Лада х рей характеристики двигателя: Какие двигатели устанавливаются на Лада Х-рей? Фото, характеристики

Институт биофизики Университет

Джулия Надь

¹ Институт биофизики, Ульмский университет

Йенс Михаэлис

¹ Институт биофизики, Ульмский университет

¹ Институт биофизики, Ульмский университет

Abstract

Одномолекулярный резонансный перенос энергии Фёрстера (smFRET) можно использовать для получения структурной информации о биомолекулярных комплексах в реальном времени. Таким образом, несколько измерений smFRET используются для локализации неизвестного положения красителя внутри белкового комплекса посредством трилатерации. Для получения количественной информации система нанопозиционирования (NPS) использует вероятностный анализ данных для объединения структурной информации из рентгеновской кристаллографии с данными флуоресценции одиночных молекул для расчета не только наиболее вероятного положения, но и полного трехмерного распределения вероятностей. , названный апостериорным, что указывает на экспериментальную неопределенность.Эта концепция была обобщена для анализа сетей smFRET, содержащих множество молекул красителя. Последняя версия NPS, Fast-NPS, включает новый алгоритм, использующий оценку байесовских параметров на основе выборки методом Монте-Карло цепи Маркова и параллельного темперирования, что позволяет анализировать большие сети smFRET за сравнительно короткое время. Более того, Fast-NPS позволяет рассчитывать апостериор, выбирая одну из пяти различных моделей для каждого красителя, которые учитывают различное пространственное и ориентационное поведение, демонстрируемое молекулами красителя из-за их локального окружения.

Здесь мы представляем подробный протокол для получения данных smFRET и применения Fast-NPS. Мы предоставляем подробные инструкции по получению трех входных параметров Fast-NPS: значений smFRET, а также квантового выхода и анизотропии молекул красителя. Недавно NPS был использован для выяснения архитектуры архейного открытого промоторного комплекса. Эти данные используются для демонстрации влияния пяти различных моделей красителей на апостериорное распределение.

Ключевые слова: Биохимия, Выпуск 120, Система нанопозиционирования, Fast-NPS, флуоресценция одиночных молекул, резонансный перенос энергии Фёрстера одиночных молекул, структурная биология

Введение

Определение структуры биомолекулы является ключевым предварительным условием для понимания его функции.Два хорошо зарекомендовавших себя метода определения структуры — криоэлектронная микроскопия и рентгеновская кристаллография1,2. Сегодня оба метода предоставляют структурную информацию с высоким разрешением и разрешением вплоть до ангстрема. Эти два метода широко используются для выяснения структуры больших биомолекул, таких как белковые комплексы. Хотя существующие методы постоянно совершенствовались на протяжении последних десятилетий, сложность биологических структур по-прежнему представляет собой серьезную проблему для структурной биологии, в частности, когда исследуются большие, динамические и переходные комплексы3.

Чтобы изучить динамику макромолекулярных комплексов и, в частности, взаимосвязь между структурой и функцией, методики изучения отдельных молекул предоставили полезную информацию4. Было разработано несколько новых стратегий, обеспечивающих ортогональный подход к получению структурной и динамической информации. Примерами являются высокоскоростной AFM5, механические манипуляции6, флуоресцентная микроскопия локализации7, а также одномолекулярный резонансный перенос энергии Ферстера (smFRET) 8,9. С самого начала FRET был назван молекулярной линейкой из-за зависимости расстояния от масштаба биомакромолекул10.

Одним из особенно интересных приложений smFRET является использование информации о расстоянии, полученной из измерений smFRET, для вывода структурной информации11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23. Благодаря высокому временному разрешению smFRET положение мобильных частей белковой структуры может быть локализовано. Однако, чтобы извлечь количественную информацию из данных smFRET, во время измерения необходимо определить важные поправочные параметры о молекулах красителя24. С этими поправочными коэффициентами эффективность FRET E _FRET может быть рассчитана по формуле

,

, где I _A и I _D — интенсивности флуоресценции молекулы донора и акцептора. соответственно (см. Рисунок 2 ).Β-фактор учитывает перекрестные помехи, утечку излучения донора в канал акцептора и рассчитывается по формуле

, где I ‘ _A и I’ _D — интенсивности флуоресценции донора и молекула-акцептор после фотообесцвечивания молекулы-акцептора.

γ-фактор корректирует разницу в относительной эффективности обнаружения в двух каналах, а также разницу в квантовом выходе флуоресценции донорного и акцепторного красителей.Он рассчитывается по каждому индивидуальному временному графику с помощью

. Обратите внимание, что это описание не учитывает прямое возбуждение акцепторной молекулы, которое иногда становится важным и также требует корректировки. Для определения этих поправочных коэффициентов полезно возбуждать как донор, так и акцептор по чередующейся схеме25, чтобы различать фотофизические изменения и структурную динамику.

Для получения не только количественной эффективности smFRET, но и количественной структурной информации, в 2008 году была введена система нанопозиционирования (NPS).Название было выбрано на основе его сходства со спутниковой системой глобального позиционирования (GPS). NPS — это гибридный метод, сочетающий данные smFRET и рентгеновской кристаллографии для локализации неизвестных положений красителя в биомакромолекулярных комплексах. Кристаллическая структура служит опорным кадром, а результаты smFRET используются для получения информации о расстоянии между неизвестным положением флуорофора (антенна , ) и положением, известным из кристаллической структуры (спутник , ).В последовательных экспериментах измеряются расстояния между антенной и несколькими спутниками, и положение антенны определяется с помощью статистически строгой схемы анализа, основанной на оценке байесовских параметров. В результате вычисляется не только наиболее вероятное положение антенны, но и ее полное трехмерное распределение неопределенности, так называемое апостериорное, визуализируемое с помощью достоверных объемов. Кроме того, NPS был расширен, чтобы обеспечить возможность анализа полных сетей smFRET27.

NPS использовался для решения ряда важных вопросов эукариотической транскрипции, а именно, прохождения восходящей ДНК, нематричной ДНК и возникающей мРНК внутри комплекса элонгации РНК-полимеразы II12,28, что также демонстрирует эффект факторы инициации транскрипции26 и динамическая архитектура открытого промоторного комплекса29.Более того, NPS использовали для выяснения структуры открытого комплекса РНК-полимеразы архей 30 и, в частности, положения фактора инициации транскрипции TFE, который конкурентно связывается с тем же сайтом, что и фактор элонгации транскрипции Spt4 / 531.

С тех пор было опубликовано несколько структурных подходов на основе smFRET15,18,21,23. При сравнении различных структурных методов на основе smFRET становится ясно, что кажущаяся точность метода сильно зависит от конкретного выбора моделей красителя. Следует отметить, что молекулы красителя могут демонстрировать различное пространственное и ориентационное поведение в зависимости от их локального окружения.

С этой целью был введен Fast-NPS32. Fast-NPS использует усовершенствованный алгоритм выборки, значительно сокращающий время вычислений. Кроме того, Fast-NPS позволяет выполнять структурный анализ, и для каждой молекулы красителя пользователь может выбрать из набора из пяти различных моделей красителя, которые будут описаны ниже. Самая консервативная модель, получившая название classic , предполагает, что краситель занимает только одну, но неизвестную позицию.В этом положении флуорофор может свободно вращаться внутри конуса, размер которого определяется его соответствующей (зависящей от времени) анизотропией флуоресценции. Ориентация конуса неизвестна, что приводит к большой погрешности при преобразовании измеренной эффективности smFRET в расстояния. В этом отношении модель консервативна, так как она дает наименьшую точность по сравнению с другими моделями красителей. Только для очень коротких расстояний допущения, сделанные классической моделью, должны приводить к заметно неправильному определению местоположения.Для типичных значений smFRET правильная позиция всегда заключена в сравнительно большой достоверный объем.

