J, Michaelis J.Количественная структурная информация из FRET одной молекулы. Фарадей Обсуди. 2015; 184: 117–129. [PubMed] [Google Scholar]
• Беннинк М.Л. Разворачивание отдельных нуклеосом путем растягивания отдельных волокон хроматина с помощью оптического пинцета. Nat Struct Biol. 2001. 8 (7): 606–610. [PubMed] [Google Scholar]
• Chandradoss SD. Пассивация поверхности для исследования одномолекулярных белков. J Vis Exp. 2014. с. e50549. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
• Würth C, Grabolle M, Pauli J, Spieles M, Resch-Genger U.Относительное и абсолютное определение квантовых выходов флуоресценции прозрачных образцов. Nat Protoc. 2013. 8 (8): 1535–1550. [PubMed] [Google Scholar]
• Lakowicz JR. Принципы флуоресцентной спектроскопии. Бостон, Массачусетс: Springer США; 2006. [Google Scholar]
• Корхин Ю. Эволюция сложных РНК-полимераз: Полная структура РНК-полимеразы архей. PLoS Biol. 2009; 7 (5) [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

Платформа гибридных биосенсоров BRET-FRET для оптогенетики, химического скрининга и визуализации in vivo

Конструирование плазмиды

Комплементарная ДНК (кДНК) кодирующая mTurquoise и кДНК, кодирующая mTurquoise-GL, были получены от Joachim Goedhart ⁴³ .кДНК для Turquoise2-GL, mTurquoise2 и Turquoise2 были получены сайт-специфическим мутагенезом с помощью ПЦР. Были введены следующие мутации: I146F (для Turquoise2-GL и mTurquoise2) ⁴³ и K206A (для Turquoise2-GL). Прототип биосенсора FRET активности ERK, EKAREVnes, состоит из ECFP и YPet для донорных и акцепторных флуоресцентных белков соответственно ¹⁹ . В дальнейшем белки, происходящие из бирюзы, и ECFP вместе называются CFP. Точно так же белки, производные YFP, включая YPet и Venus, вместе называются YFP.Чтобы сконструировать биосенсор hyBRET для активности ERK, hyBRET-ERK, кДНК ECFP в EKAREVnes была заменена на PCR-амплифицированную кДНК, кодирующую слитый белок, состоящий из Turquoise2-GL dC10, Gly-Thr и RLuc8 S257G dN3, с использованием рестрикционного расщепления с последующим перевариванием. путем сборки ДНК с помощью набора для клонирования In-Fusion HD (Takara Bio, Otsu, Japan). Аналогичным образом, CFP в PicchuEV-x ^19,44,45 и RaichuEV-Ras ^19,46 были заменены тандемно связанными Turquoise2-GL dC10 и RLuc8 S257G dN3 для создания hyBRET-PicchuX и hyBRET-HRas, соответственно.В качестве контроля мы разработали EKAREV-4464, заменив ECFP Turquoise2-GL dC10 из EKAREVnes. Варианты CFP hyBRET-ERK были получены путем замены Turquoise2-GL dC10 в hyBRET-ERK на mTurquoise2 dC10, Turquoise2 dC10 или ECFP dC10 посредством реакции In-Fusion. HyBRET-ERK с парой mVenus-mTurquoise2 был создан путем замены mVenus dC10 на YPet путем лигирования рестрикционных фрагментов. Варианты hyBRET-ERK NanoLuc также были получены реакцией In-Fusion. Ранее сообщалось о CeNL, гибридном белке Turquoise2 и NanoLuc ²² .Для разработки биосенсоров hyBRET для других киназ Ser / Thr сенсорный домен и соответствующий лигандный домен в hyBRET-ERK были заменены на таковые из AKAR3EV, JNKAR1EV и Eevee-S6K путем лигирования рестрикционных фрагментов, генерируя hyBRET-PKA, JNK и S6K, соответственно. . кДНК, кодирующие биосенсоры или флуоресцентные белки, субклонировали в вектор pCAGGS ⁴⁷ или вектор pPBbsr, транспозонный вектор PiggyBac с IRES-bsr (ген устойчивости к бластицидину) ⁴⁸ . Лентивирусный вектор для hyBRET-ERK был сконструирован путем вставки компонентов, кодирующих кДНК hyBRET-ERK, за исключением YPet, в вектор pCSII-EF с IRES-bsr (ген устойчивости к бластицидину) и кодон-оптимизированным YPet для E . coli для подавления рекомбинации между гуманизированным YFP и CFP ⁴⁹ . Затем остаток треонина субстрата ERK в pCSIIbsr-hyBRET-ERK заменяли на аланин для создания устойчивого к фосфорилированию мутанта hyBRET-ERK-TA путем рестрикционного переваривания и последующего лигирования отожженного дуплекса олиго-ДНК. Чтобы сконструировать векторы для стабильной экспрессии биолюминесцентных белков в клетках млекопитающих, кДНК для RLuc8 S257G dN3 была вставлена ​​в вектор CSII-EF с IRES-puro, а кДНК для голубого нано-фонаря и желтого нано-фонаря были амплифицированы с помощью ПЦР и субклонированы в Вектор pPBbsr путем лигирования рестрикционных фрагментов.pCX4puro-CRY2-cRaf и pCX4neo-CIBN-EGFPx были описаны ранее ⁵⁰ . Для создания pCX4puro-mCherry-CRY2-cRaf кДНК, кодирующая mCherry, была амплифицирована с помощью ПЦР и слита с CRY2 в pCX4puro-CRY2-cRaf с помощью реакции In-Fusion. Затем cRaf в pCX4puro-mCherry-CRY2-cRaf был заменен линкером и каталитическим доменом мышиного Sos1 (aa 548–1020) или интер-Sh3 доменом p85 человека (aa 428–621), образуя pCX4puro-mCherry-CRY2- Soscat и pCX4puro-mCherry-CRY2-iSh3 соответственно. pT2ADW-hyBRET-ERK был сконструирован следующим образом: инсулятор D4Z4 был вставлен перед промотором CAG pT2AL200R175-CAGGS-EGFP, несущего сайты рекомбинации Tol2 ⁵¹ .Затем последовательность WPRE pCSII-EF была вставлена ​​перед последовательностью поли А. Наконец, EGFP был заменен кДНК hyBRET-ERK.

Культура клеток и создание стабильных клеточных линий

Клетки HeLa были приобретены в Human Science Research Resources Bank (Sennanshi, Japan). Клетки HCT116 и клетки 4T1 были получены из АТСС (Американская коллекция типовых культур). Клетки Lenti-X 293T были приобретены у Clontech (Маунтин-Вью, Калифорния). Клетки РС9 были любезным подарком от Масато Окада (Университет Осаки, Япония).Клетки HeLa и Lenti-X 293T поддерживали в среде DMEM (Wako Pure Chemical Industries, Осака, Япония). Клетки HCT116 выращивали в среде McCoy 5A (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA). Клетки 4T1 и клетки PC9 культивировали в RPMI1640 (ThermoFisher Scientific). Описанная выше среда для выращивания была дополнена 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сывороткой (FBS) (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) и пенициллин / стрептомицин (Nacalai Tesque, Киото, Япония). Все клетки инкубировали во влажной атмосфере с 5% CO2 на воздухе при 37 ° C.Для создания стабильных клеточных линий, экспрессирующих биосенсоры hyBRET с помощью системы транспозонов, клетки котрансфицировали вектором pPB и pCMV-mPBase ⁴⁸ , полученным из Wellcome Trust Sanger Institute. Через день после трансфекции трансфицированные клетки отбирали с помощью 20 мкг / мл бластицидина S (InVivoGen, Сан-Диего, Калифорния), а затем дополнительно культивировали в течение по меньшей мере 1 недели. Для получения лентивируса клетки HEK-293T котрансфицировали вектором pCSII-EF, psPAX2, который был получен от Addgene (плазмида # 12260) и pCMV-VSV-G-RSV-Rev, любезным подарком доктора.Миёси (RIKEN BioResource Center, Ибараки, Япония) липофекцией с использованием полиэтиленимина «Макс» с молекулярной массой 40 000 (Polyscience Inc., Warrington, PA). Среды, содержащие вирус, собирали через 48 часов после трансфекции, фильтровали и концентрировали с помощью PEG6000. Клетки-мишени инфицировали в присутствии 10 мкг / мл полибрена (Nacalai Tesque). Через два дня после заражения инфицированные клетки отбирали с помощью бластицидина S с концентрацией 20 мкг / мл. Основная масса клеток использовалась в последующих анализах.

Реагенты

Диацетилцелентеразин-h синтезировали, как описано ранее ¹⁴ .Целентеразин-h и PD-0325901 были получены от Wako (Осака, Япония). Гефитиниб и AZD6244 были приобретены в компании Symansis (Шанхай, Китай). Анизомицин, dbcAMP и фактор роста эпидермиса были приобретены у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури). Реагент для трансфекции 293fectin был получен от ThermoFisher Scientific и использован для липофекции плазмиды в клетки HeLa. Система анализа люциферазы Nano-Glo была приобретена у Promega (Мэдисон, Висконсин), и субстрат для анализа, включенный в набор, использовали в качестве исходного раствора фуримазина.Люциферины, используемые в каждом люминесцентном анализе, перечислены в таблице S3.

Спектроскопия

Для измерения спектров флуоресценции клетки HeLa, экспрессирующие только CFP, только YFP, или биосенсор помещали на 35-миллиметровую стеклянную чашку. Клетки наблюдали с помощью инвертированного микроскопа (IX81; Olympus, Tokyo), снабженного линзой объектива (масляный объектив UPLAPO 100 × / 1,35NA; Olympus). CFP возбуждались фильтром возбуждения FF02-438 / 24 (Semrock) и дихроичным зеркалом FF458-Di02-25×36 (Semrock).YFP возбуждали возбуждающим фильтром S492 / 18X (Chroma) и стеклянным дихроичным зеркалом (Olympus). Спектры флуоресценции регистрировали с интервалом 2 нм с использованием фотонного многоканального анализатора PMA-12 (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japan). Для измерения люминесцентных спектров клетки HeLa, экспрессирующие биосенсор, обрабатывали трипсином и суспендировали в M199 (ThermoFisher Scientific), содержащем 3% FBS и 20 мМ HEPES. К суспензии клеток добавляли 20 мкМ целентеразин-h или 3 мкМ фуримазин для регистрации спектров люминесценции с помощью PMA-12.Полученные спектры флуоресценции и люминесценции были использованы для оценки эффективности передачи энергии биосенсорами.

Оценка эффективности передачи энергии

Для оценки эффективности передачи энергии спектры флуоресценции и биолюминесценции биосенсора hyBRET были подогнаны под теоретические спектры излучения, по существу, как сообщалось ранее ²⁰ . Для нелинейной регрессии использовались метод Лербенберга-Марквардта, реализованный в функции nlinfit в MATLAB (MathWorks, Натик, Массачусетс) и функции решателя в Microsoft Excel (Microsoft Corporation, Редмонд, Вашингтон).Теоретические спектры флуоресценции описываются следующим уравнением:

$$ {\ rm {F}} (\ lambda) = {\ varepsilon} _ {c} ({\ lambda} _ {ex}) \ {(1- {E} _ {CY}) \ times {\ varphi} _ {C} \ times {f} _ {C} (\ lambda) + {E} _ {CY} \ times {\ varphi} _ {Y} \ раз {f} _ {Y} (\ lambda) \} + {\ varepsilon} _ {Y} ({\ lambda} _ {ex}) \ times {\ varphi} _ {Y} \ times {f} _ { Y} (\ lambda), $$

(1)

где F ( λ ) — флуоресценция на длине волны λ, ε _c ( λ _из ) — коэффициент возбуждения CFP на длине волны возбуждения, E _CY — КПД FRET между CFP и YFP, ϕ _C — квантовая эффективность CFP, f _C ( λ ) — нормированное излучение CFP на длине волны λ, ϕ _Y — квантовая эффективность YFP, f _Y ( λ ) — нормализованное излучение YFP, а ε _Y ( λ _из ) — коэффициент экстинкции YFP на длине волны возбуждения. ε _Y ( λ _из ) значение при 440 нм, которое представляет перекрестное возбуждение YFP ​​в режиме FRET, составляет 2,9% от максимального ε _Y ( λ _из ) значение при 513 нм.

Если предположить, что слияние RLuc8 на С-конце в кадре не изменило физических свойств биосенсоров, теоретические биолюминесцентные спектры описываются следующим уравнением:

$$ \ begin {array} {rcl} { \ rm {B}} (\ lambda) & = & {E} _ {RC} \ times (1- {E} _ {CY}) \ times {\ varphi} _ {C} \ times {f} _ { C} (\ lambda) + ({E} _ {RY} + {E} _ {RC} \ times {E} _ {CY}) \ times {\ varphi} _ {Y} \ times {f} _ { Y} (\ lambda) \\ & & + \, (1- {E} _ {RC} — {E} _ {RY}) \ times {\ varphi} _ {R} \ times {f} _ {R } (\ lambda), \ end {array} $$

(2)

где B ( λ ) — интенсивность биолюминесценции на длине волны λ, E _RC — эффективность BRET между RLuc8 и CFP, E _RY — эффективность BRET между RLuc8 и YFP, ϕ _R — квантовая эффективность RLuc8, а f _R ( λ ) — нормализованное излучение RLuc8.

E _CY был оценен путем нелинейной подгонки измеренных спектров флуоресценции к формуле. 1. E _{RC Предполагается, что} является постоянным независимо от конформации биосенсора, поскольку линкер между RLuc8 и CFP был оптимизирован для максимизации эффективности BRET и стабилизации структуры слитого белка RLuc8-CFP. Следовательно, E _RC Nano-lantern используется для биосенсора hyBRET.Квантовая эффективность голубого нано-фонаря, ϕ _CNL , выражается следующим уравнением:

$$ {\ varphi} _ {CNL} = {\ varphi} _ {C} \ times {E} _ {RC} + {\ varphi} _ {R} \ times (1- {E} _ {RC}), $$

(3)

Используя данные квантовой эффективности, приведенные в таблице S1, E _RC было определено как 0,13. Наконец, E _RY был оценен путем подгонки измеренных биолюминесцентных спектров к формуле.2. Значения ε и ϕ перечислены в таблице S1.

Скорость передачи энергии биосенсоров, содержащих NanoLuc, определяли аналогично биосенсорам, содержащим RLuc8, путем нелинейной подгонки измеренных спектров флуоресценции к уравнению. 4.

$$ \ begin {array} {rcl} {\ rm {B}} (\ lambda) & = & {E} _ {NC} \ times (1- {E} _ {CY}) \ times {\ varphi} _ {C} \ times {f} _ {C} (\ lambda) + ({E} _ {NY} + {E} _ {NC} \ times {E} _ {CY}) \ times {\ varphi} _ {Y} \ times {f} _ {Y} (\ lambda) \\ & & + \, (1- {E} _ {NC} — {E} _ {NY}) \ times { \ varphi} _ {N} \ times {f} _ {N} (\ lambda), \ end {array} $$

(4)

где B ( λ ) — интенсивность биолюминесценции на длине волны λ, E _NC — это эффективность BRET между NanoLuc и CFP, E _NY — это эффективность BRET между NanoLuc и YFP, ϕ _N — квантовая эффективность NanoLuc, а f _N ( λ ) — нормализованное излучение NanoLuc.Обратите внимание, что эффективность BRET между NanoLuc и CFP, E _NC , был также оценен по формуле. 4, установка E _NY и E _CY как ноль.