Однако, поскольку желательна более высокая точность, важно разработать и испытать альтернативные модели красителей, которые могут помочь повысить точность. Если краситель вращается намного быстрее, чем время его собственной флуоресценции, можно применить так называемую модель iso . Здесь коэффициент ориентации κ ² (необходимый для расчета характеристического изотропного радиуса Ферстера

) установлен равным 2/3.В результате рассчитанные достоверные объемы почти на два порядка меньше, чем в классической модели32. В случае, если флуорофор находится в среде, которая обеспечивает не только быструю переориентацию, но и дополнительное быстрое движение во всем доступном объеме, следует использовать модель meanpos-iso . В этой модели краситель эффективно занимает только одно среднее положение, где пространственное усреднение учитывается путем преобразования полиномиального расстояния15. Эта модель применима, например, если (обычно гидрофобный) краситель прикреплен к гидрофильной области, e.г., ДНК. Применение модели meanpos-iso приводит к дальнейшему уменьшению размера достоверных объемов примерно в два раза. Однако краситель, связанный с белком, может обратимо связываться с несколькими гидрофобными участками в своем стерически доступном объеме (AV). Флуорофор, который мгновенно переключается между этими областями, но внутри одной области подвергается свободному вращению и быстрому локализованному движению, лучше всего описывается моделью var-meanpos-iso . Для аналогичной ситуации, в которой краситель не может свободно вращаться, применяется модель var-meanpos .Более подробную информацию об этих моделях можно найти в нашей недавней публикации32.

Эти модели обладают обширным репертуаром, специально предназначенным для учета различных сред, с которыми может столкнуться краситель, и их разумное применение оптимизирует точность его локализации. В Fast-NPS каждая молекула красителя, прикрепленная к определенному положению, может быть отнесена к отдельной модели, так что FRET-партнерам разрешено иметь разные модели. Это обеспечивает безграничное моделирование, приближенное к природе. Однако важно проводить строгие статистические тесты, чтобы гарантировать, что результат, полученный с помощью окончательной комбинации моделей, по-прежнему согласуется с экспериментальными данными.Эти тесты включены в программное обеспечение Fast-NPS.

Чтобы применить Fast-NPS к экспериментальным данным, требуется измерение (только) трех входных параметров. Во-первых, необходимо определить изотропные радиусы Фёрстера для каждой пары красителей (

). Следовательно, необходимо измерять квантовый выход (QY) донорного красителя, спектры излучения донорной флуоресценции и спектры поглощения акцептора. Эти измерения можно проводить в большом количестве, используя стандартный спектрометр и стандартный флуоресцентный спектрометр.Для каждой пары затем вычисляется R ₀ с помощью бесплатного программного обеспечения PhotochemCAD и может использоваться в анализе NPS. Более того, анизотропия флуоресценции (с временным разрешением) молекул красителя должна быть получена с использованием поляризационного (и временного) флуоресцентного спектрометра. Однако наиболее важными входными параметрами для Fast-NPS являются эффективности smFRET, измеренные на установке для флуоресцентной микроскопии одиночных молекул, такой как флуоресцентный микроскоп полного внутреннего отражения (TIRFM).

Здесь мы представляем пошаговый протокол для получения данных smFRET и применения Fast-NPS (, рис. 1, ).

Протокол

1. Предварительные условия и лабораторное оборудование

ПРИМЕЧАНИЕ: Сборка измерительной камеры изображена на Рис. 3 . Сэндвич-конструкция измерительной камеры состоит из трех основных компонентов: предметного стекла из кварцевого стекла (плавленого кварца), герметизирующей пленки и покровного стекла, закрывающего проточную камеру. Измерительная камера устанавливается на специальный держатель образца. Размеры камеры для образцов и металлического держателя соответствуют стандартному предметному стеклу из кварцевого стекла для микроскопии (76 мм x 26 мм).

1. Вырежьте предметные стекла из кварцевого стекла с помощью алмазного сверла (0,75 мм) в положениях, указанных на Рисунок 4 . Конструкция слайдов из кварцевого стекла асимметрична, чтобы различать две стороны каждого слайда. ПРИМЕЧАНИЕ. Кварцевые предметные стекла можно использовать повторно после измерения до появления царапин на поверхности.

2. Для установки камер используйте индивидуальные металлические держатели образцов, как показано на Рисунок 5 .Держатели образцов имеют две резьбы (M4) для соединения впускной и выпускной трубок для проточной камеры. Кроме того, используйте резьбу (M3), чтобы установить камеру для образца на металлический держатель, а также резьбу (M3), чтобы закрепить держатель призмы на нижней половине металлического держателя.

3. Выполните измерения smFRET на флуоресцентном микроскопе полного внутреннего отражения призменного типа (TIRFM) (, рис. 6, ). ПРИМЕЧАНИЕ: TIRFM включает три лазера: зеленый (532 нм, Nd: YAG-лазер) и красный лазер (643 нм, диодный лазер) для возбуждения донорных и акцепторных молекул красителя, а также синий лазер (491 нм. , твердотельный лазер с диодной накачкой) для обесцвечивания фоновых флуоресцентных примесей на камере для образца перед измерением smFRET.Три лазерных луча пространственно объединены и могут быть выбраны с помощью акустооптического перестраиваемого фильтра (AOTF). Флуоресцентный свет собирается объективом с высокой апертурой, разделяется на донорный и акцепторный каналы с помощью дихроичного зеркала и проецируется на две камеры EM-CCD. Камера для образца прикреплена к микрометрическому столику, позволяющему перемещаться в направлениях x и y с помощью двух шаговых двигателей. Третий пьезодвигатель используется вместе с ИК-лазером и позиционно-чувствительным детектором для создания системы автоматической фокусировки, обеспечивающей оптимальную фокусировку на протяжении всего эксперимента.

   1. Используйте переменное лазерное возбуждение (ALEX), когда наблюдается динамика временных траекторий FRET ²⁵ . Такая динамика может быть вызвана либо конформационными изменениями внутри молекул, либо флуктуациями яркости акцептора и мерцанием акцептора. ПРИМЕЧАНИЕ: ALEX позволяет различать эти две возможные причины и предотвращает неправильную интерпретацию динамических траекторий FRET. Однако из соображений простоты протокольная часть ограничивается анализом фильмов, снятых без ALEX.Внимание: лазеры класса 3B используются в установке флуоресценции одиночных молекул. Перед запуском системы убедитесь, что приняты соответствующие меры безопасности при работе с лазером в соответствии с постановлениями местного правительства.

4. Выполните измерение поглощения, используемое для определения квантового выхода на спектрометре UV-VIS (см. Материалы и методы).

5. Выполните измерение спектра излучения донорной флуоресценции, спектра поглощения акцептора и анизотропии флуоресценции на флуоресцентном спектрометре (см. Материалы и методы).

6. Подготовьте камеры для проб в соответствии с опубликованными процедурами 33. В качестве альтернативы можно использовать процедуру, описанную в [34].