Покадровая визуализация культивируемых клеток

Покадровая съемка была получена и обработана с использованием, по существу, тех же условий и процедур, что и ранее. ⁵² .Вкратце, клетки HeLa, экспрессирующие биосенсоры hyBRET, голодали в течение 3-8 часов с помощью FluoroBrite DMEM (Thermo Fischer Scientific, Уолтем, Массачусетс) с добавлением 0,1% бычьего сывороточного альбумина (БСА), 1 мМ пирувата натрия (Thermo Fischer Scientific), GlutaMax и пенициллина. /стрептомицин. При необходимости голодные клетки обрабатывали стимулом в процессе покадровой визуализации. Клетки получали с помощью инвертированного микроскопа (IX83; Olympus, Токио), оснащенного линзой объектива (масляный объектив UPlanSApo 60 × / 1,35NA; Olympus), системой освещения (световой двигатель Spectra-X; Lumencore, Бивертон, Орегон), Лазерная система автофокусировки IX3-ZDC2 (Olympus), автоматически программируемый XY-столик MD-XY30100T-Meta (SIGMA KOKI, Токио) и инкубатор INUG2F-IX3W (Tokai Hit, Фудзиномия, Япония).В каждом эксперименте использовалась одна из следующих камер: CCD с охлаждением MD-695 (Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния), EMCCD с охлаждением iXon Ultra 888 (ANDOR, Белфаст, Великобритания) и EMCCD с охлаждением Rolera Thunder (QImaging, Surey, BC) . Для визуализации FRET клетки подвергали воздействию света 440 нм с интенсивностью света 25 мкВт / см ² в течение 30–200 мс, и получали изображения FRET и CFP. Для визуализации BRET в чашку для культивирования добавляли 20 мкМ коэлентеразин-h или 3 мкМ фуримазин (Promega) перед началом визуализации.Голубое свечение и желтое свечение клеток регистрировали при времени экспозиции от 6 до 30 с, в зависимости от камеры, используемой в каждом эксперименте. Чтобы уменьшить рассеянный свет от микроскопа и окружающей среды во время визуализации BRET, в IX83 был включен режим аппаратного затемнения, верх нагревателя предметного столика был покрыт алюминиевой фольгой, и эксперименты проводились в темной комнате. Дихроичные зеркала и фильтры, использованные в этой работе, представляли собой дихроичное зеркало FF458-Di02-25×36 для CFP и FRET, три эмиссионных фильтра (FF01-483 / 32-25 для CFP и голубой люминесценции, FF01-542 / 27-25 для FRET, YFP и желтое свечение и FF01-624 / 40-25 для mCherry) от Semrock (Рочестер, Нью-Йорк) и стеклянный отражатель U-MREF, используемый в качестве дихроичного зеркала для YFP и mCherry от Olympus.Для визуализации BRET не использовалось дихроичное зеркало.

Обработка изображений

Программное обеспечение Metamorph (Molecular Devices) и программное обеспечение Safir (Roper Scientific France, Lisses, Франция) использовались для уменьшения шума и анализа изображений. После вычитания фона изображения отношения FRET / CFP были созданы и представлены в режиме отображения с модуляцией интенсивности (IMD). В режиме IMD восемь цветов от красного до синего используются для представления отношения FRET / CFP, причем интенсивность каждого цвета указывает среднюю интенсивность каналов FRET и CFP.Для люминесцентных изображений вычитанию фона предшествовало удаление космических лучей и уменьшение шума ⁵³ . Затем были созданы изображения с соотношением желтого / голубого люминесценции таким же образом, как и изображения с соотношением FRET / CFP. Двухволновые изображения, полученные при люминесцентном изображении всего тела, были разделены между желтым и голубым люминесцентными изображениями после удаления шума и вычитания фона. На рис. S7 сигналы от голубого нано-фонарика и желтого нано-фонаря были разделены линейным разделением.

Optogenetics

Клетки HeLa трансфицировали вектором экспрессии для биосенсора hyBRET, pCX4neo-CIBN-EGFP-x и вектором экспрессии для слитого белка CRY2.Через день после трансфекции клетки голодали с помощью FluoroBrite DMEM с добавлением 0,1% бычьего сывороточного альбумина (БСА), 1 мМ пирувата натрия и GlutaMAX в течение 3-8 часов. Перед началом визуализации в чашку для культивирования добавляли 20 мкМ коэлентеразин-ч. Канал mCherry использовался для определения фокуса и положения стадии, чтобы не запускать транслокацию через мембрану слитых с CRY2 сигнальных молекул. Визуализацию BRET выполняли, как описано выше. В момент времени 0 клетки освещали светом с длиной волны 490 нм (55 мкВт / см ² ) в течение 100 мс.Чтобы оценить влияние освещения синим светом на соотношение BRET сенсоров hyBRET и интенсивность люминесценции RLuc8, клетки трансфицировали pCAGGS-hyBRET-ERK или pCSIIpuro-RLuc8. На следующий день клетки голодали и получали люминесцентное изображение, как описано выше. Во время визуализации клетки освещали светом 440 нм (200 или 450 мкВт / см ² ) или светом 490 нм (180 мкВт / см ² ) в течение 5 с в заранее определенные моменты времени. Плотность света измеряли измерителем оптической мощности TQ8230 (Advantest).

Анализы на микропланшетном ридере

Клетки, экспрессирующие hyBRET-ERK, высевали на 96-луночные белые планшеты при плотности клеток 3000 клеток / лунку. На следующий день клетки обрабатывали серийно разведенным AZD6244, ингибитором MEK, в течение 20 минут. Цифровой диспенсер HP D300 (Tecan, Männedorf, Швейцария) использовался для разбавления лекарственного средства и добавления в лунку. После обработки лекарственным средством в каждую лунку добавляли среду, содержащую 1 мкМ коелентеразин-h с серийно разведенным ингибитором, и измеряли желтое и голубое свечение с помощью устройства для считывания микропланшетов GloMax Discover (Promega).Фильтр короткого прохода 495 нм использовали для голубой люминесценции, а фильтр длиной 530 нм использовали для желтой люминесценции. В мультиплексном анализе, показанном на рис. 4c – f, среду заменяли 250 мкл FluoroBriteDMEM с добавлением 10% FBS, 1 мМ пирувата натрия, GlutaMAX и пенициллина / стрептомицина после прикрепления клеток ко дну лунки. Через несколько часов после смены среды клетки обрабатывали серийно разведенным гефитинибом в течение 1 дня. Голубое свечение и желтое свечение клеток hyBRET-ERK, обработанных лекарственным средством, измеряли в присутствии 1 мкМ целентеразина-h.{\ prime} = 1- \ frac {3 (S {D} _ {AZD0} + S {D} _ {AZD1})} {Av {e} _ {AZD0} -Av {e} _ {AZD1}} $$

(5)

Здесь SD — это стандартное отклонение, а Ave — это среднее значение желтого / голубого люминесценции из 3 лунок, обработанных без AZD6244 (AZD0) или 1 мкМ AZD6244 (AZD1). На рис. 4f теоретические функции, описанные ниже, использовались в качестве модельных функций для соответствия экспериментальным данным, как сообщалось ранее ²⁶ . Уравнения представляют взаимосвязь между активностью ERK и количеством живых клеток.{\ frac {1} {n {H} _ {ERK}}} $$

(7)

Здесь min — минимум, amp — амплитуда, IC50 — это половина максимальной ингибирующей концентрации, а nH — коэффициент Хилла количества живых клеток (L) или активности ERK (ERK). ERK — это соотношение желтого / голубого люминесценции hyBRET-ERK. Поскольку минимумы и амплитуды были однозначно определены из экспериментальных данных, IC50s и nHs были подобраны как свободные параметры.

Образование опухоли ксенотрансплантатом и генерация трансгенных мышей

Самок мышей BALB / c nu / nu в возрасте 7–9 недель (Japan SLC, Hamamatsu, Japan) использовали для образования опухоли ксенотрансплантата.1 × 10 ⁶ клеток HeLa, стабильно экспрессирующих желтый нано-фонарь и голубой нано-фонарь в 50 мкл GelTrex / PBS (1: 1) (ThermoFisher Scientific), вводили подкожно в левый и правый бок мышей. Мышей визуализировали через две недели после трансплантации. Для исследования метастазов опухоли мышам внутривенно вводили 1 × 10 ⁵ клеток опухоли молочной железы мыши 4T1, стабильно экспрессирующих hyBRET-ERK или hyBRET-ERK-TA в PBS в хвостовой вене, и анализировали через 2–3 недели после инъекции опухоли 4T1. .Трансгенные мыши были получены с помощью Tol2-опосредованного переноса гена ⁵⁴ . Вкратце, оплодотворенные яйца, полученные от мышей Jcl: B6C3F1 (B57BL / 6N Jcl X C3H / HeN Jcl), микроинъектировали смесью мРНК Tol2 и pT2ADW-hyBRET-ERK. Животных-основателей скрещивали с мышами Jcl: ICR для получения стабильных линий. Новорожденных мышей освещали синим фонариком LEDGFP-3W (Optocode, Tokyo) и проверяли на зеленую или красную флуоресценцию через желтые очки. Протоколы для животных были рассмотрены и одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Высшей школы медицины Киотского университета (No.10584, 14079, 15064, 16038 и 17539), и методы были выполнены в соответствии с соответствующими директивами и правилами.

Биолюминесцентная визуализация всего тела животных

Для сравнения продолжительности жизни биолюминесценции между аналогами целентеразина-h in vivo (рис. S7) мышей с подкожными опухолями анестезировали изофлураном (1,5% ингаляции, 0,5 л / мин) и внутривенно вводили коэлентеразин-h (80 мкг на мышь) в этаноле / PBS (1: 4) или диацетил-коэлентеразин-h (80 мкг на мышь) / Pluronic F-127 (20% мас. / об. в DMSO) (Biotium, Hayward , CA) (1: 1) растворяли в PBS.Для получения люминесцентных изображений мышей с метастазированными опухолями (рис. 5a – j и S8) мышей анестезировали изофлураном (1,5% ингаляции, 0,5 л / мин) и внутривенно вводили смесь диацетил-целентеразина-h (200 мкг на мышь. ) и носитель или 5,0 мг / кг PD-0325901 в Pluronic F-127 (20% мас. / об. в ДМСО) / PBS (1: 1) (общий объем составлял 100 мкл / мышь). Для визуализации трансгенных мышей, экспрессирующих hyBRET-ERK (рис. 5k), трансгенных мышей анестезировали изофлураном (1,5% ингаляции, 0.5 л / мин) и вводили 1 мМ диацетил целентеразин-h, растворенный в PBS, содержащем 1% Pluronic F-127 (20% мас. / Об. В ДМСО), путем непрерывной внутривенной инфузии со скоростью 90 мкл / час с помощью шприцевого насоса Model 11 plus (Harvard Аппарат, Холлистон, Массачусетс). Носитель или 5,0 мг / кг PD-0325901 (общий объем составлял 100 мкл / мышь) вводили внутрибрюшинно во время визуализации. Изображение мышей получали с помощью имидж-сканера MIIS (Molecular Devices), оснащенного камерой iXon Ultra 888 EMCCD (ANDOR), оптикой разделения изображений W-VIEW GEMINI (Hamamatsu Photonics), системой светодиодного освещения XT640-W (Lumen Dynamics, Missisauga, ON ) и монофокальный телецентрический объектив TEC-55 (Computar, Cary, NC), управляемый программой Metamorph (Molecular Devices).Во время люминесцентной визуализации мышей держали под анестезией изофлураном и держали в тепле с помощью пластины предварительного нагрева Chamlide (Live Cell Instrument, Сеул, Корея). Желтое свечение и голубое свечение опухолей регистрировали при следующих условиях: время экспозиции 30 с (для подкожных опухолей) или 4 мин (для метастазированных опухолей), усиление ЭМ 1000 (максимум) и биннинг ПЗС 1. Дихроичное зеркало и Эмиссионные фильтры, установленные в W-VIEW GEMINI для двухцветного люминесцентного изображения in vivo , представляли собой дихроичное зеркало FF509-Di01-25×36 и два эмиссионных фильтра (FF01-483 / 32-25 для голубой люминесценции и FF01-542 / 27- 25 для желтого свечения) и были получены от Semrock.

Прижизненная FRET-визуализация легкого мыши

Мышей с метастатической опухолью 4T1 анестезировали изофлураном (1% ингаляция, 0,5 л / мин). Часть кожи на левой груди была разрезана, чтобы обнажить поверхностный мышечный слой и ребра. Горло мышей разрезали по средней линии глотки, чтобы обнажить трахеальную трубку, и в трахеальную трубку вставляли ангиокатетер SURFLO 22-G (Terumo, Tokyo). Затем мышей помещали в положение для правого бокового пролежня и резецировали левые ребра, чтобы обнажить левое легкое.Мышей немедленно подключали к механическому аппарату ИВЛ MK-V100 (Muromachi Kikai, Tokyo). До конца визуализации дыхание обеспечивалось механически при следующих условиях: 55 ударов в минуту, 35 мл / мин, соотношение вдох / выдох 3: 2, изофлуран 1,5%. Чтобы уменьшить артефакты движения, вызванные дыханием, обнаженную область левого легкого осторожно отсосали и зафиксировали на покровном стекле с помощью изготовленного на заказ стабилизатора органа, который был подключен к вакуумному насосу. Опухоли в легких получали с помощью вертикального микроскопа FV1200MPE-BX61WI (Olympus), оснащенного водно-иммерсионным объективом XLPlanN 25x (Olympus), лазером InSight DeepSee (Spectra-Physics, Санта-Клара, Калифорния) и FV1200MPE Reflected Четырехканальный внешний детектор GaAsP NDD (Olympus).CFP возбуждали лазером с длиной волны 840 нм. В качестве дихроичных зеркал использовали DM450, DM570 и DM505 (Olympus). Используемые фильтры выбросов: FF01-425 / 30 (Semrock), BA460–500 (Olympus) и BA520–560 (Olympus) для SHG, CFP и FRET, соответственно. Во время визуализации FRET мышам внутривенно вводили 5,0 мг кг ^-1 PD-0325901 без прерывания визуализации.