7. Пометьте исследуемые образцы парой молекул донорно-акцепторного красителя, подходящей для smFRET, и убедитесь, что на поверхности камеры для образцов имеется фрагмент биотина для иммобилизации. ПРИМЕЧАНИЕ. Чтобы локализовать неизвестное положение красителя антенны с помощью программного обеспечения Fast-NPS, необходимы различные образцы конструкций. Каждая конструкция должна иметь одну метку в неизвестном положении антенного красителя и одну метку в спутниковой позиции, известной из кристаллической структуры.Для получения точных результатов требуются по крайней мере три различных конструкции с красителями, прикрепленными к позиции антенны, и три различных позиции спутника. Измерения между антеннами, а также между спутниками также полезны для повышения точности, однако для этого требуется обмен молекулами красителя, который необходимо правильно ввести в анализ.

2. Установка проточных камер в специальный держатель

1. Протяните силиконовую трубку (внутренний диаметр 0,8 мм, внешний диаметр 2,4 мм) в полые винты с выступом (M4) и обрежьте трубку с обоих концов ровно, оставив выступ 1 см с обеих сторон острым лезвием бритвы.Отрегулируйте выступ трубки примерно на 2 мм с одной стороны винта с выступом.

2. Установите проточную камеру в держатель образца таким образом, чтобы отверстия в предметном стекле из кварцевого стекла совпадали с резьбой держателя образца. Осторожно затяните впускные и выпускные винты, чтобы убедиться, что впускное и выпускное отверстия камеры для пробы по-прежнему проницаемы. Осторожно затяните четыре винта держателя акрилового стекла, чтобы зафиксировать положение проточной камеры.

3. Обрезанная силиконовая трубка (0.58 мм ID, 0,96 мм OD) на куски длиной 20 см. Вставьте одну из частей во входной и выходной винт измерительной камеры. Закройте впускной и выпускной трубопровод с помощью зажима. ПРИМЕЧАНИЕ. Собранные камеры для проб можно хранить при комнатной температуре до двух недель.

3. Измерение smFRET на микроскопе TIRF

1. Используйте шприц, чтобы промыть камеру для образца 500 мкл PBS. Всегда предотвращайте попадание пузырьков воздуха в камеру для образцов, создавая каплю на конце впускной трубки перед переходом на другой буферный раствор.

2. Промойте камеру для образцов раствором 100 мкл нейтравидина (0,5 мг / мл в PBS) и инкубируйте 15 мин при комнатной температуре.

3. Промойте раствор нейтравидина 500 мкл PBS.

4. Навинтите металлический держатель призмы на камеру для образца.

5. Установите камеру для образца на микрометрический столик TIRF-микроскопа. Убедитесь, что камера для образцов установлена ​​горизонтально как можно прямо перед объективом, чтобы избежать расфокусировки во время сканирования.

6. Запустите программное обеспечение для управления камерами EM-CCD и программное обеспечение для управления пьезодвигателями сцены.

7. Отрегулируйте фокусировку объектива микроскопа, глядя на отражение ИК-лазера.

8. Поместите призму (PS991, n = 1,52) поверх металлического держателя призмы. Отрегулируйте боковое положение призмы, чтобы убедиться, что лазерные лучи попадают в призму, затем используйте клей и инкубируйте с УФ-светом в течение 5 мин.ПРИМЕЧАНИЕ. Установленную призму можно повторно использовать после очистки.

9. В программном обеспечении управления камерой нажмите «Настройка сбора данных» и определите следующие параметры сбора данных: время интеграции 100 мс, 401 кадр / видеоролик (зеленая камера), 400 кадров / видеоролик (красная камера), коэффициент усиления электронного умножителя 225, предварительный — усиление усилителя в 5 раз и скорость считывания 3 МГц при 14 битах.

10. Создайте папку на локальном жестком диске для измерения. Выберите желаемое имя для файлов измерений, e.грамм. , год-месяц-день. В настройках программы зайдите в райдер «Автосохранение», включите «Автосохранение» и выберите формат файла * . sif для получения фильма. Выберите папку на жестком диске. Используйте имя папки как файл.

11. Включите функцию «Автоинкремент» (установите начальное значение на 1). Включите привязку оператора к имени файла. Используйте «ДОН» и «АСС» для донорного и акцепторного каналов соответственно. Выберите «_» в качестве разделителя.

12. В программном обеспечении управления камерой нажмите «Видео», чтобы начать прямое изображение с камеры и обесцветить фоновую флуоресценцию путем сканирования камеры для образца с использованием максимальной интенсивности лазера всех трех лазеров (вместе ≈ 3000 Вт / см ² для 10 с на поле зрения).

13. Выключите синий лазер. Уменьшите интенсивность зеленого лазера примерно до 200 Вт / см ² и примерно до 40 мВт / см ² для красного лазера, если используется переменное лазерное возбуждение (ALEX).

14. Разбавьте биотинилированный флуоресцентный образец до концентрации 50–100 пМ. Загрузите 100 мкл раствора. При связывании образец иммобилизируется на поверхности камеры. ПРИМЕЧАНИЕ. Следите за тем, чтобы не перегружать камеру. Соседние молекулы должны быть отделены друг от друга.

15. При необходимости загрузите в камеру дополнительные 100 мкл пробы, в 2 раза более концентрированной.

16. Закройте впускную и выпускную трубки измерительной камеры зажимами после завершения загрузки.

17. Выключите все лазеры и используйте пьезодвигатели для перемещения проточной камеры на два поля зрения дальше.

18. В программном обеспечении управления камерой нажмите «Принять сигнал», чтобы начать запись видео и одновременно включить лазер.Убедитесь, что к концу пленки обесцвечивается более 80% молекул, регулируя мощность лазера.

19. Повторите шаги 3.17 и 3.18 для всей области предварительно обесцвеченной камеры для образца.

4. Получение карты трансформации («beadmap»)

1. Подготовьте проточную камеру, как описано в разделах 1. 1, 1.2 и 2.

2. Используйте флуоресцентные мультиспектральные шарики, покрытые авидином, которые показывают флуоресцентное излучение в донорный и акцепторный каналы.Вихревую смесь в течение 1 мин, затем разбавьте 50 мкл смеси в 50 мкл ddH ₂ O. Снова встряхните в течение 1 мин, обработайте ультразвуком 1-2 мин, затем встряхните еще 10 сек.

3. Выполните шаги, описанные для измерений smFRET (Раздел 3.5–3.10).

4. Загрузите 100 мкл (объем 1 камеры) разбавленных 1: 2 флуоресцентных шариков в проточную камеру. Подождите 10 минут, чтобы флуоресцентные шарики связались с поверхностью.

5. Используйте параметры сбора данных в 3.9, но измените длину видеоролика на 26 (зеленая камера) и 25 (красная камера), а коэффициент усиления электронного умножителя на 10.

6. Установите интенсивность зеленого лазера на значение 20 Вт / см ² .

7. Снимите один видеоролик в поле зрения примерно с 50–100 бусинами.

5. Обработка и анализ данных smFRET

1. Используйте специально написанное программное обеспечение SM FRET для анализа диаграммы направленности (см. Материалы и методы) и полученных фильмов. Запустите программу viewPlot1.m.

2. Щелкните «Анализ» | «Анализ партии», снимите флажок «ALEX», если он не использовался.Для лучшей производительности выберите «высокий» порог нахождения пика. Нажмите «ОК».

3. Выберите «НЕТ», когда вас спросят, анализировалась ли карта уже. Просмотрите папку, содержащую полученный beadmap, и выберите файл * .sif (дважды щелкнув по нему). В следующем диалоговом окне нажмите «ОК». ПРИМЕЧАНИЕ. Если диаграмма направленности уже была проанализирована в ходе предыдущего измерения, выберите здесь «ДА» и выберите сохраненную карту разброса, перейдя в нужную папку и дважды щелкнув файл карты разметки * .map.Продолжите с шага 5.8.

4. Выберите два одиночных шарика, расположенных в противоположных углах поля зрения. Интенсивность пикселей имеет цветовую кодировку от темно-синего (низкая интенсивность) до темно-красного (высокая интенсивность).

5. Щелкните по центру первой бусинки. Если центр молекулы можно четко определить по цветовой кодировке, выберите «ДА» или нажмите «НЕТ» и выберите другую пару молекул.

6. Поместите перекрестие на пиксель, показывающий максимальную интенсивность, и нажмите «СОХРАНИТЬ».Повторите процесс со вторым каналом.

7. Щелкните по молекуле в противоположном углу и повторите шаги 5.5 и 5.6. ПРИМЕЧАНИЕ. Относительный сдвиг пикселей двух каналов отображается в командном окне, и карта преобразования автоматически сохраняется как файл * .map в папку, содержащую файл beadmap * .sif.

8. Чтобы загрузить донорские и акцепторные фильмы (* .sif) для «пакетного анализа», перейдите в папку, выберите все фильмы, которые должны быть проанализированы, и нажмите «OK».В следующем диалоговом окне нажмите «ОК». ПРИМЕЧАНИЕ. Пакетный анализ завершен, когда последняя дорожка, отображаемая в командном окне, начинается с «Завершенный анализ…». Обнаруженные молекулы отображаются в новом окне, в котором также указывается относительный сдвиг донорного и акцепторного каналов, определенный из карты трансформации.

9. Чтобы загрузить пакетные файлы фильмов, щелкните Файл | Загрузить. Снимите отметку с опции «ALEX», если она не использовалась. Установите гладкость на 10 и нажмите «ОК».Выберите папку, содержащую файлы * .ttr, и нажмите «выбрать все» и «ОК» в следующем контекстном меню.

10. Если отображаемая кривая имеет характерные фазы smFRET ( Рисунок 2 ), нажмите кнопку переключения «Не выбрано» и сначала выберите момент времени начала события FRET, перемещая линию с помощью курсора мыши и щелкнув левой кнопкой мыши. Затем выберите момент времени обесцвечивания молекулы-акцептора и, наконец, момент времени обесцвечивания молекулы-донора.

11. В следующем окне эффективность FRET отображается синим цветом. Чтобы выбрать график, нажмите кнопку «Да», в противном случае выберите «Нет». Чтобы повторно получить доступ к временной шкале, нажмите кнопку «Назад».

12. Повторяйте процедуру до последней молекулы фильма.

13. После анализа последней молекулы в фильме сохраните выбранные следы, нажав «Файл | Сохранить». Сохраните выбранные трассы в той же папке, что и файлы * .sif.

14. Повторите шаги 5.10-5,13 за все приобретенные фильмы.

15. Выполнить программу comb_fret_results.m . Выберите папку, содержащую файлы * .res и все файлы * .FRETonly_trace. Сохраните молекулярные файлы FRET и FRET как файлы MW.dat и FRW.dat соответственно. ПРИМЕЧАНИЕ. Файлы * .dat сохраняются как файлы ASCII. Файл FRW.dat содержит шесть столбцов и одну строку для каждого кадра FRET. Шестой столбец содержит скорректированную покадровую эффективность FRET. Файл MW.dat содержит 21 столбец и одну строку для каждой выбранной молекулы FRET.Третий столбец содержит молекулярную эффективность FRET.

6. Отображение данных smFRET в гистограммах

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы извлечь среднюю эффективность smFRET всех записанных данных smFRET, покадровые данные или данные по молекулам наносятся на гистограммы и анализируются с использованием гауссовских подходов множественные) пики. Далее протокол использует коммерческое программное обеспечение для анализа данных (см. Список материалов). Однако вместо этого можно использовать любое другое доступное программное обеспечение.

1. Откройте программное обеспечение для анализа данных (см. Список материалов). Щелкните File | Import | multiple ASCII. Выберите папку, содержащую файл FRW.dat. Выберите файл и нажмите «ОК». Подтвердите вариант ввода нажатием «ОК» без изменений.

2. Выберите третий столбец C (Y), содержащий исправленные значения эффективности FRET, щелкните столбец правой кнопкой мыши и выберите «График | Статистика | Гистограмма». В окне гистограммы дважды щелкните столбцы, снимите флажок «автоматическое разбиение» и выберите желаемый размер интервала e.грамм. , 0,05. Также выберите начальное и конечное значения, , например, -0,025 и 1,025.

3. Выберите столбцы гистограммы, щелкнув по ним левой кнопкой мыши. Затем щелкните правой кнопкой мыши и выберите «Перейти к рабочему листу корзины». Выберите столбец «Количество», щелкнув его левой кнопкой мыши, а затем щелкните правой кнопкой мыши и выберите «График | Столбец / столбец / круговая диаграмма | Столбец».

4. На столбчатой ​​диаграмме перейдите в диалоговое окно Анализ | Подгонка | Подгонка нелинейной кривой | Открыть. Выберите «Гауссиана» в разделе «Функция», затем перейдите к наезднику «Параметр».Отмените выбор автоматической инициализации параметров. Зафиксируйте значение смещения (y0) на 0. Нажмите «Подогнать». ПРИМЕЧАНИЕ. Функция подгонки, а также детали подгонки теперь отображаются на столбчатой ​​диаграмме. Значение «xc» дает центр функции соответствия, , то есть — среднюю эффективность FRET, которая служит входным параметром для программного обеспечения NPS.

7. Измерение квантового выхода

1. Выполните определение квантового выхода относительным методом, аналогичным процедуре, описанной Würth et al. 35, используя в качестве стандарта родамин 101, растворенный в этаноле (QY = 91,5%).

2. Запишите спектры поглощения на спектрометре UV-VIS, используя объем 80 мкл в кювете для поглощения с длиной пути 1 см. Поглощение на длине волны, которая будет использоваться для возбуждения флуоресценции, должно быть ≤ 0,05.

3. Запишите спектры излучения на спектрометре с ламповой калибровкой, работающем в режиме счета фотонов. Выполните измерения с поляризаторами Глана-Томпсона в возбуждении (0 °) и эмиссии (54.7 °) (условия магического угла) с использованием спектральной ширины полосы около 5 нм и 2,5 нм для монохроматора возбуждения и излучения соответственно. Измерьте образцы после их переноса во флюоресцентную кювету с длиной пути 3 мм, следя за тем, чтобы скорость счета не превышала 10 ⁶ с ^-1 .

   1. Рассчитайте квантовый выход согласно

, где n и n _Std — показатели преломления растворителя образца и стандарта, соответственно.f (λ) и f_Std (λ) — интенсивности флуоресценции образца и стандарта на длине волны λ. A (λ _от ) и A ^std (λ _от ) — это оптическая плотность образца и эталона на длине волны возбуждения, а Φ _std — квантовый выход стандарта.