Продвинутые приложения для микроскопии — обзор FRET- Oxford Instruments

FRET (иногда называемый Förster Resonance Energy Transfer ) позволяет определить близость двух флуорофоров.FRET — это один из ряда методов одиночных молекул, таких как TIRF, SIM и локализация сверхвысокого разрешения, которые приобрели популярность в последние годы. Резонансная передача энергии происходит только на очень короткие расстояния, обычно в пределах 10 нм, и включает прямую передачу энергии возбужденного состояния от донорного флуорофора к акцепторному флуорофору в качестве альтернативы затуханию флуоресценции от донора. При передаче энергии молекула-акцептор переходит в возбужденное состояние, из которого она распадается эмиссионно (всегда с большей длиной волны, чем у акцепторного излучения).Возбуждая донора, а затем отслеживая относительные выбросы донора и акцептора, последовательно или одновременно, можно определить, когда произошел FRET и с какой эффективностью.

Флуорофоры могут использоваться для специфической маркировки представляющих интерес биомолекул, а условие расстояния для FRET порядка диаметра большинства биомолекул (1-10 нм). Это означает, что FRET можно использовать для определения того, когда и где две или более из этих меченых биомолекул (обычно белки) взаимодействуют в своем физиологическом окружении.Сигнал FRET, соответствующий определенному месту на изображении микроскопа, обеспечивает дополнительную точность определения расстояния, превышающую оптическое разрешение (~ 0,25 мм) светового микроскопа. Помимо пространственной близости, для эффективного FRET, пара красителей должна также демонстрировать значительное перекрытие спектра возбуждения донора со спектром поглощения акцептора. Именно эта характеристика составляет один из экспериментальных парадоксов FRET:

• Спектральные профили пары FRET не могут быть разделены настолько, что они плохо перекрываются,
• , тем не менее, кто-то хочет избежать «перекрестных помех» между двумя каналами формирования изображения, т.е.е. В идеале комплект эмиссионных фильтров донора должен собирать только свет от донора, а не от акцептора, и наоборот.

На практике это может быть достигнуто с помощью коротких полосовых фильтров, которые собирают свет только с более коротковолновой стороны донорного излучения и более длинноволновой стороны акцепторного излучения. Это может несколько ограничить поток фотонов как от донора, так и от акцептора во время типичного экспонирования, особенно если учесть, что эти измерения лучше всего проводить в условиях пониженной мощности возбуждения, так что мы не увеличиваем скорость обесцвечивания.Это означает, что для экспериментов FRET требуются сверхчувствительные детекторы.
Примеры пар красителей FRET включают:

• BFP-GFP
• CFP-DSRED
• BFP-GFP
• Cy3-Cy5
• CFP-YFP
• Алекса488-Алекса555
• Алекса488-Cy3
• Алекса594-Алекса647
• FITC-TRITC
• Тербий (III) -Флуоресцеин
• DiSBAC4 (3) -CC2-DMPE (пара FRET, чувствительная к напряжению)

Профиль пары красителей CFP-YFP FRET показан ниже:

Спектральные профили поглощения и излучения пары CFP-YFP FRET.

Andor iXon EMCCD, будь то в качестве ключевого компонента платформы конфокальной визуализации живых клеток Dragonfly или в составе другой конфокальной системы, представляют собой хорошо зарекомендовавшие себя детекторные решения для получения изображений FRET. EMCCD обеспечивает высокое разрешение и высокое отношение сигнал / шум (S / N) для определения взаимодействий FRET по всей отображаемой области или объему клетки и помогает устранить низкие уровни фотонов, присутствующие при использовании узкополосных фильтров. В сочетании с тщательным выбором наборов фильтров это обеспечивает высокую целостность данных FRET.Поскольку EMCCD преодолевают предел обнаружения минимального уровня шума при любой скорости считывания, молекулярные взаимодействия можно отслеживать динамически с высокой точностью. Кроме того, мощность возбуждения часто может быть уменьшена, что означает минимизацию фототоксических эффектов и эффектов фотообесцвечивания, так что за молекулярными взаимодействиями можно следить в течение гораздо более длительных периодов. Для получения дополнительной информации о выборе детектора для исследования одиночных молекул, пожалуйста, просмотрите статью Какой детектор является лучшим для исследования одиночных молекул?

1.О, H-K et al. (2019) Быстрое и простое обнаружение охратоксина A с использованием флуоресцентного резонансного переноса энергии в иммуноанализе бокового потока (FRET-LFI) Toxins 11 (5), 292; https://doi.org/10.3390/toxins11050292
2. Hu J. et al (2018) Объединение антенн из наночастиц золота с резонансным переносом энергии флуоресценции одиночных молекул (smFRET) для изучения динамики шпильки ДНК Nanoscale, 10, 6611-6619 10.1039 / C7NR08397A
3. Чаурасия К.Р., Дама РТ (2018) Одномолекулярный FRET-анализ ДНК-связывающих белков.В: Peterman E. (eds) Single Molecule Analysis. Методы молекулярной биологии, том 1665. Humana Press, New York, NY
4. Юнг, С. и др. (2018), Мониторинг в реальном времени состояния связывания / диссоциации и окислительно-восстановительного состояния ионов одного переходного металла. Бык. Korean Chem. Soc., 39: 638-642. DOI: 10.1002 / bkcs.11443

TCSPC, FRET, TRES, SSTD и др.

Каковы применения TRES (спектры излучения с временным разрешением)?

Рис. 45: TRES 2-нафтола и 2-нафтолата A: Спектры стационарного состояния для 2-нафтола в буфере PBS, pH 7.4. B: флуоресценция затухает на разных длинах волн в спектре излучения. C. Скорости биэкспоненциального затухания на разных длинах волн по всему спектру, наложенные на спектр излучения в установившемся режиме. D. Временные срезы: спектр излучения в разное время во время затухания флуоресценции 2-нафтола

Измерение спектра излучения с временным разрешением — это метод, который измеряет затухание флуоресценции при возрастающих длинах волн в спектре излучения образца. Получен трехмерный график зависимости интенсивности от времени в зависимости от длины волны.Посмотрев на этот набор трехмерных данных в направлении спектров в разное время, а не на затухания на разных длинах волн, можно измерить спектр излучения с временным разрешением. Если образец содержит несколько излучателей с перекрывающимися спектрами, но с разным временем жизни, отдельные спектры этих компонентов можно разделить с помощью TRES.

Например, 2-нафтол ионизируется с образованием 2-нафтолата в возбужденном состоянии. (Коти, 2001). Спектр излучения в установившемся состоянии показывает два пика, что указывает на присутствие обоих видов.Измерение времени жизни на увеличивающихся длинах волн в спектре излучения показывает очень разные скорости затухания на каждом пике излучения. Подбирая распады, можно увидеть, как изменяются времена жизни и / или амплитуды компонентов на разных длинах волн излучения.

Для 2-нафтола пик эмиссии 2-нафтола при 354 нм имеет другой срок службы, чем у 2-нафтолата, пик эмиссии которого составляет около 414 нм. Модель с двумя состояниями ионизированного и неионизированного 2-нафтола четко показана на TRES.Две постоянные времени представляют собой разное время затухания для 2-нафтола (преобладающее значение 3,4 нс при 357 нм) и 2-нафтолата (преобладающее значение 9,4 нс при 414 нм). Приведенные ниже данные были измерены на FluoroMax-4 с электроникой FluoroHub TCSPC и источником возбуждения NanoLED-280, работающим на частоте 1 МГц.

Еще одно применение TRES — измерение постоянных времени переориентации растворителя. (Хорнг, 1995). Глядя на один флуорофор и на то, как спектр излучения смещается во времени, можно построить график зависимости энергии пика от времени и подобрать его для получения постоянной времени.Сдвиг спектра в этом случае может быть связан с переориентацией дипольных моментов молекул растворителя в ответ на дипольный момент возбужденного состояния флуорофора. Подбирая максимальную энергию спектра излучения во времени, можно получить постоянную времени переориентации молекул растворителя. (Хорнг, 1995).

Изображение белков | EurekAlert!

Видеть большую картину

Пучок электронов микроскоп может производить дифракционные картины от двумерный кристаллический массивы, а не трехмерные массивы требуется для дифракции рентгеновских лучей.В случае мембраны белки, эти двухмерные кристаллы можно создать в более листы естественного закрепления жирные молекулы, называемые липиды — чем тяжелые концентрации моющих средств необходимо для формирования трехмерных кристаллов.

Иногда электрон кристаллография — единственная путь идти, как это было в случае два года назад, когда биофизики Ева Ногалес, Шэрон Вульф и Кеннет Даунинг из лаборатории Беркли Отдел естественных наук, объявил о завершении первый трехмерный атомный модель белка под названием «тубулин» — универсальный молекула, которая среди прочего функции, позволяет клетке претерпевают митоз.На разрешение 3,7 ангстрем, эта модель предоставила первую высокодетализированный трехмерный взгляд на тубулин, включая место, где белок взаимодействует с таксолом противоракового препарата.

Использование электронных, а не рентгеновских методов кристаллографии было имеет решающее значение для создания этой модели. Как объяснил Даунинг, «получение дифракционных картин с электронным пучком позволили работать с кристаллами толщиной всего в одну молекулу, давая нам наше высокое разрешение.»

Определение атомной структуры тубулина было впечатляющим успехом — ученые пытались чтобы сделать это с момента открытия белка в 1960-х годах, но проект взял на себя лабораторию Беркли. исследователям требуется более шести лет. За это время было записано около 4000 изображения и картины дифракции электронов, которые Ногалес обработал, чтобы получить 159 изображений и 93 дифрактограммы, использованные для компьютерной реконструкции окончательного Трехмерная модель тубулина.

Метод, используемый для определения структуры тубулина, называется криоэлектронной микроскопией или «крио-эм», потому что изображения были записаны с помощью электронного микроскопа, оснащенного «холодная стадия». Замораживание белка сохраняет его в естественном гидратированном состоянии и помогает защитить его от радиационного поражения. Еще одно дополнение к электронной микроскопии с исключительно высокий потенциал для решения структур макромолекулярных белков комплексы — это метод, называемый «анализ изображений отдельных частиц».»

При анализе изображений отдельных частиц тысячи изображения случайно ориентированного индивидуального белка молекулы записываются через электрон микроскоп. Затем компьютер используется для выравнивания эти тысячи случайно ориентированных изображений в упорядоченный массив и объединить их в трехмерная реконструкция — по сути, создание виртуального кристалла.

Возможности анализа изображений отдельных частиц как инструмент для структурной геномики был недавно продемонстрировано в проекте под руководством Ногалеса.Работающий с белками, приготовленными в лаборатории Калифорнийского университета в Беркли профессор Роберт Тьян, Ногалес и Фрэнк Андел использовали комбинацию электронной микроскопии и анализ изображений отдельных частиц для получения первого Трехмерные модели белкового механизма, который инициирует транскрипция генетического кода ДНК для последующее производство новых белков. Этот машина на самом деле представляет собой комплекс транскрипционных белки фактора (tf), которые включают TFIID, TFIIA и TFIIB.

После того, как нить ДНК была размотана и разархивирован при подготовке к производству белка, Белок TFIID связывается с обнаженным участком ДНК именно там, где начинается генетическое сообщение. Один раз TFIID распознает и связывается с геном на цепи ДНК, он взаимодействует с полимеразой РНК так что генетический код транскрибируется в мессенджер РНК, которая затем несет информация из ядра клетки в ее цитоплазму, где сборка белка принимает место.

«Наша модель дает нам хорошее представление о том, как TFIID работает совместно с TFIIA и TFIIB. чтобы инициировать и регулировать транскрипцию генов, кодирующих белок, — говорит Ногалес. показать структуру в форме подковы, окружающую центральную полость, внутри которой происходит распознавание и связывание с ДНК «.

Структурные определения для некоторых доменов и других компонентов TFIID, TFIIA и белки TFIIB были определены с помощью рентгеновской кристаллографии, но размер TFIID в сочетании с трудностями, возникающими при попытке кристаллизовать все tf-белки вместе, до сих пор исключало использование дифракции рентгеновских лучей для визуализации всего комплекса.Следовательно, до сих пор общая форма и взаимное расположение компонентов внутри комплексы были загадкой.

TFIID представляет собой белок в форме подковы, который запускает процесс транскрипции гена путем связывания к открытой цепи ДНК именно там, где начинается генетическое сообщение. Центральная полость размер подковы позволяет легко закрепить на одной нити ДНК.

Поскольку Ногалес и ее коллеги не нужно было кристаллизовать комплекс tf, они может работать с относительно небольшим количеством образца и при этом создавать изображение вся транскрипционная машина.Менее чем за семь месяцев у них появилась трехмерная реконструкция с разрешением 35 ангстрем.

«Наше исследование показывает, что электронная микроскопия — хороший метод изучения биологических комплексы белков и нуклеиновых кислот, которые слишком велики или слишком хрупки для кристаллизации для исследований дифракции рентгеновских лучей «, — говорит Ногалес, который доверяет Анделю одночастичное аналитическая работа. «Наше исследование также показывает, что одночастичная методология полезна метод структурной характеристики транскрипционных комплексов мегадальтона.»

При разрешении 35 ангстрем формы TFIID и его сопутствующих белков плюс их отчетливо видны относительные положения внутри комплекса tf. Когда этот электрон информация микроскопии сочетается с рентгеновскими данными различных субструктур в пределах комплекс — метод, получивший название «гибридная кристаллография» — Ногалес и ее коллеги Ожидайте найти дополнительные ключи к разгадке того, как работает транскрипционный аппарат. (Подробнее о лаборатории Ногалеса на сайте http: // cryoem.berkeley.edu.)

Роберт Глезер, профессор биофизики Калифорнийского университета в Беркли с совместным назначением в Отделение наук о жизни и биологических наук Berkeley Lab является пионером и мировым лидером. авторитет по электронной кристаллографии. Глейзер говорит, что гибридная кристаллография поднимает » большой энтузиазм «среди ученых в своей области, потому что» это комплексы, а не отдельные компоненты, которые действительно начинают приносить структурные биологии в сферу функциональной геномики.»

Glaeser сравнивает рентгеновскую кристаллографию с определением всех отдельных компонентов, которые зайти в блок двигателя авто — свечи зажигания, распредвал, клапаны и т. д. »Строение каждого этих компонентов очень интересно и поучительно, но вы также хотите знать, как свеча зажигания входит в блок, порядок открытия и закрытия клапанов и т. д. далее, и как все это достигается », — говорит он.

Глезер, Ногалес и Даунинг недавно начали использовать электронный микроскоп в Национальный центр электронной микроскопии Berkeley Lab (ncem), оснащенный автоэмиссионная пушка, которая позволяет направлять сильно сфокусированные электронные пучки на 200 киловольт (кВ) энергии на образец.Это увеличивает резкость разрешения и увеличивает контрастность для получения изображений лучшего качества, чем электронные микроскопы с меньшей мощностью они раньше использовали. Все трое наблюдают за приобретением новых, изготовленных по индивидуальному заказу электронный микроскоп, который будет ускорять электронные лучи до 300 кВ, что должно улучшить разрешение и качество изображения еще больше.

«Этот новый микроскоп позволит нам получить максимально возможное разрешение на наших изображениях. при этом нанося наименьший ущерб нашим образцам », — говорит Ногалес.»С добавлением новой технологии детекторов, мы также сможем собирать наши данные намного быстрее и более эффективно.»