8. Расчет изотропного радиуса Ферстера

1. Рассчитайте изотропный радиус Ферстера (

   ) из ​​спектра излучения молекулы донора, спектра поглощения молекулы акцептора, квантового выхода донора и показателя преломления среды.Используйте бесплатную программу PhotochemCAD для расчета

   . Однако вместо него можно использовать любое другое доступное программное обеспечение36.

9. Измерение анизотропии

1. Определите стационарную анизотропию флуоресценции по записям спектров флуоресценции с различными настройками поляризатора возбуждения / излучения (V / V, V / H, H / V, H / H) 36 .

2. Рассчитайте G-фактор, который корректирует артефакты поляризации прибора, для каждой длины волны из отношения

и используйте его для вычисления значения анизотропии для каждой длины волны:

, где I _xy указывает интенсивность для поляризации возбуждения x и поляризации излучения y .

1. Усредните значения по спектральному диапазону излучения для расчета анизотропии стационарной флуоресценции.

10. Установка программного обеспечения Fast-NPS

1. Загрузите UCSF Chimera с http://www.cgl.ucsf.edu/chimera и следуйте инструкциям по установке.

2. Перейдите на сайт «Института биофизики» при Ульмском университете: https://www.uni-ulm.de/en/nawi/institute-of-biophysics/software.html. Загрузите текущую версию Fast-NPS и распакуйте ее в любую папку.Откройте подпапку «Распространяемый компонент» и установите распространяемый пакет Visual C ++, который подходит для системы.

11. Центрирование файла pdb

1. Откройте интересующий файл pdb в Chimera. Выберите все атомы макромолекулярного комплекса и вычислите координаты центроида (Инструменты | Анализ структуры | Оси / Плоскости / Центроиды | Определить центроид… | Хорошо).

2. Откройте журнал ответов (Избранное | Журнал ответов) и инструмент преобразования (Инструменты | Движение | Трансформировать координаты).Введите координаты центроида, показанного в журнале ответов, в текстовое поле «Сдвиг» окна преобразования координат и измените знак каждой координаты. Нажмите «Применить» и сохраните файл с помощью «Сохранить PDB» (Файл | Сохранить PDB).

12. Настройка приоритетных позиций

ПРИМЕЧАНИЕ. Все значения указаны в ангстремах.

1. Запустите язык технических вычислений и измените текущую папку на локальную папку Fast-NPS. Введите в командном окне: FastNPS.

2. Создайте новый файл вакансии в Менеджере проектов (Проект | Новый).

3. Установите предыдущую позицию (Инструменты | Модель красителя до).

4. В панели «Prior basics» определите пространственное разрешение предыдущей позиции, введя ее значение (рекомендуется 2).

5. Исключите внутреннюю часть макромолекулы, установив флажок и нажав кнопку «загрузить PDB». Выберите и загрузите центрированный файл PDB, как описано в Разделе 11.

6. Укажите приблизительный диаметр (рекомендуется 13 Å, см. Обсуждение) красителя, указав его значение.

7. Введите расстояние скелетирования, , т. Е. расстояние, на которое молекула красителя может проникнуть в макромолекулу (рекомендуется 2 Å).

8. В панели «Максимальный предыдущий размер» введите минимальные и максимальные координаты предыдущей позиции (рекомендуется: x в [-150,150], y в [-150,150] и z в [-150,150]).

9. При определении сателлита активируйте флажок «присоединение через гибкий линкер» на панели «предыдущие основы» и введите в панель «линкер» координаты атома (в центрированном файле pdb), в котором находится молекула красителя. прилагается.Далее укажите длину и диаметр линкера, введя их значения (рекомендуются 13 Å и 4,5 Å, см. Обсуждение). В случае антенны пропустите этот пункт.

10. Нажать кнопку «рассчитать доступный объем».

11. Сохраните предыдущее положение и при необходимости экспортируйте его для целей визуализации с помощью такого программного обеспечения, как Chimera.

13. Определение сетевой геометрии

1. Откройте окно определения измерений (Режим | Редактировать геометрию).

2. Создайте новую молекулу красителя, нажав кнопку «Новый» в панели «Красители».

3. Задайте анизотропию флуоресценции (Раздел 9), введя значение и выбрав модель красителя в раскрывающемся меню «Модель красителя».

4. Нажмите кнопку «Загрузить», выберите соответствующую позицию и установите флажок активировать краситель. Повторите эту процедуру для всех красителей, , то есть для всех антенн, а также для всех спутников.

5. После создания всех красителей определите размеры.Создайте новое измерение, нажав «Создать» на панели «Измерения».

6. Выберите партнеров FRET в раскрывающихся меню «Dye1» и «Dye2» ниже.

7. Введите эффективность smFRET с ошибкой и изотропный радиус Ферстера этой пары красителей.

8. Наконец, отметьте флажок активации измерения. Повторите эту процедуру для всех измерений. ПРИМЕЧАНИЕ. Часто сеть становится все более сложной, так что пользователь может запутаться.Во избежание ошибок проверьте сеть визуально, нажав кнопку «Проверить сеть». На рисунке показаны активированные красители и измерения с помощью линий, соединяющих красители FRET.

14. Расчет

1. Откройте окно расчета (режим | Расчет).

2. Если каждому красителю в сети назначена определенная модель, выберите «Определено пользователем» и запустите расчет, нажав «Расчет». Чтобы использовать все красители в одной модели, выберите одну из пяти моделей (классическая, iso, meanpos-iso, var-meanpos-iso и var-meanpos) и продолжайте.ПРИМЕЧАНИЕ. В командном окне будет отображаться ход расчета. Fast-NPS сделает это во всплывающем сообщении, когда расчет будет завершен.

15. Визуализация результатов

1. Чтобы экспортировать достоверные объемы красителей, откройте окно просмотра результатов (Модель | Просмотр результатов).

2. Экспортные плотности красителей:

   1. Экспортные красители по отдельности или все одновременно. Чтобы экспортировать отдельный краситель, выберите его на панели «Отображаемые красители» и нажмите «Экспорт плотности».Введите разрешение (рекомендуется 2) и выберите тип файла для экспорта. Справа отображается плотность и некоторые ее математические характеристики.

   2. Чтобы экспортировать все красители одновременно, нажмите «Пакетный экспорт».

3. Откройте полученные файлы плотности в Chimera.

16. Проверка согласованности выбранной комбинации моделей

1. Откройте окно просмотра результатов (Модель | Просмотр результатов).Если на панели «Информация о расчетах» в текстовом поле «Согласованность» отображается значение ниже 90%, текущая модель не отражает в достаточной степени измеренную эффективность smFRET и, следовательно, является несовместимой.

2. В случае несоответствия нажмите кнопку «Детальная согласованность». Найдите измерения со значением ниже 90%. Если в этих измерениях преимущественно задействованы один или несколько красителей, их модели могут вызвать несоответствие. Рассмотрите различные модели красителей для этих красителей и повторно запустите расчет Fast-NPS.

Типичные результаты

Транскрипция — это первый шаг в экспрессии генов у всех организмов. У архей транскрипция осуществляется одной РНК-полимеразой (РНКП). По сравнению с эукариотами, RNAP архей имеет поразительное структурное сходство со своими эукариотическими аналогами, но при этом имеет более простой механизм транскрипции. Таким образом, археи можно использовать в качестве модельной системы для изучения инициации транскрипции эукариот с помощью РНК-полимеразы II (Pol II). Недавно полная архитектура открытого комплекса РНК-полимеразы архей была определена из одномолекулярных FRET и NPS.Данные анализа NPS были использованы для построения модели полного открытого промоторного комплекса архей, которая дает полезные сведения о механизме инициации транскрипции.