Между новым микроскопом и оборудованием ncem, исследователи лаборатории Беркли надеюсь, что смогу записывать до 3000 изображений в день. Все-таки электронная микроскопия и гибрид кристаллография не будет соответствовать рентгеновской кристаллографии на основе синхротрона для атомного уровня детали и скорость прохождения. Однако другой подход к электронной микроскопии может подойди ближе.

Глэзер в сотрудничестве с Даунингом и Ногалесом, а также Рави Маллади и Эсмонд Нг из Национальный вычислительный центр энергетических исследований (NERSC) изучает возможность применения огромных вычислительных мощностей суперкомпьютера к электронным микроскопические методы визуализации.

С суперкомпьютером вместо работы с несколькими десятками тысяч изображений как есть Теперь, когда все готово, можно собрать и объединить до миллиона изображений один некристаллизованный белок, затем реконструируйте эти изображения в трехмерную модель на разрешение сравнимо с тем, что достигается с помощью рентгеновской кристаллографии.Более того, с суперкомпьютеры в Nersc, способные производить триллионы вычислений каждую секунду, такие реконструкция могла быть сделана менее чем за полдня. Глэзер называет этот подход «кристаллизация in silico», эквивалент использования компьютера для выполнения сложной задачи кристаллизации белка.

«В настоящее время существует программное обеспечение для слияние данных от одной частицы было написано для рабочих станций и мало было сделано, чтобы воспользоваться преимуществами суперкомпьютера возможности «, — говорит он.

Глезер и его сотрудники стремятся сделать кристаллизация in silico «важный игрок в структурная геномика «путем изучения способов автоматизация сбора данных изображения, частицы идентификация и окончательное объединение данных из отдельные частицы.

«С дальнейшим улучшением качества изображения, более близко приближаясь к законам физика позволит, размер частиц, который может быть обрабатываемые этой техникой могут подтолкнуть к диапазон, который включает в себя все, кроме самых маленьких белки «, — говорит Глэзер.

«На этом этапе он может стать предпочтительным методом решения структур любых белок, который еще не кристаллизовался «.

Увеличение деталей

С рентгеновской кристаллографией для определения трехмерных структур белковых компонентов и электронная микроскопия, чтобы показать, как эти компоненты входят в комплексы, все еще существует необходимо увеличить масштаб, чтобы увидеть более мелкие детали электронных свойств, чтобы увидеть, как белок машина выполняет свои химические функции.Лучшие методики для этой работы — рентген. спектроскопия поглощения (xas) и расширенная тонкая структура поглощения рентгеновских лучей (exafs). Оба метода основаны на энергетическом спектре, создаваемом одним или несколькими сердечниками. электроны (те, чьи энергетические орбитали наиболее близки к ядрам атома) поглощают рентгеновские лучи. В xas электрон перемещается на орбиталь с более высокой энергией, и в результате спектр предоставляет важную информацию о том, как электроны основного атома настроен.В exafs электрон выбрасывается из атома как фотоэлектрон, и Полученный спектр обеспечивает чрезвычайно точные измерения длин электронных связей.

«Рентгеновская абсорбционная спектроскопия — прекрасное дополнение к рентгеновской кристаллографии», говорит химик pbd Карен Макфарлейн. «Мы можем взглянуть на конкретный тип атома в белка и посмотреть, кто его соседи, и мы можем взглянуть на него с разных точек зрения. среды или после того, как мы им манипулировали.»

Макфарлейн руководил проектированием и строительством новой экспериментальной оконечной станции на als луч 9.3.1, луч изгибного магнита, который генерирует рентгеновские фотоны в диапазоне от 2 до 6 диапазон тысяч электрон-вольт (кэВ). Эти фотоны идеально подходят для изучения таких атомов. как сера, хлор и кальций, которые являются второстепенными, но критически важными белками составляющие. Например, серосодержащий пептид, глутатион, помогает предотвратить окислительное и свободнорадикальное повреждение клетки и укрепление красных кровяных телец, в то время как защита лейкоцитов.

Новая оконечная станция на канале 9.3.1 имеет камера для проб с криостатом на жидком гелии для охлаждение белковых молекул до 10 Кельвинов в чтобы минимизировать радиационное повреждение и позволить exafs в дополнение к сбору данных xas. Давление внутри камеры можно варьировать или эксперименты можно делать в вакууме, а образцы можно изучается в твердом или жидком состоянии. Этот уникальный Камера была построена физиком PBD Мелом Кляйном, который является главным исследователем исследований в конечная станция, работающая в сотрудничестве с коллегами химик ПБР Виттал Ячандра.

«До сих пор в большинстве экспериментов с xas и exafs выполнено на металлических центрах в металлопротеинах пока экспериментирует с серой, хлором, кальцием и другие атомы с более низким Z встречаются редко », — говорит Макфарлейн. «Мы планируем использовать наши экспериментальные станции экстенсивно для серы во многих различных белки, пептиды и неорганические комплексы. Мы также есть планы по исследованию хлора и кальция в белковый комплекс Photosystem II «.

Помимо предоставления электронных и конструктивных информация, которая дополнит рентгеновский снимок данные кристаллографии, рентгеновская спектроскопия техники также могут быть использованы для выполнения сравнительные измерения, которые ответят вопросы, на которые ни одна техника не могла ответить в одиночку.Например, такие сравнительные измерения могут помочь определить, есть ли различия в активных центрах белков, когда они находятся в растворе, в отличие от того, когда они кристаллизовались. Эксперименты на оконечной станции xas / exafs на канале 9.3.1 планируется начать в начале лета следующего года.

Создание фильмов о белках

Независимо от того, сосредотачиваетесь ли вы на самых больших, мельчайших или мельчайших деталях белковых структур, все Все описанные выше методы имеют одну общую черту — все они обеспечивают статические изображения.Пока что белковые машины динамичны, когда выполняют свои функции. Так же, как фотография автомобиль в состоянии покоя, независимо от качества изображения, мало ценит то, что автомобиль будет делать, когда он движется, ученым нужно будет увидеть белок в действии, чтобы полностью понять его цель.

Разрабатываемые новые технологии позволяют получать динамические изображения белки. Вместо предоставления составных изображений, восстановленных из ансамбля или совокупность избранного типа белковой молекулы, эти новые технологии позволяют ученым изучать и даже физически управлять отдельной отдельной молекулой.

Шимон Вайс, физик, который работает вместе с ПБР и отделом материалов. Отделение наук (MSD), является одним из признанных лидеров в области одномолекулярных соединений. спектроскопия. Он объясняет преимущества характеристики и манипулирования индивидом. молекула белка.

«В отличие от ансамблевых измерений, эксперименты с одной молекулой обеспечивают информация о распределениях и временных траекториях, которые в противном случае были бы скрыты.В в частности, эксперименты с одной молекулой могут быть использованы для измерения промежуточных продуктов и отслеживания зависящие от времени пути химических реакций, которые трудно или невозможно синхронизировать на уровне ансамбля «.

Общая стратегия одиночной молекулы спектроскопия заключается в прикреплении молекул красителя к различные участки вдоль протеина. Эти красители молекулы флуоресцируют определенным цветом, когда застрелен лазерным светом. Отслеживание интенсивности и расположение люминесцентных излучений над время показывает любые изменения, которые могут произойти место в структуре белка.Вариант эта стратегия, которая особенно ценна для измерение конформационных изменений белка «флуоресцентный резонансный перенос энергии» или беспокойство

Чтобы использовать раздражение, ученые помечают белок пара молекул красителя, одна из которых действует как энергия «донор», а другой как энергия «акцептор». Эффект ладов наблюдается при донор возбужден фотовозбуждением и его энергия флуоресценции соответствует энергии акцептор впитает.Если белок сокращается чтобы свести два тега ближе друг к другу, усилен ладовый эффект. Как белок растягивается, раздвигая метки дальше друг от друга, эффект лада ослабевает.

«Путем измерения ладов вместе с одной или несколькими одиночными молекулами. техники манипуляции, можно будет коррелировать локальные структурные изменения белка с макромолекулярной функцией », — говорит Вайс.

Одним из самых больших препятствий на пути к достижению этой цели являются ограничения текущего молекулы флуоресцентного красителя, но помощь уже не за горами.Недавно Вайс и химик MSD Пол Alivisatos объявил о разработке нового типа флуоресцентного зонда, изготовленного из нанометровые кристаллы полупроводников. Эти полупроводниковые нанокристаллы предлагают явное преимущество перед обычными молекулами красителя в том, что они излучают несколько цветов свет, что означает, что их можно использовать для маркировки и измерения нескольких биологических маркеров. одновременно.

«Использование полупроводниковых нанокристаллов должно позволить нам проводить уникальные эксперименты на ладах», — говорит Вайс.»Например, меченые молекулы могут излучать разные цвета при разное время события «.

Alivisatos, орган по химическому производству полупроводников. нанокристаллов, говорит: «Разработка полупроводниковых нанокристаллов для биологических маркировка дала бы биологам целый новый класс флуоресцентных зондов, для которых немало эквивалент органической молекулы существует «.

В эксперименте на клетках ткани мышей, называемых фибробластами 3T3, центральный нанокристалл Селенид кадмия был заключен в оболочку из сульфида кадмия, и это ядро-оболочка combo затем заключили в оболочку из диоксида кремния для обеспечения растворимости в воде и биосовместимости.

Поскольку более ранние исследования Аливисатоса показали, что цвет света, излучаемого полупроводниковый нанокристалл зависит от его размера, клетки мыши были помечены двумя сердечники-оболочки разного размера. Поверхности кварцевых панелей были модифицированы так, чтобы выборочно контролировать их размещение внутри ячеек. Меньшие нанокристаллические ядра-оболочки, которые флуоресцентный зеленый, были модифицированы таким образом, чтобы проникать в ядро ​​каждой клетки; больший ядра-оболочки, излучающие красный свет, были модифицированы таким образом, чтобы они прикреплялись друг к другу. к актиновым филаментам вдоль наружной клеточной мембраны.

Флуоресцентный резонансный перенос энергии или FRET-спектроскопия имеет донор и акцепторная молекула красителя прикреплена в разных точках вдоль образца. Когда донор фотовозбужденные на больших расстояниях от акцептора, флуоресценция исходит исключительно от донор. По мере того, как пространство между ними сокращается, флуоресценция все больше передается. к акцептору.

Изображения конфокальной микроскопии показали, что ядра клеток пронизаны зеленым зонды и волокна актина были окрашены в красный цвет.Зеленая и красная метки были явно видны невооруженным глазом и могут быть сфотографированы в естественных цветах обычным камера. Лаборатория Беркли уникальна тем, что в четырех основных технологические направления, необходимые для решения белковых структур — рентгеновское излучение на основе синхротронов. кристаллография, ЯМР-спектроскопия, электронная микроскопия и суперкомпьютеры. Через его тесные связи с кампусом Беркли Калифорнийского университета, он объединяет некоторые из ведущих исследователей биофизических наук.Таким образом, с лабораторией все в порядке. позиционируется, чтобы помочь решить то, что было названо грандиозным вызовом в биологии, характеристика и понимание того, как работает белковый аппарат клетки.

Как сказал директор общественной организации Грэм Флеминг: «Ничто из того, что происходит внутри живой клетки, не является случайное появление; все управляется этими удивительными протеиновыми машинами ».

###

58957: Тони Райс и его Святой Грааль Мартин D-28

Девятнадцать тридцать пять было всего три недели, но это уже выглядело одним из самых снежных лет за всю историю наблюдений.Зимний шторм пришел из Канады, сбросив фут снега на северо-востоке, прежде чем через несколько дней ушел в море. К 23 января некоторые предприятия в восточной Пенсильвании оставались закрытыми, за исключением C.F. Martin Guitar Company, куда на обычную смену прибыло чуть более 30 человек. Для большинства сельских жителей Назарета, штат Пенсильвания, это было обычным делом.

Прибыли новые заказы на продажу, и пока система отопления ожила, и звуки электроинструментов начали заполнять тихое рабочее пространство, мастер Мартина, Джон Дайчман, направил свое внимание на новое задание: начать работу над партией. из 12 гитар дредноут с корпусом из розового дерева.

Первый шаг был одновременно и самым простым, и самым важным. Шейные блоки из красного дерева уже были вырезаны на настольной пиле и прикреплены к формовочному столу, и теперь их принесли на рабочую станцию, где хранился набор металлических ручных штампов: отдельные инструменты для цифр от 0 до 9, а также тире и несколько прописных букв. Работая от руки, маркер посвятил одну строку обозначениям моделей, а затем перешел к следующей строке с серийными номерами. (Поводом для гордости было то, что К.F. Martin & Co. производили ладовые инструменты чуть более века — и их общее производство исчисляется десятками тысяч.) В течение часа был завершен гриф для последней гитары партии:

Д-28
58957

Позже в тот же день шейный блок был приклеен и прикреплен к паре изогнутых стенок из розового дерева, которые были выбраны из множества таких деталей, сушившихся на чердаке фабрики Мартина на Северной улице. Стороны палисандра были сформированы на горячем гибочном станке с использованием одного из самых чистых шаблонов в магазине в качестве образца.Дредноуты с 14 ладами были одними из новейших дополнений к стандартной линейке Martin, которые были добавлены в каталог годом ранее.

К внутренним краям колесных дисков приклеены полосы пропиленной накладки. Между тем, вертушка зажимных приспособлений размером с дерево — которая, согласно преданиям компании, начала свою жизнь как стрелочный перевод, прежде чем Фрэнк Генри Мартин заметил ее 30 лет назад и приспособил для более высоких задач, — удерживала верхнюю часть и заднюю часть, состоящую из двух частей. будут обрезаны, скреплены и озвучены с кропотливой тщательностью, а затем приклеены к ободам.Тело было перевязано и украшено импортным рисунком в елочку, который был тщательно заклеен лентой, чтобы удерживать его на месте, и отложен для высыхания клея.

В другом месте на двухэтажном заводе были начаты работы над другими компонентами. Шеи обрабатывались в соответствии с моделями — шейки модели 28 имели ромбовидные выточки или завитки, шеи модели 18 — нет и т. Д. — и укладывались на тележки соответственно. В конце концов, сотрудник Martin, который прошел обучение на слесаря, выбрал одну из тех грубых шеек дредноута в стиле 28 и соединил ее ласточкин хвост точно с корпусом, который был построен вокруг шейного блока 58957, после чего он нанес карандашом тот же серийный номер под пяткой. .Слесарь прижал стальную Т-образную дугу — на самом деле отрезок ложа для салазок, который в противном случае мог бы стать частью American Flyer — в ту часть шеи, которая была прорезана для ее крепления, а затем приклеила к прорези грифа.

Затем формовщик зажал гриф грибом вниз на деревянном приспособлении и вырезал его: сначала ножом, затем грубыми и тонкими рашпилями и, наконец, напильником и наждачной бумагой. Для резки алмаза использовались строгальный нож и очень острый нож для очистки овощей.Формовка была сделана с помощью небольших металлических шаблонов. Первый грубый шаблон имел ширину грифа на уровне 10 ^и ладов; После достижения этих размеров формирователь тщательно смешал профиль шеи между двумя точками. Затем он использовал другие шаблоны, чтобы создать правильную форму пятки, внутреннюю кривизну пятки шеи, окончательную форму и толщину передней бабки и так далее. В целом, на формирование шейки ушло около получаса и еще 15 минут на выточку алмаза.

Гриф был отшлифован, накладка покрыта резцом. Красное дерево было заполнено и окрашено, как и бразильский палисандр сзади и по бокам тела, за которым последовал герметик. Затем последовало лакирование, еще более тонкое шлифование, затем еще лакировка и легкое шлифование. К туловищу приклеили шею, а потом приклеили мостик из черного дерева. Наконец, чуть более чем через два месяца после того, как был составлен заказ в магазине и была поставлена ​​печать на шейном блоке, 58957 был натянут, упакован в ящик и отправлен.

Оттуда его история на какое-то время утеряна.

1935 г. Мартин D-28, серийный номер 58957. Фото Арта Дадли.

Интриги, разногласия, слухи и даже небольшая заблуждение, кажется, переплетены в истории любого великого музыкального инструмента, и так же обстоит дело с гитарой 58957, чье место в истории американской музыки теперь буквально занимает легенда. Спросите сотню людей об этой гитаре Martin, и вы получите сотню историй.Один мастер утверждает, что около 40 лет назад он заменил ему верх и шею. Торговец, чей известный магазин часто ассоциируется с гитарой, теперь отрицает, что продавал ее или даже не видел. Один музыкант, который утверждает, что играл на 58957, говорит, что это необычно тихая гитара, в то время как другой называет ее «хосс».

Вот то, что мы знаем наверняка: в 1959 году гитару купили в музыкальном магазине Лос-Анджелеса молодые музыканты мятлика Роланд и Кларенс Уайт, которые вместе со своим товарищем по группе Билли Рэем Латумом ходили по магазинам за инструментами.Отец мальчиков, Эрик Уайт-старший, брал их с собой в более ранние поездки, во время которых он покупал другие довоенные елочки, обычно не более чем по 70 долларов каждая, всегда с намерением починить их и продать за небольшую плату. скромная прибыль. (Белые продали один такой Мартин Джону Коэну из New Lost City Ramblers, который хранил его в течение нескольких лет.) Но на этот раз 15-летний Кларенс хотел D-28, который он мог бы назвать своим.

К сожалению — или к счастью, в зависимости от того, как вы смотрите на эти вещи — у Роланда и Кларенса в тот день не было много денег, и они не нашли ни одного D-28, который они могли себе позволить, ни в одном из дюжины или около того ломбардов, которые они часто посещали. .Но там, в музыкальном магазине, стоявшем в углу рядом с другими запланированными ремонтными работами, было 58957. За королевскую сумму в 25 долларов они купили «елочку» 1935 года выпуска «как есть».

Братья Уайты забрали гитару без струн домой, надеясь, что их отец сможет вернуть ее к жизни, но как только он увидел крысиного вида D-28, старший Уайт объявил это безнадежным делом. Какой-то анонимный писатель вырезал звуковое отверстие бедняги до самых центральных колец розетки, оставив отверстие диаметром почти 4 5/8 дюйма.Его оригинальная накладка на гриф полностью отсутствовала, ее временно заменили доской из черного дерева, которая крепилась к шее с помощью скотча. Накладка отслаивалась от верха, и мальчикам потребовалось совсем немного времени, чтобы уговорить ее оторваться.

На следующий день Роланд и Кларенс принесли своего Мартина мастеру Милту Оуэну, который в конечном итоге приобрел известность как «гуру ремонта гитар» Голливуда за свою работу в магазине Барни Кессела. Прогноз Оуэна был более обнадеживающим, чем у отца мальчиков.С отверстием для звука, конечно, ничего не поделаешь, но он покопался в своем мусорном ведре и нашел гриф, который подошел достаточно хорошо: белая бланк Gretsch в пластиковой обложке с 22 ладами, расстояние между которыми было основано на шкале. почти такой же, как у дредноута Мартина. Мальчики были встревожены, узнав, что ремонт будет стоить столько же, сколько они заплатили за саму гитару, но они зашли слишком далеко, чтобы повернуть назад.

Неделю спустя они забрали свой D-28, который теперь имеет набор тонких струн и звучит так, как должно.Перед тем, как они ушли, Оуэн предостерег молодых сборщиков от использования толстых струн, чтобы они не «перевернули их» и не сделали гитару непригодной для игры — что, конечно, они и сделали.

Вот еще кое-что, что мы знаем наверняка: за те годы, когда он владел и использовал теперь модифицированный Martin D-28, Кларенс Уайт изменил курс гитары мятлика.

В арсенале инструментов семьи Уайт были и другие гитары, например, Martin D-18 1952 года, который отец купил новую в магазине пианино в Лос-Анджелесе, где она хранилась почти три года.Но, несмотря на пестрый внешний вид — и несмотря на постоянно увеличивающуюся высоту струн — елочка принадлежала Кларенсу, и поэтому в умах многих она стала ассоциироваться с уровнем игры, который встречается только один раз в поколении, если что.

Это было в 1960 году, когда 9-летний исполнитель мятлика по имени Тони Райс — недавний переселенец в Южную Калифорнию и гитарист в семейной группе, как и Кларенс Уайт — заметил гитару за кулисами музыкального шоу, которое транслировалось по телевидению. местная радиостанция.

«Я впервые где-нибудь появлялась, — вспоминает Райс. «Я видел этот старый D-28, и у него не было имени на грифе, поэтому я спросил:« Что это за гитара? », И Кларенс сказал:« Это Мартин ». Я никогда не видел один такой. Я думал, что все дредноуты были Д-18! Поэтому я спросил: «Это D-18?» Он ответил: «Нет, это D-28». Я никогда не слышал о D-28. Единственное, что я знал, это то, что это выглядело адски, но для 9-летнего ребенка это звучало как миллион долларов! »

Кларенс Уайт разрешил младшему мальчику играть в елочку столько, сколько он пожелает.«Действие было настолько сильным, что было почти невозможно», — говорит Райс. Явных предзнаменований не было, но в тот день могла быть установлена ​​какая-то связь.

Братья Уайт и их коллеги продолжали свои музыкальные усилия, сначала как Country Boys, а затем как Kentucky Colonels. Игра Кларенса с этими группами была революционной, и это сделало его «елочку» на пути к тому, чтобы стать Святым Граалем гитар мятлика.

По иронии судьбы, по мере того, как репутация Кларенса Уайта росла, он все реже и реже использовал D-28 из-за его растущего разочарования в связи со снижением игровых возможностей.Печальное состояние D-28, возможно, привело к самому тупому из всех трюков тупого ребенка: в тот день, когда Кларенс прислонил гитару к дереву возле своего дома и выстрелил в нее из дробовика. Гитара по сей день носит шрам.

Ремонт, сделанный Кларенсом Уайтом после выстрела 58957 из дробовика. Фото Арта Дадли.

На самом деле, ёлочка редко оставалась вне опасности. После выступления Kentucky Colonels в Кембридже, штат Массачусетс, Кларенс случайно наехал на обоих своих Мартинов, находясь за рулем фургона группы.У D-18 было намного хуже, чем у D-28, у которого была только одна или две боковые трещины, и, поскольку полковники направлялись в Анн-Арбор, штат Мичиган, они принесли обе гитары экстраординарному мастеру по ремонту Хербу Дэвиду, который работал целый день. и ночь, чтобы вернуть их в строй. (По словам Роланда Уайта, Кларенсу больше понравился звук D-18 после неудачи : «Он сказал, что у него больше сустейна!»)

Наконец, в 1965 году гитарист и гитарист расстались. В Южной Калифорнии не хватало оплачиваемых концертов для блюграсс-групп, и Кларенс не хотел переезжать, отчасти потому, что он только что женился, а отчасти из-за новых возможностей для сессионных музыкантов — по крайней мере, сессионных музыкантов, у которых были электрогитары.Чтобы собрать достаточно денег для Fender Telecaster (и, будем надеяться, на медовый месяц), Кларенс использовал «елочку» в качестве залога для ссуды от знакомого по имени Джо Миллер.

Он и гитара никогда не воссоединятся.

Ко времени смерти Кларенса Уайта в 1973 году Тони Райс начал обретать собственный голос как гитарист. Он проработал три года в качестве заместителя Дэна Крэри в Альянсе Блуграсс, затем присоединился к влиятельному Новому Югу Дж. Д. Кроу. Играя в группе Кроу, Райс впервые поработал вместе с бывшим участником Kentucky Colonels, скрипачом (и басистом) Бобби Слоуном.

Однажды в 1975 году Райс и Слоун заговорили о Кларенсе Уайте. «Бобби рассказал мне историю о том, почему Кларенс отдал елочку Джо Миллеру», — вспоминает Райс. «И он начал рассказывать мне все больше и больше о Джо Миллере и о том, кто он такой. Раньше он играл в футбол за Калифорнийский университет в Лос-Анджелесе. Его семья владела сетью винных магазинов в Пасадене….

«И я начал думать: я никогда не встречал этого парня, но Джо Миллер просто мог бы позволить этому уйти. Вот где это действительно, очень странно: я живу в Кентукки в то время, я звоню по телефону и звоню в службу поддержки Пасадены, штат Калифорния, чтобы получить список Miller’s Liquor.И они говорят: «Да, у нас их около 20 штук. Какой вам нужен? »

Райс закатывает глаза и печально смеется над воспоминанием. «Я сказал:« Дайте мне первый номер ». Я позвонил по этому первому номеру и сказал:« Я ищу Джо Миллера ». Парень сказал:« Нет, Джо сейчас здесь нет, но он «Вернусь примерно через два часа», — перезвонил я и поговорил с ним. Я сказал: «Джо, это Тони Райс… Ты знаешь, кто я?» Он ответил, что знал. Я спросил его, есть ли у него гитара Кларенса, и он сказал: «Да, конечно.Он лежал у меня под кроватью девять лет. Не тронут ». Я сказал:« Не могли бы вы избавиться от этого? »Он сказал:« Ага, я бы хотел ».

«Это было в 1975 году», — продолжает Райс. «Итак, я думаю, Джо Миллер знает, что у него есть. Мне придется пойти в банк и уговорить банкира одолжить мне огромную сумму денег, тысячи и тысячи, чтобы получить эту гитару ». Разумеется, его владелец настоял на том, чтобы Мартин провел оценку профессионала, прежде чем он назовет свою цену.Райс согласилась с планом, и двое мужчин договорились поговорить по телефону на следующий день.

В тот же день Миллер принес Мартин в ближайший магазин скрипок, который, как выяснилось позже, был последним местом, над которым Кларенс работал. Человек в магазине скрипок предположил, что она стоит меньше, чем можно было ожидать, учитывая ее нынешнее состояние. По словам Райс, «Джо Миллер перезвонил и сказал:« Я возьму за это пять или шестьсот долларов ». Я сказал:« Вот что вам сказать: я разделю разницу.Я дам тебе 550 ». Он сказал:« Ты понял ». На следующий день я был в самолете, направлявшемся в Лос-Анджелес».

Друг-более мастер позволил Райсу одолжить его новый чемодан Mark Leaf, чтобы перевезти гитару, и сделка была совершена в аэропорту Лос-Анджелеса. «Я все ждала, когда проснусь, — с улыбкой говорит Райс. «В течение нескольких дней я думал:« Это не могло быть так просто »».

Купить легендарную елочку оказалось проще, чем играть в нее, по крайней мере, сначала. «У него было действие, как у Добро», — смеется Райс. «Хотя, я провел сеанс в тот день, когда получил его.Это было просто совпадение. [Дэвид] Грисман был в Лос-Анджелесе на записи, играя на альбоме Джеймса Тейлора Gorilla , в тот день, когда я получил гитару. Итак, Грисман приехал в аэропорт, взял меня и отвез в студию. Я взял гитару только час назад!

«Я открыл футляр и начал дурачиться с ним, хотя действие было таким», — говорит Райс, разводя большой и указательный пальцы на полдюйма друг от друга. «И Кейт и Анна МакГарригл были там, записывая этот альбом для Warner Bros.Я был в холле студии, возился, просто копался в тоне. Но Грисман и продюсер вышли послушать, как я возился с этим, и сказали: «Эй, чувак, мы должны пригласить тебя на это! Мы должны попросить тебя сыграть на паре этих треков! »И я подумал:« Ну, хорошо, но это единственный инструмент, который у меня есть ». Кларенс. Иди и сделай это! »

Насколько известно, гриф 58957 был удален только однажды: мастером Рэнди Вудом, который сделал сброс вскоре после того, как Тони Райс купил гитару.Как иногда случается, через год или два после перезагрузки действие начало постепенно возвращаться к жизни — к тому времени Райс уже жила в Калифорнии и работала с Дэвидом Грисманом. Другой член квинтета, скрипач Дарол Энгер, познакомил Райс с Ричардом Гувером, бывшим партнером Энгера (вместе с Дэвидом Морсом) по проекту создания мандолин. Когда он еще работал мастером, Энгер укрепил изношенную пластину кленового моста на елочке Райса тонкой накладкой из черного дерева, которая остается на месте по сей день.Среди прочего, Гувер выполнил то, что Райс называет «сбросом настроек».

Нижние высокие частоты (и басы) 58957 имеют несколько интересный и немного грубый ремонт, где «елочка» была повреждена и залатана. Фото: Art Dudley

«Сегодня я бы и не мечтал сделать это, не сняв шею», — говорит Гувер. «Но в то время, когда я это сделал, объем знаний был гораздо более ограниченным. На самом деле, в то время было очень мало людей, которые понимали проблему, не говоря уже о том, как ее исправить.В то время Мартин все еще снимал лады, строгал гриф, брил мост… пытался создать геометрию, чтобы добиться надлежащего игрового качества. И то, что я сделал, я научился, создавая скрипку. Техника называлась «скольжение спины», при которой застежка немного отодвигалась, спина отделялась от шейного блока, а затем с помощью ремня вы натягивали шею под нужным углом — затем прикрепляли спину к блоку, обрезая избыток и снова наденьте переплет.

«Ужасно думать об этом сейчас, на такой бесценной гитаре, — добавляет Гувер со смехом.«Но в то время это не была бесценная гитара: это был действительно вонючий, модифицированный старый Martin! Он еще не снискал себе славы! »

В 1976 году Ричард Гувер стал соучредителем компании Santa Cruz Guitar Company и продолжил создавать различные воплощения другой известной гитары Тони Райса. (Совершенно новый нестандартный дредноут находится в разработке, используя древесину из того же резерва, который использовался для гитары SCGC, которую Райс использовал в течение последних семи лет.) До этого Hoover выполнил еще несколько ремонтов 58957.«Мы заменили гайку, которая, я думаю, все еще там, — вспоминает он, — и в нижней части упора с правой стороны, когда вы смотрите на гитару, была трещина, которую я исправил для него. И мы сделали частичный рефрет — который в наши дни тоже редко делают — и рефретировали, вероятно, первые пять-семь ладов ». Гувер добавляет, что они установили лады, используя традиционный метод забивания. «Во многом мой подход к ремонтным работам, даже в то время, основывался на моем обучении искусству и реставрации музеев: не делайте ничего, что нельзя было бы переделать позже с помощью более совершенных технологий.Поэтому маловероятно, что мы будем использовать какой-либо клей ».