Чтобы выяснить эту структуру, была измерена эффективность smFRET между неизвестными молекулами антенного красителя, расположенными внутри открытого промоторного комплекса, и несколькими известными молекулами красителя-сателлита, которые были включены в пять ссылочных сайтов в RNAP, положения которых известны из кристаллографических структур (pdb-ID : 2WAQ) 37.Антенные красители были прикреплены к любому из различных положений нематричной ДНК, TFB, TBP или TFE. Полная сеть, использованная в этом исследовании, состояла из более чем 60 измеренных расстояний.

Рисунок 7 изображает модель полного комплекса открытого промотора архей, построенного на основе анализа NPS. Он состоит из двухцепочечной промоторной ДНК (светлый и темно-синий), РНК-полимеразы (серый) и факторов инициации транскрипции TBP (фиолетовый), TFB (зеленый) и TFE (желтый).Модель накладывается на результаты анализа NPS, достоверные объемы, которые были рассчитаны с использованием классической модели (A), модели iso (B), модели meanpos-iso (C), модели var-meanpos-iso. (D) и модель var-meanpos (E).

Рисунок 1: Рабочий процесс сбора и обработки параметров, необходимых для расчета Fast-NPS. Щелкните здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Примерная временная диаграмма интенсивности флуоресценции для события smFRET. Интенсивности флуоресценции донора (зеленый) и молекулы акцептора (красный), показывающие три характерные фазы, а именно: I: smFRET, II: флуоресценция донора после фотообесцвечивания акцептора, III: фоновая флуоресценция после фотообесцвечивания донора. Щелкните здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Схематическое изображение проточной камеры для экспериментов smFRET. Проточная камера устанавливается на индивидуальный металлический держатель с держателями из акрилового стекла.Сэндвич-конструкция проточной камеры состоит из предметного стекла из кварцевого стекла (плавленого кварца) с двумя отверстиями для крепления впускной и выпускной трубок, герметизирующей пленки и покровного стекла, закрывающего проточную камеру. Призма для освещения TIRF устанавливается на нижнюю половину проточной камеры. Полые винты с язычками обеспечивают вход и выход для проточной камеры. Щелкните здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Подготовка предметного стекла из кварцевого стекла и герметизирующей пленки. Механический чертеж предметного стекла из кварцевого стекла с указанием положения отверстий (в миллиметрах). Щелкните здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Механический чертеж проточной камеры. Размеры алюминиевого держателя призмы, держателя акрилового стекла и алюминиевой монтажной рамы указаны в миллиметрах. Щелкните здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рис. 6: Схематическое изображение призменной установки TIRF, используемой для экспериментов smFRET. Сокращения для обозначения оптических компонентов: A — диафрагма; DM — дихроичное зеркало; F, эмиссионный фильтр; L, линза; М, зеркало; О, объективный; П — призма; PSD, позиционно-чувствительный фотодиод; S, образец; PS, этап позиционирования; Т, телескоп. Щелкните здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 7: Результаты моделирования различных допущений модели. Все изображения показывают полимеразу РНК архей (pdb-ID: 2WAQ, вид сверху) вместе с моделью промоторной ДНК (тДНК и нтДНК синим и голубым соответственно), TBP (фиолетовый), TFB (зеленый) и TFE (желтый). ) в археологическом открытом комплексе 30.Надежные объемы накладываются на результаты моделирования NPS ( A ) классической модели, ( B ) iso-модели, ( C ) meanpos-iso модели, ( D ) var-meanpos- iso и ( E ) модель var-meanpos. Все объемы показаны с достоверностью 68%. Классическая сеть и сеть var-meanpos согласуются с данными smFRET. Напротив, сети, в которых для всех красителей выбрана модель iso, meanpos-iso или var-meanpos-iso, не соответствуют измеренным данным.Щелкните здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

Мы представляем установку и экспериментальную процедуру для точного определения эффективности FRET между красителями, прикрепленными через гибкие линкеры к биомакромолекулам, , т.е. , нуклеиновым кислотам и / или белкам.

Для обеспечения точных измерений smFRET (Раздел 3) очень важно исключить воздух из проточной камеры в любой момент во время измерения. Кроме того, следите за тем, чтобы не перегружать проточную камеру флуорофорами.Флуорофоры должны быть четко разделены для обеспечения правильного анализа. Поскольку пары smFRET, которые не показывают обесцвечивание донора, должны быть исключены из анализа, убедитесь, что> 80% молекул в поле зрения обесцвечиваются в конце фильма. Чтобы учесть неоднородности в образце, β-фактор и γ-фактор, корректирующие перекрестные помехи и относительную эффективность обнаружения донорного и акцепторного каналов, соответственно, рассчитываются для каждой пары FRET отдельно.

Настройки камеры (время интегрирования, коэффициент усиления электронного умножителя, коэффициент усиления предварительного усилителя и скорость считывания, описанные в разделе 3.9) должны быть установлены на значения, обеспечивающие наилучший компромисс между отношением сигнал / шум, динамическим диапазоном и временным разрешением. Их необходимо перенастроить для разных экспериментов или при использовании другого оборудования. Количество кадров должно быть достаточно большим, чтобы обеспечить обесцвечивание большинства донорных молекул за время наблюдения.

Для измерений на флуоресцентном спектрометре (разделы с 7 по 9) должен быть найден хороший компромисс между интенсивностью сигнала и спектральным разрешением записанных данных.С этой целью щели на пути возбуждения и излучения флуоресцентного спектрометра должны быть адаптированы в зависимости от используемого инструмента и концентрации образца.

Кроме того, мы представляем метод анализа Fast-NPS для получения структурной информации о переходных или динамических макромолекулярных комплексах. NPS был применен для выявления пути нематричной цепи ДНК и положения факторов инициации транскрипции в открытом комплексе архейной РНК-полимеразы. Используя сеть из более чем 60 различных измерений расстояний, мы показали, что Fast-NPS, оснащенный недавно реализованным механизмом отбора проб (Eilert, T., Beckers, M., Drechsler, F., & Michaelis, J. в стадии подготовки), сокращает время, необходимое для анализа этой сложной сети smFRET, примерно на 2 порядка по сравнению с исходным глобальным методом NPS27. Надежность алгоритма основана на сэмплере «Метрополис внутри Гиббса» в сочетании с параллельной схемой темперирования. Fast-NPS показывает точную воспроизводимость сетевых результатов и согласуется с результатами, опубликованными ранее30.

Было опубликовано несколько различных методов, направленных на вывод структурной информации из измерений smFRET11,12,13,14,15,16,17,18.Все эти подходы обеспечивают только одну конкретную модель красителя. Таким образом, красители, которые не соответствуют предположениям, сделанным соответствующей моделью, не могут быть использованы или приводят к ложной структурной информации. Fast-NPS, напротив, позволяет подбирать для каждой молекулы красителя отдельную модель. Это помогает учесть различное конформационное поведение как самой молекулы красителя, так и линкера, используемого для ее прикрепления. Локальное молекулярное окружение молекулы красителя, а также ее физические свойства будут определять, какая модель является наиболее подходящей.

Для анализируемой сети smFRET комплекса инициации архей изотропное предположение для всех молекул красителя приводит к резкому уменьшению размера вероятных объемов по сравнению с классической моделью. В сочетании с динамическим усреднением положения для всех молекул красителя медиана всех вероятных размеров объема (при 95%) уменьшается до менее 0,5 нм ³ . Однако эти задние молекулы красителя больше не согласуются с их измерениями smFRET, указывая на то, что сделанные предположения приводят к ложной структурной информации.Напротив, апостериорные уровни, определенные в классической модели, согласуются с определенной эффективностью smFRET.

Поскольку предположение об изотропном и / или динамическом усреднении положения для всех красителей приводит к несоответствиям, Fast-NPS позволяет использовать априорные молекулы красителя, в которых каждому красителю может быть назначена одна из пяти моделей. В каждой модели используется один и тот же доступный объем. Алгоритм расчета АВ красителя делает несколько предположений. Сначала пространственная форма флуорофора аппроксимируется сферой.Таким образом, следует использовать диаметр, учитывающий ширину, высоту и толщину флуорофора (раздел 12). Далее форма линкера аппроксимируется гибким стержнем. Значения, представленные в разделе 12, были вычислены для красителя Alexa 647, присоединенного через линкер 12-C. На сегодняшний день невозможно точно определить априори, какая модель наиболее подходит, учитывая геометрию эксперимента, и поэтому все модели должны быть протестированы. Как правило, выбирают модель, которая дает наименьший возможный апостериорный размер, но при этом согласуется с данными.Чтобы проверить, согласуется ли выбор моделей с данными smFRET, мы вычисляем как апостериорную, так и вероятность. Согласованность означает, что более 90% образцов, собранных в апостериорной области, находятся в пределах 95% доверительного интервала правдоподобия.

Хотя верно, что чем ниже анизотропия, тем меньше неопределенность расстояния, в сети smFRET также необходимо учитывать геометрическое расположение молекул красителя. Таким образом, хотя представление молекул красителя с низкой анизотропией флуоресценции с помощью изомодели является типичным первым выбором, тест на консистенцию предоставляет более прямые средства для выбора правильной модели красителя.Оптимальный выбор моделей красителей может привести к резкому увеличению точности локализации и в то же время сохранить согласованность сети с ее данными FRET.

Таким образом, Fast-NPS позволяет получать структурную и динамическую информацию о крупных макромолекулярных комплексах. В отличие от обычных структурных методов, таких как рентгеновская кристаллография или криоэлектронная микроскопия, это позволяет отслеживать очень гибкие или переходные комплексы, что значительно расширяет наше понимание механизмов сложных биологических процессов.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы благодарят Б. Грюхманна за механические чертежи проточной камеры. Кроме того, мы хотим выразить нашу благодарность Максу Бекерсу и Флориану Дрекслеру за содержательные комментарии и обсуждения, касающиеся NPS и лежащего в основе механизма выборки.

Список литературы

• Ченг Ю. Крио-ЭМ одиночных частиц с кристаллографическим разрешением. Клетка. 2015; 161: 450–457.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Гарман Э. Ф. Развитие методов рентгеноструктурного определения структуры биологических макромолекул. Наука. 2014. 343 (6175): 1102–1108. [PubMed] [Google Scholar]
• Сали А. Итоги первого семинара рабочей группы по гибридным / интеграционным методам wwPDB. Состав. 2015; 23: 1156–1167. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Хопфнер К.П., Михаэлис Дж. Механизмы транслоказ нуклеиновых кислот: уроки структурной биологии и биофизики одиночных молекул.Curr Opin Struct Biol. 2007; 17: 87–95. [PubMed] [Google Scholar]
• Андо Т., Учихаши Т., Кодера Н. Высокоскоростной АСМ и приложения к биомолекулярным системам. Анну Рев Биофиз. 2013; 42: 393–414. [PubMed] [Google Scholar]
• Нойман К.К.С., Надь А. Силовая спектроскопия одиночных молекул: оптический пинцет, магнитный пинцет и атомно-силовая микроскопия. Нат методы. 2008; 5: 491–505. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Йилдиз А. Миозин V ходит из рук в руки: визуализация одного флуорофора с помощью 1.5-нм локализация. Наука. 2003. 300 (5628): 2061–2065. [PubMed] [Google Scholar]
• Джу К., Бальчи Х, Ишицука Ю., Бураначай С., Ха Т. Достижения в методах флуоресценции одиночных молекул для молекулярной биологии. Анну Рев Биохим. 2008. 77 (1): 51–76. [PubMed] [Google Scholar]
• Hohlbein J, Craggs TD, Cordes T. Возбуждение переменного лазера: FRET одной молекулы и не только. Chem Soc Rev.2014; 43 (4): 1156–1171. [PubMed] [Google Scholar]
• Страйер Л., Хаугланд Р.П. Передача энергии: спектроскопическая линейка.Proc Natl Acad Sci U S. A. 1967; 58 (2): 719–726. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Rasnik I, Myong S, Cheng W., Lohman TM, Ha T. Ориентация связывания ДНК и конформация домена мономера Helicase Rep E. coli, связанного с частичным дуплексным соединением : Одномолекулярные исследования флуоресцентно меченых ферментов. J Mol Biol. 2004. 336 (2): 395–408. [PubMed] [Google Scholar]
• Андрека Дж. Одномолекулярное отслеживание мРНК, выходящей из РНК-полимеразы II. Proc Natl Acad Sci U S A.2008. 105 (1): 135–140. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Шредер Г.Ф., Грубмюллер Х. FRETsg: Построение модели биомолекулярной структуры на основе нескольких экспериментов FRET. Comput Phys Commun. 2004. 158 (3): 150–157. [Google Scholar]
• Маргиттай М. Одномолекулярный резонансный перенос энергии флуоресценции обнаруживает динамическое равновесие между закрытой и открытой конформациями синтаксина 1. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2003; 100 (26): 15516–15521. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Калинин С.Набор инструментов и эталонное исследование для высокоточного структурного моделирования с ограничениями FRET. Нат методы. 2012. 9 (12): 1218–1227. [PubMed] [Google Scholar]
• Choi J. N6-метиладенозин в мРНК нарушает отбор тРНК и динамику удлинения трансляции. Nat Struct Mol Biol. 2015; 23 (август 2015): 110–115. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Свенссон Б. Трилатерация зондов, связанных с функциональными рианодиновыми рецепторами, на основе FRET. Biophys J. 2014; 107 (9): 2037–2048. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Стивенсон Дж. Д., Кеньон Дж. К., Симмонс М. Ф., Lever AML.Характеристика трехмерной структуры РНК с помощью одиночной молекулы FRET. Методы. 2016. С. 1–11.
• Ли Н.К. Точные измерения FRET в одиночных диффундирующих биомолекулах с использованием переменного лазерного возбуждения. Биофиз Дж. 2005; 88 (4): 2939–2953. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• McCann JJ, Choi UB, Zheng L, Weninger K, Bowen ME. Оптимизация методов восстановления абсолютной эффективности FRET от иммобилизованных одиночных молекул. Биофиз Дж. 2010; 99 (3): 961–970. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Brunger AT, Strop P, Vrljic M, Chu S, Weninger KR.Трехмерное молекулярное моделирование с помощью FRET одной молекулы. J. Struct Biol. 2011; 173: 497–505. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Schuler B. Одномолекулярный FRET структуры и динамики белка — праймер. J нанобоитехнология. 2013; 11 (Приложение 1): 1–17. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Choi UB. Одномолекулярная модель слитого комплекса синаптотагмин 1-SNARE, полученная из FRET. Nat Struct Mol Biol. 2010. 17 (3): 318–324. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Dale RE, Eisinger J, Blumberg WE.Ориентационная свобода молекулярных зондов. Фактор ориентации при внутримолекулярном переносе энергии. Биофиз Дж. 1979; 26 (2): 161–193. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Kapanidis AN. Переменное лазерное возбуждение одиночных молекул. Acc Chem Res. 2005. 38 (7): 523–533. [PubMed] [Google Scholar]
• Muschielok A. Система нанопозиционирования для анализа структуры макромолекул. Нат методы. 2008. 5 (11): 965–971. [PubMed] [Google Scholar]
• Muschielok A, Michaelis J.Применение системы нано-позиционирования для анализа сетей флуоресцентного резонансного переноса энергии. J. Phys Chem B. 2011; 115 (41): 11927–11937. [PubMed] [Google Scholar]
• Andrecka J. Система нано-позиционирования выявляет ход восходящей и неэлементной ДНК внутри комплекса элонгации РНК-полимеразы II. Nucleic Acids Res. 2009. 37 (17): 5803–5809. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Трейтлейн Б. Динамическая архитектура комплекса открытого промотора с минимальной РНК-полимеразой II.Mol Cell. 2012. 46 (2): 136–146. [PubMed] [Google Scholar]
• Надь Дж. Полная архитектура открытого комплекса РНК-полимеразы архей из одной молекулы. FRET и NPS. Nat Commun. 2015; 6: 6161. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Grohmann D, et al. Фактор инициации TFE и фактор элонгации Spt4 / 5 конкурируют за зажим RNAP во время инициации и удлинения транскрипции. Mol Cell. 2011. 43 (2): 263–274. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Beckers M, Drechsler F, Eilert T., Nagy J, Michaelis J.Количественная структурная информация из FRET одной молекулы. Фарадей Обсуди. 2015; 184: 117–129. [PubMed] [Google Scholar]
• Беннинк М.Л. Разворачивание отдельных нуклеосом путем растягивания отдельных волокон хроматина с помощью оптического пинцета. Nat Struct Biol. 2001. 8 (7): 606–610. [PubMed] [Google Scholar]
• Chandradoss SD. Пассивация поверхности для исследования одномолекулярных белков. J Vis Exp. 2014. с. e50549. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
• Würth C, Grabolle M, Pauli J, Spieles M, Resch-Genger U.Относительное и абсолютное определение квантовых выходов флуоресценции прозрачных образцов. Nat Protoc. 2013. 8 (8): 1535–1550. [PubMed] [Google Scholar]
• Lakowicz JR. Принципы флуоресцентной спектроскопии. Бостон, Массачусетс: Springer США; 2006. [Google Scholar]
• Корхин Ю. Эволюция сложных РНК-полимераз: Полная структура РНК-полимеразы архей. PLoS Biol. 2009; 7 (5) [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