В целом, некоторые из лучших имен в лютерии и акустической музыке были связаны со знаменитым D-28. Стержни моста, смоделированные по образцу собственной конструкции Кларенса Уайта, были изготовлены строителем Эрвином Сомоги. Когда понадобился новый мост, покойный Майк Лонгворт из C.F. Мартин вручную выбрал новую старую заготовку, которую установил знаменитый мастер и автор Хидео Камимото — и проделал буквально безупречную работу, заполнив существующую прорезь для седла черным деревом, а затем вырезав новую, что обеспечило более точную интонацию.Друг и коллега-музыкант Тодд Филлипс добавил черные маркеры положения к белой окантовке на басовой стороне грифа. (Интересно, что он следовал старинному обычаю ставить точку на 10 ^{-м ладу} , а не на девятом.)

Гарри Спаркс из Цинциннати сделал один из самых важных вкладов, однако тихо. В марте 1993 года Тони и Пэм Райс жили в Кристал-Ривер, Флорида — не только у воды, но и прямо у кромки воды, — когда тропический шторм обрушился на побережье Мексиканского залива.Их разбудили посреди ночи сотрудники службы экстренной помощи, которые настаивали на немедленной эвакуации, не имея даже времени на то, чтобы собрать личные вещи. Когда несколько часов спустя взошло солнце, Райс умоляла соседа забрать Мартин из его затопленного дома.

Этого воспоминания достаточно, чтобы изменить тон разговора: «Ага. Кристал-Ривер, Флорида. Он находился под водой не менее полутора часов, полностью погруженный в воду. Скорее часа два. В этом случае. Но корпус не был водонепроницаемым.Так что он был полностью насыщен. И это было действительно хреново. И по крайней мере пять лет он не звучал так, как он сам.

«Гарри Спаркс прилетел из Цинциннати и взял его под свое крыло. Медленно высушил. Нельзя просто воткнуть это в духовку; вам нужно было медленно высушить его, иначе вы рискуете потрескаться, что в любом случае произошло. Он треснул в нескольких местах на спине. Большая часть распорок в нем ослабла — подпорки спины ».

Однако настроение Райса улучшается, когда он вспоминает об услугах мастера и друга Снаффи Смита, который живет примерно в 45 минутах от него в Кинге, Северная Каролина.«Я знала, что с D-28 не происходило ни черта, что нельзя было бы починить», — говорит Райс. «А затем, несколько лет назад, Снаффи отрегулировал все внутренние распорки спины и пару верхних распорок».

Снаффи Смит, в свою очередь, вспоминает, как Райс был благодарен за то, что «елочка» вернула ее былую славу. «Он позвонил мне после того, как это произошло, — говорит Смит, — и сказал, что он больше не может играть в эту игру в подвале: он боялся, что она сломает фундамент там! Регулировка брекетов действительно увеличила объем.”

За те 10 лет, что Снаффи Смит ухаживал за D-28, он выполнил на нем множество работ. Он сделал пару ладов, которые приклеил для стабильности. Он оставляет прорези для ладов достаточно узкими, так что использование больших ладов в отдельных частях грифа все еще может сжать древесину в достаточной степени, чтобы добавить задний смычок там, где это необходимо. Смит также изменил форму оригинального костяного седла Камимото.

Самая нервная работа из всех произошла сравнительно недавно, когда Смиту пришлось заменить одну из оригинальных верхних скоб.«Там была скоба, которая была разрезана почти пополам, — говорит он, — в самой передней части звукового отверстия, прямо под грифом. Давным-давно кто-то поместил туда пикап или что-то в этом роде, и скоба прогнулась. И Тони сказал: «Я смотрел на это 25 лет и всегда думал об этом…»

«Дик Боак из компании Martin прислал мне три подтяжки, из которых я мог выбрать. Все они были старыми, и мы с Тони выбрали одного, который изначально собирался использовать для D-18 41 года. Я взял и отколол один маленький кусочек ленты с одной стороны, и таким образом мне удалось вытащить старую скобу.Я опустил его с той стороны и фактически вытащил с другой стороны, где находится лента.

«Я так и сделал, достал старую, обрезал дубликат и оставил немного лишнего для лука. И когда я вставил его обратно, я смог вставить один конец в отверстие, из которого он выходил, и продвинуть его туда, где я вытащил этот чип ». При этом Смит более или менее одновременно смеется и вздыхает. «Я приклеил его туда, затем я приклеил чип обратно, и… ну, мне повезло, и я получил чип обратно в точности так, как он вышел! Вы не можете этого сказать! Тони просидел здесь час с зеркалом и сказал: «Ты никогда не сможешь этого вытащить! Как у вас это получилось? »

«Время от времени вы делаете что-то подобное, и это получается очень хорошо.”

Сам Райс с удовольствием отмечает еще один недавний триумф Снаффи Смита. Если вы посмотрите внимательно, то тюнинг-машина для шестой струны выглядит иначе, чем другие, предполагая, что она была заменена в какой-то момент. Кроме того, отделка тюнера третьей струны указывает на то, что он также был заменен. «Странный вариант, который мы с Снаффи собрали в качестве быстрого решения около четырех или пяти месяцев назад», — говорит Райс. «История с машинами состоит в том, что они оригинальные, за исключением одной, которая была там, когда она была у Кларенса, которая была Kluson — у него был закрытый Kluson в качестве третьей струны.

«После того, как я получил гитару, она все еще была там, и Фрэнк Форд из Пало-Альто предоставил мне тюнер для третьей струны, который он нашел в качестве замены, который был идентичен оригиналу. Итак, Фрэнк Форд поставил третьего. Затем, месяца четыре или пять назад, тюнер шестой струны — нижняя миа — наконец сдался. Червячную передачу и шестерню просто сняли. Снаффи нашел старую ручку Гровера и червячную передачу в сборе, поэтому он сконструировал новую настройку из частей. Это вроде работает! »

Со своей стороны Снаффи Смит говорит, что на гитаре вроде этой никогда не бывает работы: «Мы вечно что-то делаем; это почти бесконечная вещь….К счастью, над Тони поработали несколько хороших людей. Так мне стало намного проще ».

Следующий проект? Райс указывает на накидку черепахового цвета, которую фанат подарил ему во время тура по Японии в 1985 году. Это замечательно красиво; его линии предполагают движение, даже когда гитара совершенно неподвижна. «Я собираюсь снять его и снова надеть», — говорит он. «Парень, который его надевал, раньше работал на Мартина. В то время я был во Флориде. Он проделал неплохую работу, но могло быть и лучше.Эту накладку нужно снять, разбавить и снова надеть ».

Затем Райс использует большой и средний пальцы одной руки, чтобы охватить гайку: «Ширина гайки с головкой, ширина шейки прямо здесь, вероятно, будет изменена, и достаточно скоро. Я попрошу Снаффи снять переплет при следующем повторном натяжении, расширить его парой микрополосков эбенового дерева — вероятно, около 32 ^и дюйма — и снова наложить переплет, прежде чем он вставит лады. . »

После этого Райс протягивает мне гитару: «Почему ты не придираешься к этому какое-то время?»

Моя первая реакция на то, что я действительно держу в руках 58957, вызывает удивление: как может гитара с корпусом из розового дерева так мало весить? Моя вторая — краткая вспышка тревоги — что-то вышло из строя! — пока я не вспомню статью, которую где-то читал.

«Тони, я слышу гремучую погремушку?»

«Ага», — отвечает он. «Их там должно быть двое».

Представьте себе автомобиль, в котором педаль под вашей ногой и мотор под капотом соединяются с помощью короткого прямого куска стали. Дело не в том, что вещь все время идет быстро — хотя нет сомнений в том, что она обладает огромной мощностью в резерве — а скорее в том, что она мгновенно реагирует на каждую крайность вашего воображения.

Будучи энтузиастом автомобилей, Райс повторяет мои невысказанные мысли из соседней комнаты: «Это, наверное, как поиграть в Ferrari, сразу после того, как проехал несколько Volkswagen!» — предлагает он со смешком.»Это похоже на то, как будто он играет сам». Черт, да!

Ряд людей, которые слышали его вблизи, описали необычайно хороший баланс у «елочки» — каждая нота в ее диапазоне имеет одинаковую выраженность и выступ. Это правда, но это еще не все. С каждым аккордом или струной нот вы не думаете о низких или высоких частотах. Просто невозможно удержаться от впечатления, почти ошеломления от богатого, сложного и в целом потрясающего тона, который исходит из глубины этой коробки.

Фото: Art Dudley

По большей части каждый дредноут Martin в чем-то впечатляет. Но 58957 находится в другом самолете. Это не самый громкий из всех D-28 — хотя у него более широкий динамический диапазон, чем у большинства — и он не имеет самых глубоких минимумов или самых высоких максимумов, но он самый выразительный. Он поет голосом, который просто невозможно игнорировать.

Это также очень играбельно в его нынешнем состоянии. Чтобы удовлетворить мою внутреннюю слабость, и с одобрения Райс, я сделал несколько измерений — отметив высоту струны всего лишь на оттенок более 6/64 дюйма для нижней ми, измеренной на 12 ладу и чуть более 4/64. »На высоте E.Ширина грифа у гайки составляет всего 1 5/8 дюйма, при этом прорези для струн на удивление низкие, особенно со стороны высоких частот. (Доказательством работы Снаффи Смита по настройке является то, что гитара просто не гудит — если только вы действительно не сходите с ума от этого.) При измерении от центра штифта бриджа шестой струны до центра первой струны разброс струны составляет ровно 2 1 / 8 ”- идеально подходит для такого игрока, как Тони Райс, чьи руки ни на йоту не увеличены. Мост Хидео Камимото имеет размеры точно в соответствии со спецификациями Martin, хотя его высота переднего края всего лишь на оттенок ниже, чем у некоторых, — 19/64 дюйма.Другой миф гласит, что тело елочки имеет немного меньшую глубину, чем в среднем, но это не так; во всяком случае, это немного глубже, чем в среднем, как на шейном, так и на концевом блоке.

Я спрашиваю Тони Райса: «Вы когда-нибудь слышали плоскую гитару, которая приближается к этой?» Ему нужно время, чтобы задуматься. «Да, — говорит он, — есть гитара, которая очень похожа на нее: [Норман] Блейк 34 года. Он продал его много лет назад [известному японскому коллекционеру инструментов] Мак Ясуда ».

Еще одна долгая пауза: «Да, чтобы ответить на вопрос, их пара.Второй любимый D-28, в который я когда-либо играл, — это Блейка 34 года. И, вероятно, третьей была «елочка» Эрика Томпсона. Это либо ’40, либо ’41. Это те два, что приходят на ум ».

Райс забирает елочку и мягко говорит: «Она все еще здесь».

«Я не могу сейчас играть, — говорит он. «Я еще даже не разогрелся!» Но он все равно играет — с текучестью техники и воображением, которые другие сборщики пытались воспроизвести в течение 30 лет. Он играет фразу, которая охватывает с седьмого по 12 ^-го ладов: «Здесь, наверху, эта гитара действительно поет», — предлагает он, прежде чем запустить серию аккордов и строк, которые трансформируются в «Summertime.”

Десять минут спустя 58957 возвращается в своем довольно новом корпусе из углеродного волокна, простой кожаный ремешок все еще прикреплен к штифтам и накрыт струнами. Райс глубоко вздыхает, прежде чем закрыть крышку: «Это прекрасный инструмент. Я никогда не беру его в руки, но я так не думаю. Это должен быть Святой Грааль.

Примечание редактора: эта статья изначально была опубликована в Fretboard Journal # 5. Чтобы увидеть дополнительные истории и видео, посвященные винтажным (и новым) Мартинам, щелкните здесь.

лошадиных сил. Какой двигатель на ладу x ray cross

На внутреннем рынке новая лада появилась в четырех возможных комплектациях, две из которых получаются при покупке дополнительных пакетов опций. Однако АвтоВАЗ на этом не остановился и решил расширить модельный ряд, представив три варианта двигателей Lada x Rey Cross. Таким образом, благодаря различным вариантам моторов на ладовой рентгенограмме получилось семь возможных комбинаций модели.Давайте разберемся, какие двигатели АвтоВАЗ устанавливает на ладу x Rey и его версию Cross.

Двигатель ВАЗ-21129

Бюджетная модель рентгеновских ладов, как и Lada Vesta, получила отечественный двигатель ВАЗ 21129. Этот двигатель на x Ray сумел показать себя лучше на более ранних моделях. Однако именно для xRay установлено значение optima.

• Рабочий объем — 1597 см3
• Привод ГРМ — ремень
• Диаметр цилиндра — 82 мм
• Ход поршня — 75,6 мм
• Мощность л.с. / кВт — 106/78 при 5800 об / мин
• Крутящий момент — 148 Нм при 4200 об / мин
• Максимальная скорость — 170 километров в час
• Разгон до первой сотни — 11.9 секунд
• Расход топлива по городу — 8,5 л
• Расход топлива смешанный — 7,3 л
• Расход топлива по трассе — 5,7 л

В связи с повышенным коэффициентом надежности этот мотор долгое время использовался производителем на различных моделях ладов. Мотор имеет хороший ресурс и практически не нуждается в ремонте , так как проблемы с ним возникают довольно редко. Но его мощности недостаточно для тяжелой машины.

С 1.6-литровый двигатель Lada x Ray Cross, номинальная мощность составляла 106 лошадиных сил. Он имеет 16 поршневых клапанов, что обеспечивает более высокий уровень производительности по сравнению с его аналогом с 8 поршневыми клапанами. Мотор в рентгене расходует топливо быстрее, чем остальные варианты. Показатель на 100 километров при смешанной манере езды составляет 7,5 литра, что может негативно сказаться на выборе будущего автовладельца.

Самый слабый двигатель Lada xRay Cross, способный разогнать машину до сотни за 11.9 секунд. Причем его максимальная скорость составит 170 км / ч. Для такого хэтчбека это довольно низкий показатель, который не позволит почувствовать необходимую динамику.

Этот мотор работает в паре с французской 5-ступенчатой ​​механической коробкой передач, используемой на Renault Logan второго поколения. В отличие от своего российского аналога, он серьезно снижает уровень шума при работе и является огромным преимуществом для данной модели.

Двигатель Nissan h5Mk

Верхний уровень линейки xRay Cross — двигатель h5Mk.Это дизайн Nissan, который широко использовался в Lada Vesta. Как и предыдущая версия, он работает в паре с французской механической коробкой передач. Это решение положительно сказалось на динамических качествах автомобиля. Раньше этот двигатель устанавливался с комплектацией Lada xRay top и на данный момент присутствует только на юбилейных автомобилях.

• Рабочий объем — 1598 см3
• Количество цилиндров / клапанов — 4/16
• Привод ГРМ — цепной
• Диаметр цилиндра — 78 мм
• Ход поршня — 83.6 мм
• Мощность л.с. / кВт — 110/81 при 6000 об / мин
• Крутящий момент — 156 Нм при 4000 об / мин
• Максимальная скорость — 171 километр в час
• Разгон до первой сотни — 10,3 секунды
• Расход топлива — н / д

Этот двигатель имеет объем 1,6 л и 16 поршневых клапанов. На разных автомобилях показатель мощности этого двигателя варьируется от 114 до 118 лошадиных сил, однако, чтобы адаптировать машину к реалиям наших дорог, показатель мощности снижен до 110 лошадиных сил.

Двигатель придал кроссоверу более серьезную динамику, что особенно полезно на трассе при обгонах. Разгон до сотни самый высокий в линейке и составляет 10,3 секунды, но максимальная скорость увеличилась незначительно, всего до 171 км / ч. Расход топлива на рентгене с этим силовым агрегатом составил 6,9 литра, что было самым низким показателем во всей линейке.

Двигатель ВАЗ-21179

Причина того, что флагманская комплектация x ray имеет меньшую разгонную динамику, — роботизированная 5-ступенчатая коробка передач.Этот недостаток можно уменьшить, используя ручное переключение передач. Но у автоматических трансмиссий есть свои преимущества, так как расход топлива снижается до 7,1 литра на 100 километров при смешанном стиле вождения.

Силовые агрегаты ВАЗ 21179 и Х5Мк применяются в комплектациях Престиж, Топ и Комфорт. Исключением стала бюджетная версия автомобиля.

Какой двигатель лучше всего на Лада х Рэй Кросс?

Двигатель 21129 используется в базовой комплектации нового лада и имеет значительно меньшие характеристики по сравнению с ВАЗ-21179.Особенно индикатор экономии топлива.

Специалисты советуют присмотреться к более дорогим вариантам xRay. Ведь, заплатив 39000 рублей, можно в долгосрочной перспективе неплохо сэкономить. Если машину активно эксплуатировать, то эти затраты окупаются еще быстрее. Также намного приятнее водить более динамичную модель автомобиля.

Любителям механики стоит обратить внимание на 122-сильный мотор, здесь доплата с бюджетной версии составит 64000 рублей. Но в эту стоимость входит не только более мощный двигатель и АКПП, но и более богатый функционал мультимедийных систем.Также ожидается, что именно этот силовой агрегат будет установлен на бюджетную версию полноприводной Lada XRay Cross.

Универсал Лада Веста SW Cross

Новый автомобиль российского производства «Лада Икс Рей» выпускается с тремя вариантами двигателей. Среди которых можно будет выбрать как мощный двигатель, предназначенный для повышения скоростных характеристик и проходимости автомобиля, так и более экономичные варианты с меньшими показателями мощности для людей, предпочитающих двигатель с низким расходом топлива под капот.

В арсенале новых ДВС 106, 110 и 122 л.с. И устанавливаются они в зависимости от комплектации Lada Xray. Двигатели АвтоВАЗа, устанавливаемые на Lada Iks Rey, выполнены с соблюдением европейских стандартов качества и максимально безопасны для окружающей среды. Каждый агрегат имеет индивидуальные особенности и определенные технические характеристики, о которых будет сказано далее по тексту.

Возможные варианты ДВС для Lada X Rey

Lada X Rey имеет три двигателя , которые предлагаются покупателям на выбор:

• ВАЗ-21129 — эта версия используется в базовой версии Lada X Rey и имеет мощность 106 лошадей;
• HR16DE — двигатель зарубежных партнеров, надежен, имеет мощность 110 л.с.
• ВАЗ 21179 — самый мощный двигатель из тех, что устанавливаются на Lada Xray, он имеет 122 л.с.

Все двигатели, которые устанавливаются на Lada X Ray, работают на бензине, причем самая мощная версия ВАЗ имеет специальную автоматическую механическую коробку передач ВАЗ.

Двигатель ВАЗ-21129

Этот двигатель, предназначенный для установки на Lada Xray, отличается от аналогов специальной системой впуска. При его работе на малых оборотах воздух подается иначе — через вытянутые впускные каналы. В случае увеличения скорости воздух начинает течь по коротким каналам.В результате меняется состав и консистенция топливной смеси, в первом случае она плохо насыщена кислородом, а во втором — наоборот. Такой принцип работы позволяет значительно увеличить мощность агрегата при относительно небольшом расходе топлива. При отсутствии такой системы аналогичный аппарат выдает не более 98 лошадей.

Этот двигатель для Lada X Rey будет производиться только в тандеме с 5-ступенчатой ​​коробкой передач Renault. Силовой агрегат ВАЗ-21129 имеет следующие характеристики:

объем
• — 1597 кубических сантиметров;
• баллонов в количестве 4 шт .;
• 16 клапанов;
• ременная передача;
• цилиндр имеет диаметр 82 миллиметра;
• мощность — 106 л.с.

Lada Iks Rey, оснащенная таким двигателем, способна набирать скорость до ста км / ч за 11.9 секунд. При таких параметрах машина чрезвычайно экономична. Циклов и расход топлива:

В то же время Lada X Rey в сочетании с этим двигателем способна развивать скорость до 170 км / ч.

HR16DE и его особенности

Этот двигатель, который можно получить с новой Lada X Ray, имеет такой же объем — 1,6 литра. Но при аналогичном объеме он имеет большую мощность, которая составляет 110 лошадиных сил. HR16DE был разработан для российского автомобиля дружественным концерном Renault-Nissan. Он успел зарекомендовать себя на некоторых моделях этих производителей и широко известен во всем мире.Поэтому можно с уверенностью сказать, что у Lada Xray агрегат мирового уровня. Новый двигатель имеет ряд принципиальных отличий по отношению к приборам ВАЗ, которые комплектуются чугунными блоками и обычными ремнями. Агрегат имеет отличную репутацию и многообещающие характеристики. Однако время покажет, какой вариант лучше.

HR16 комплектуется алюминиевым блоком цилиндров. Головка блока цилиндров изготовлена ​​из алюминиевого сплава. Вместо ремня ГРМ у этого устройства более прочная и долговечная металлическая цепь.Двигатель выполнен без гидрокомпенсаторов, но вместе с тем снабжен системой изменения фаз газораспределения. На каждый цилиндр распределяется по две форсунки.

На автомобиль Lada Iks Rey двигатель HR16 устанавливается в паре с французской коробкой передач от Renault. По отзывам автолюбителей можно сделать вывод, что HR16 имеет отличную динамику и работает безотказно. Характеристики двигателя:

• объем — 1598 см3;
• имеет 4 цилиндра, 16 клапанов;
• вместо ремня ГРМ используется цепь;
• цилиндр имеет диаметр 78 миллиметров;
• мощность — 110 л.с.

Чтобы с нуля набрать скорость в сотню км / ч, Lada Xray потратит 10.3 секунды. А максимальная скорость составляет 171 км / ч.

ВАЗ-21179

Самый мощный двигатель для Lada Xray был произведен непосредственно на АвтоВАЗе. Обладает прекрасными техническими характеристиками и сочетается с роботизированной коробкой передач. Для Lada Iks Rey этот агрегат был разработан филиалом АвтоВАЗа под названием «СуперАвто».

Больший объем в этом двигателе достигается за счет увеличения хода самого поршня, а не за счет расточки блока цилиндров, как это делалось ранее.Изменены размеры шатунов и коленвала. В сборке мотора используются импортные графитовые поршни известной марки Federal-Mogul.

Этот новый двигатель, используемый в Lada Xray, имеет меньше мелких деталей, что увеличивает его надежность и производительность без снижения производительности. Агрегат обладает внушительным крутящим моментом. Lada Xray с таким двигателем потребляет значительно меньше масла. Двигатель ВАЗ 21179 для Lada Xray имеет следующие технические характеристики:

объем
• — 1797 кубических сантиметров;
• 4 цилиндра / 16 клапанов;
• ременной привод ГРМ;
• цилиндр D — 84 мм;
• Мощность — 122 л.с.

С такими параметрами ДВС Lada Xray будет развивать макс.Скорость 182 км / ч. Автомобиль разгонится до сотни всего за 10 секунд. Расход топлива в зависимости от ездового цикла:

Lada Xray с таким двигателем будет обладать отличными скоростными качествами, но при этом позволит сэкономить на топливе.

22.02.2017

Lada X Ray (Лада X Ray) — небольшой кроссовер от АвтоВАЗа, созданный на платформе B0 (Renault Duster, Sandero и др.) И выпускаемый с 2016 года. Этот автомобиль, несмотря на внешний вид небольшого джипа, имеет переднюю часть. -колесная подвеска.Цель Lada X Ray — завоевать часть рынка в достаточно известном и растущем сегменте малогабаритных кроссоверов.

Lada Конкуренты Lada X Ray: Renault Duster / Sandero, Nissan Terrano, Hyundai Creta, Cherry Tiggo, Great Wall M4, Geely MR Cross и другие подобные внедорожники.

Как и все последние модели из Тольятти, «Рентген» получил новейший мотор. Фактически на автомобиль установлено 2 мотора — первый от Лада Веста, агрегат 21129 объемом 1,6 л. Второй — с двигателем Nissan HR16 (h5M), более дорогой вариант, но объем такой же, как на Русский 1.6-литровый двигатель. Более тяговитые Lada X Ray комплектуются двигателями 21179 объемом 1,8 л, мощность которых достигает 122 л.с.

сайт расскажет о моторах X Ray, чем они выделяются, расскажет об основных трудностях в обслуживании и о предпосылках возникновения различных проблем. И, конечно же, о технических свойствах, ресурсе, требуемом масле и периодичности замены. Коснемся темы настройки мотора, как увеличить мощность без снижения ресурса мотора.

Двигатель 21179:

В моторе полностью использован блок цилиндров от Priora 21126, высотой 197,1 мм, с немного улучшенной системой охлаждения и масляным каналом для фазовращателя. Поставлялись поршни — 82 мм и высотой 26,7 мм, коленчатый вал с ходом поршня 84 мм, шатуны 128 мм. Вес шатунов и поршней примерно такой же, как у 126-го двигателя.
Собрав мотор с этими деталями, удалось получить рабочий объем 1.8 литров.
Сверху установлена ​​доработанная ГБЦ 21126, установлена ​​новая прокладка. Впервые на впускном распредвале была применена система изменения фаз газораспределения. Диапазон регулировки 30 градусов, сами распредвалы полые, легкие. Установлены увеличенные впускные и выпускные клапаны, диаметр впуска 31 мм, выпуска 28 мм, диаметр ног уменьшен до 5 мм. Эта головка получила улучшенное охлаждение, доработанные каналы с клапанными пружинами.

Блок управления двигателем поменяли на М86, поставили электронную дроссельную заслонку, рабочие форсунки, доработанный масляный насос, доработанный поддон картера, конечно — новый насос и выпускной коллектор.В двигателе 21179 используется обычный пластиковый впускной коллектор без изменения длины.
Все эти инженерные изменения добавили увеличения мощности и крутящего момента во всем диапазоне — 122 л.с. при 6050 об / мин, крутящий момент 170 при 3750 об / мин.
В ремне ГРМ используется зубчатый ремень; замена ремня желательна примерно каждые 90 тыс. км.
Двигатель 21179 при обрыве ремня гнет клапана, как и у других последних моторов АвтоВАЗа: 21127, 21129 и др. К сожалению, в связи с небольшим пробегом автомобилей с новым двигателем, информации по критическим вопросам у нас пока нет.Но редакция сайта внимательно следит за этим движком и обязательно добавит информацию по получении.

Renault-Nissan h5M-HR16DE двигатель:

Это эволюция раннего K4M. Двигатель отличный, к бензину требовательнее, рекомендуется заливать 95 бензин. В системе ГРМ используется достаточно надежная цепь, и раннее растяжение не помешает. Система изменения фаз газораспределения, на впускном валу установлен фазовращатель, используется дроссельная заслонка с электронным управлением, но зазоры клапанов нужно регулировать, гидролифтеров нет.Зазоры регулируются подбором толкателя один раз в 80-100 тыс. Км. Шум и стук двигателя — главный признак скорой езды на регулировку.

Данный двигатель прошел модернизацию, были заменены распредвалы, теперь установлены по две форсунки на каждый цилиндр, увеличилась экономия топлива, немного увеличилась мощность, уменьшились обороты холостого хода, двигатель стал соответствовать требованиям Евро 5 и др., менее значимые, трансформации.

Неисправности и способы ремонта на HR16DE-Н4М:

1.Свист двигателя. Необходимо подтянуть или заменить ремень генератора.

2. Двигатель глохнет. Проблема скорее всего в реле блока генератора. При такой неисправности есть риск остановки посреди дороги. Проблема решается заказом нового реле блока зажигания.

3. Прогорание кольца выхлопной трубы. Как правило, при разгоне на средних оборотах слышен более зловещий звук. Смените пэд, и вы сможете наслаждаться тишиной.

4.Вибрация двигателя. Обычно это симптом надвигающейся кончины правой подушки двигателя HR16DE-h5M. Замена решит все проблемы.

К тому же двигатель HR16DE-h5M плохо заводится и глохнет на морозе от -15 С, можно свечи поменять, но в целом это такая неприятная особенность двигателя. Поэтому лучше всего поставить подогреватель двигателя типа Вебасто.

: популярным способом увеличения мощности является настройка микросхемы. Чип-тюнинг HR16DE принципиально ничего не изменит, прибавка не более ~ 5%, обычно это самовнушение и реальной пользы на этом движке нет.Для более значительного прибавки понадобится выпускной коллектор 4-2-1 и прямоточная вытяжка, на 2-х дюймовой трубе совмещаем забор холодного воздуха с прошивкой. В любом случае это не даст большого прироста до максимума 125 л.с., можно конечно поставить наддув и дальше, но это приведет к уменьшению ресурса.

Двигатель 21129:

Это модифицированная версия двигателя 21127. Он комплектуется чугунным блоком цилиндров как у 27-го двигателя, шатунами 133 мм, поршнями 82 мм, коленчатым валом с ходом поршня 75.6 мм. Конечно, под X Ray были изменены опоры двигателя 129.
ГБЦ полностью от 21127 с полным соблюдением регулировок впускных коллекторов.
Основные отличия двигателя ВАЗ 21129 от 21127: изменена система подачи воздуха, настроена выхлопная система на Евро-5, в результате диаметр выхлопа составил 40 мм, добавлен новый блок управления.
Все эти изменения позволили повысить экологические данные до Евро-5 и не потерять мощность — 106 л.с., как на двигателе предыдущей модификации.

По ощущениям многих владельцев мотор стал ездить снизу лучше, чем обычный 126 движок, на верхних оборотах изменения несущественные.

21129 проблемы и неисправности двигателя:

1. Двигатель 21129 гнет клапан при обрыве ремня, поэтому лучше первые 90 тыс км поменять ремень. По остальным характеристикам это тот же приоровский двигатель.
2. Двигатель троит. Необходимо промыть форсунки, проверить свечи зажигания или катушку зажигания, а также измерить компрессию, чтобы исключить проблему перегорания клапана.
3. Частота вращения двигателя плавающая и двигатель работает неравномерно, обычная болезнь 16-ти клапанных двигателей от ВАЗ. Почистите дроссельную заслонку, вполне вероятно, что датчик положения дроссельной заслонки почти сдох, и, возможно, также вышла из строя регулировка холостого хода.
4. Не нагревается до рабочей температуры. Проблемы в термостате или слишком сильные морозы, тогда на решетку радиатора нужно использовать старые картонные коробки. Да, к сожалению, это чуть ли не единственный способ согреться, автоматических жалюзи с завода нет.
5. Двигатель не запускается. Проблема, скорее всего, в стартере, катушке зажигания, свечах зажигания, бензонасосе, топливном фильтре или регуляторе давления топлива.
6. Двигатель шумит или стучит. Это происходит довольно часто на всех двигателях Lada. Проблема в гидроподъемниках, может стукнуть шатун и коренные подшипники, к сожалению это уже серьезно!

Выделите его и нажмите Ctrl + Enter

Kia намерена поднять популярность своих электрических моделей, а потому вместе с Soul EV и e-Niro в продаже может появиться электрооборудование кроссовера Kia Seltos.Только недавно его представили поклонникам марки.

Корейские СМИ сообщили, что внедорожник оснастят электроприводом, он получит силовой агрегат мощностью 201 л.с. и аккумулятор на 64 кВт / ч. На одном заряде Soul EV сможет проехать 452 километра, в режиме WLTP — 485 километров.

Электромобиль поступит в продажу сразу в двух комплектациях, одна из которых будет оснащена аккумулятором на 39,2 кВтч, двигателем мощностью 134 л.с. и запасом хода 277–312 километров соответственно.

В отчете производителя указано, что электрический кроссовер не выйдет из Азии, поэтому ожидать его в Европе и США не стоит. Производство электрической версии модели должно начаться в конце лета будущего года.

Toyota Land Cruiser 200 выпускается с 2007 года. Это настоящий старожил рынка. И дело здесь не в том, что он стоит на конвейере 12 лет, а в том, что он при этом лидер сегмента, потому что продажи с каждым годом только растут.

И все это связано с тем, что брутальный японский внедорожник постоянно совершенствуется и модернизируется, а также пополняется новыми версиями. И один из последних Land Cruiser 200 TRD. Чем интересна эта машина? Может ли это стать новым конкурентом GLS 63 AMG или X7M?

Что такое TRD? TRD означает Toyota Racing Development. Это специальное подразделение марки, которое занимается доводкой автомобилей. Это как AMG или M Perfomance.Но есть некоторые отличия.

Дизайн на первом месте. Какие обвесы не устанавливались на Land Cruiser 200. Сначала это были проекты от известного тюнингового ателье, но теперь Toyota периодически выпускает новые версии самостоятельно. А последняя версия — Land Cruiser 200 TRD.

В первую очередь автомобиль отличается от гражданской версии спортивным обвесом. Здесь и передний бампер очень массивный, а в задних свесах большие.Все это ухудшает проходимость. Все остальные детали кузова точно такие же, как у гражданской версии. По стилю обвес напоминает версию Executive Lounge, но имеет более острые края и шильдики TRD. Логотип TRD размещен на пятой двери и решетке радиатора.

Интерьер. В салоне изменилась только кнопка запуска двигателя, больше здесь ничего нового. Единственное, что стало немного больше изделий из натуральной кожи. В остальном все идентично стандартным версиям.Внутри японского рамного внедорожника традиционно просторно, комфортно и уютно. Эргономика на высшем уровне. Если только уровень мультимедиа не разочаровывает. Такие деньги могли бы улучшить ситуацию. Но зато есть камеры кругового обзора, поэтому видимость здесь идеальная. А водительское положение высокое за счет наличия рамы.

Двигатель и ходовые качества. В спецверсии ничего не меняли. Автомобиль укомплектован такими же двигателями: 4.Дизель 5 л, 249 л.с., бензин 4,6 л, 309 л. И надо сказать, что машина едет очень бодро.

Сравнивать этот внедорожник с рамой и задней осью с Mercedes-Benz или BMW просто бессмысленно. Но есть одно но. В версии TRD автомобиль серийно оснащается адаптивной подвеской. Также можно установить величину дорожного просвета. Это очень удобно. Из всех двигателей Land Cruiser 200 стоит отметить только один недостаток. Они очень прожорливы. Если вы водите машину с дизельным двигателем, вы без проблем сможете достичь расхода топлива в 17-19 литров дизельного топлива на 100 км пути.

Вождение по бездорожью. Здесь внедорожник проявляет себя во всей красе. Также есть гидропневматическая подвеска, система KDSS и Crawl Control. Также можно заблокировать задний мост. Особенно на бездорожье помогают камеры кругового обзора. А для большей безопасности вы можете отключить подушки безопасности. На бездорожье это необходимо. В этом Land Cruiser 200 лучший. И все это знают.

Двигатель — это сердце автомобиля, его темперамент и страсть. От того, какой двигатель установлен на автомобиле, зависят не только скоростные и «силовые» характеристики автомобиля, но и темперамент, и общая энергия.

В этой статье мы рассмотрим установленные на них блоки питания. Их характеристики, плюсы и минусы, а также основные проблемные места и частые поломки. Итак, приступим!

АвтоВАЗ предлагает три двигателя для установки на Lada Xray:

Самый молодой двигатель в линейке Lada Xray — атмосферный двигатель ВАЗ.

Двигатель уже знаком (ВАЗ 21129) и серьезных проблем доставлять не должен, но все же необходимо учитывать возможные «скользкие моменты», а также знать варианты их решения:

Нестабильная работа двигателя ВАЗ и невозможность его запуска, наверное, самые частые «скачки» данной модели двигателя.Они могут быть спровоцированы сбоями в работе ГРМ, проблемами с давлением топлива, «всасыванием» воздуха, поломкой дроссельной заслонки, а также неисправностью некоторых датчиков.

Также возможна потеря мощности. Основная причина этого — прогоревшая прокладка, в результате чего снижается компрессия в цилиндрах, а также износ узлов (прогорание поршней, износ колец и цилиндров). Впрочем, владельцы нового Xray с такими проблемами не сталкиваются (по крайней мере, на первых порах).

Двигатель Lada Xray (ВАЗ 21127) может начать подрыв … Поможет промывка форсунок двигателя или замена высоковольтных проводов Но процедура не всегда помогает, поэтому обратите внимание на работу катушки зажигания, свечей зажигания и измерить компрессию. Однако лучше сразу же отправиться на СТО.

Иногда возникает проблема с прогревом двигателя до рабочей температуры. «Таблэтка» одна — поменять термостат.

Шумы и стуки в двигателе Lada Xray вызывают проблемы с гидравлическими подъемниками и неисправностями коренных и шатунных подшипников.Иногда это могут быть поршни …

Более мощный (но ненамного) атмосферный двигатель Nissan.

После пробега 120 тысяч километров может потребоваться замена ремня генератора и роликоподшипника «натяжителя». Обратите внимание на работу водяного насоса на Xray. Мотор пока больших проблем не показал. Остальные работы выполняются строго по регламенту T.O. через 15 тыс. км. До 100 тыс. Км масло менять каждые 15 тыс. Км.Производитель рекомендует синтетику: ELF Evolution SXR 5W-30 или ELF Evolution SXR 5W-40. После 100 тыс. Км замену масла проводить не менее 8 тыс. Км. Свечи зажигания заменяются строго через 15 тыс. Км.

Двигатель ВАЗ / Рикардо — третий двигатель в линейке хэтчбеков Lada Xray.

Самый мощный двигатель не имеет серьезных и явных болезней, но не помешает обратить внимание на следующие вопросы:

1. Растяжка цепи ГРМ (ГРМ).Это типично для этих двигателей. Об этой поломке вам скажут следующие симптомы: двигатель плохо заводится, присутствуют провалы тяги, холостой ход плавающий, повышенный шум. Проблема лечится простой заменой цепи, ресурс цепи около 150 тыс. Км ..

2. Двигатель 1.8 не запускается на Xray … Машина заводится не сразу, а с n-го раза. Решается вопрос чистки дроссельной заслонки и / или замены сетки бензонасоса.

3. Тихий, но раздражающий свист мотора. Вы, наверное, узнали источник — это ремень генератора, который решается заменой ролика ремнем.

4. Дергается на малых оборотах, это особенность двигателя, проблема решена новой прошивкой «мозга» Lada Xray.

У этих двигателей Xray недолговечные катализаторы, замена стоит прилично, дроссельная заслонка любит пачкаться и отклик на педаль акселератора снижается, этот вопрос решается обычной ее чисткой, но в целом двигатель обычный, как есть для бюджетной машины.

Двигатель Lada X Rey , точнее, двигатели для компактного российского кроссовера порадуют своей мощностью. Ведь с учетом габаритов и небольшого веса авто например 122 л.с. может хватит. Всего у Lada XRay будет три силовых агрегата. Все они бензиновые, атмосферные, рядные 4-х цилиндровые с 16-клапанным механизмом DOHC. Возможно, на этом совпадения и заканчиваются, иначе это разные силовые агрегаты. Все двигатели Lada X Ray представляют интерес, поэтому мы расскажем о каждом подробно.

Базовый двигатель X Ray ВАЗ-21129 рабочим объемом 1,6 л и мощностью 106 л.с. хорошо известен по другим моделям жигулей. Двигатель инжекторный, с многоточечным впрыском топлива с электронным управлением. При обрыве ремня клапан однозначно прогибается. Да, за ремнем ГРМ нужно следить. Но чугунный блок говорит нам о хорошей ремонтопригодности мотора. Этот силовой агрегат не имеет гидрокомпенсаторов; Регулировка осуществляется подбором специальных «копеек», как на обычном двигателе ВАЗ-2108.

Особенностью силового агрегата Lada XRay 1.6 (106 л.с.) можно считать оригинальную систему впуска. На малых оборотах двигателя воздух подается по более длинным впускным каналам, а при увеличении оборотов двигателя, наоборот, по коротким. То есть состав топливной смеси меняется с бедной на богатую и наоборот. Это позволило увеличить мощность практически во всех диапазонах работы двигателя. Без этой системы из двигателя можно было выжать всего 98 л.с.

Кстати, двигатель будет сочетаться только с 5-ступенчатой ​​механикой JR5 от Renault, но собранной на АвтоВАЗе. Далее подробные характеристики данного силового агрегата X-Ray.

Двигатель Lada X Ray 1.6 (106 л.с.), расход топлива, динамика

• Рабочий объем — 1597 см3
• Привод ГРМ — ремень
• Диаметр цилиндра — 82 мм
• Ход поршня — 75,6 мм
• Мощность л.с. / кВт — 106/78 при 5800 об / мин
• Крутящий момент — 148 Нм при 4200 об / мин
• Максимальная скорость — 172 километра в час
• Разгон до первой сотни — 11.7 секунд
• Расход топлива по городу — 9,3 л.
• Расход топлива смешанный — 7,0 л.
• Расход топлива по трассе — 5,9 л.

Второй двигатель XRay такого же объема 1,6 л, но мощностью 110 л.с. Это разработка концерна Renault-Nissan. Двигатель на автомобилях Nissan называется HR16, Renault обозначается как h5M. Агрегат появился в 2006 году и с тех пор устанавливается на все серийные модели Renault-Nissan по всему миру.Производство этого двигателя освоено на АвтоВАЗе. Конструктивно агрегат серьезно отличается от двигателей ВАЗ с чугунным блоком и ремнем ГРМ.

Двигатель на базе Lada X Ray мощностью 110 л.с. алюминиевый блок цилиндров и алюминиевая головка блока цилиндров. Цепь ГРМ используется в качестве цепи ГРМ … 4-цилиндровый рядный 16-клапанный HR16DE или h5M не имеет гидравлических подъемников, но есть система изменения фаз газораспределения на одном валу. Из особенностей агрегата можно отметить наличие двух форсунок на цилиндр.Выглядит HR16 в сборе с вариатором вроде этого

Но на X-Ray он будет устанавливаться только с 5-ступенчатой ​​коробкой передач Renault. Динамика двигателя неплохая, ниже предлагаем более подробные характеристики.

Двигатель Lada XRay 1.6 (110 л.с.), расход топлива, динамика

• Рабочий объем — 1598 см3
• Количество цилиндров / клапанов — 4/16
• Привод ГРМ — цепной
• Диаметр цилиндра — 78 мм
• Ход поршня — 83.6 мм
• Мощность л.с. / кВт — 110/81 при 6000 об / мин
• Крутящий момент — 156 Нм при 4000 об / мин
• Максимальная скорость — 171 километр в час
• Разгон до первой сотни — 10,3 секунды
• Расход топлива — н / д

Ну и третий и самый мощный двигатель для Рентгена — агрегат ВАЗ рабочим объемом 1,8 литра и мощностью 122 л.с. Этот двигатель будет сочетаться не только с роботизированной машиной, но и с обычной механикой. Производством двигателя долгое время занималось дочернее предприятие АвтоВАЗа «Супер-Авто».Первоначально метод создания этого двигателя заключался в расточке блока цилиндров под большие поршни. То есть взяли обычный 1,6-литровый 16-клапанный мотор и расточили блок. У штатного 1,6-литрового двигателя диаметр цилиндра составляет 82 мм, а у модифицированного — 82,5 мм. Но недавно от этой модернизации отказались, так как срок службы двигателя небольшой, а расход масла очень серьезный.

Теперь объем 1,8 литра получен в основном за счет увеличения хода поршня.То есть блок цилиндров тот же 1,6-литровый, но шатуны и коленвал иностранного производства и конечно другого размера. Да и сами поршни с графитовым покрытием зарубежные, фирмы Federal-Mogul. Надежная зарубежная шатунно-поршневая группа позволила снизить массу деталей, что неизбежно сказалось на устойчивости 1,8-литрового двигателя. Пропал дикий масляный жор, а ресурс мотора оказался не меньше, чем у обычного агрегата 1,6 л. В целом удалось сделать хороший мотор с повышенной мощностью, а главное с очень хорошим крутящим моментом.Кроме того, двигатель получил систему изменения фаз газораспределения на впускном валу.

Двигатель Lada X Ray 1.8 (122 л.с.), расход топлива, динамика

• Рабочий объем — 1797 см3
• Количество цилиндров / клапанов — 4/16
• Привод ГРМ — ремень
• Диаметр цилиндра — 82 мм
• Ход поршня — 84 мм
• Мощность л.с. / кВт — 122/90 при 6050 об / мин
• Крутящий момент — 170 Нм при 3700 об / мин
• Максимальная скорость — 185 км / ч (с АМТ 186 км / ч)
• Разгон до первой сотни — 10.4 секунды (с AMT 12,3 секунды)
• Расход топлива по городу — 9,3 л (с АМТ 8,6 л.)
• Расход топлива в смешанном цикле — 7,4 л (с АМТ 6,8 л.)
• Расход топлива по трассе — 5,8 л (с АМТ 5,8 л.)

Мотор легко переваривает бензин АИ-92.