Рентгеновские приложения и последние достижения @ XLab Frascati

Ресурсы | Хамамацу Фотоникс

Этот веб-сайт или его сторонние инструменты используют файлы cookie, которые необходимы для его функционирования и необходимы для достижения целей, проиллюстрированных в этой политике использования файлов cookie.Закрыв баннер с предупреждением о файлах cookie, прокручивая страницу, щелкая ссылку или продолжая просмотр иным образом, вы соглашаетесь на использование файлов cookie.

Hamamatsu использует файлы cookie, чтобы сделать ваше пребывание на нашем веб-сайте более удобным и обеспечить его функционирование.

Вы можете посетить эту страницу в любое время, чтобы узнать больше о файлах cookie, получить самую свежую информацию о том, как мы используем файлы cookie, и управлять настройками файлов cookie. Мы не будем использовать файлы cookie для каких-либо целей, кроме указанных, но обратите внимание, что мы оставляем за собой право обновлять наши файлы cookie.

Чтобы современные веб-сайты работали в соответствии с ожиданиями посетителей, им необходимо собрать определенную базовую информацию о посетителях. Для этого сайт создает небольшие текстовые файлы, которые размещаются на устройствах посетителей (компьютерных или мобильных) — эти файлы известны как файлы cookie, когда вы заходите на сайт. Файлы cookie используются для обеспечения нормальной и эффективной работы веб-сайтов. Файлы cookie уникально назначаются каждому посетителю и могут быть прочитаны только веб-сервером в домене, который отправил файл cookie посетителю.Файлы cookie не могут использоваться для запуска программ или доставки вирусов на устройство посетителя.

выполняют различные функции, которые делают работу в Интернете более удобной и интерактивной. Например, файлы cookie используются для запоминания предпочтений посетителей на сайтах, которые они часто посещают, для запоминания языковых предпочтений и для более эффективной навигации между страницами. Большая часть, хотя и не все, собранные данные являются анонимными, хотя некоторые из них предназначены для определения шаблонов просмотра и приблизительного географического местоположения, чтобы улучшить впечатления посетителей.

Для определенных типов файлов cookie может потребоваться согласие субъекта данных перед их сохранением на компьютере.

2. Какие бывают типы файлов cookie?

Этот веб-сайт использует два типа файлов cookie:

1. Основные файлы cookie. Для нашего веб-сайта основные файлы cookie контролируются и обслуживаются Hamamatsu. Никакие другие стороны не имеют доступа к этим файлам cookie.
2. Сторонние файлы cookie. Эти файлы cookie реализуются организациями за пределами Хамамацу. У нас нет доступа к данным в этих файлах cookie, но мы используем эти файлы cookie, чтобы улучшить общее впечатление от веб-сайта.

3. Как мы используем файлы cookie?

Этот веб-сайт использует файлы cookie для следующих целей:

1. Для работы нашего веб-сайта необходимы определенные файлы cookie. Это строго необходимые файлы cookie, которые необходимы для обеспечения доступа к веб-сайту, поддержки навигации или предоставления соответствующего контента.Эти файлы cookie направляют вас в правильную страну и поддерживают безопасность и электронную торговлю. Строго необходимые файлы cookie также обеспечивают соблюдение ваших настроек конфиденциальности. Без этих строго необходимых файлов cookie большая часть нашего веб-сайта не будет работать.
2. Аналитические файлы cookie используются для отслеживания использования веб-сайта. Эти данные позволяют нам улучшить удобство использования, производительность и администрирование нашего веб-сайта. В наших аналитических файлах cookie мы не храним никакой личной идентифицирующей информации.
3. Функциональные файлы cookie.Они используются, чтобы узнать вас, когда вы вернетесь на наш сайт. Это позволяет нам персонализировать наш контент для вас, приветствовать вас по имени и запоминать ваши предпочтения (например, ваш выбор языка или региона).
4. Эти файлы cookie записывают ваше посещение нашего веб-сайта, страницы, которые вы посетили, и ссылки, по которым вы переходили. Мы будем использовать эту информацию, чтобы наш веб-сайт и отображаемая на нем реклама соответствовали вашим интересам. Мы также можем передавать эту информацию третьим лицам с этой целью.

Файлы cookie помогают нам помочь вам. С помощью файлов cookie мы узнаем, что важно для наших посетителей, а также разрабатываем и улучшаем контент и функции веб-сайта, чтобы обеспечить вам удобство использования. Доступ к большей части нашего веб-сайта можно получить, если файлы cookie отключены, однако некоторые функции веб-сайта могут не работать. И мы считаем, что ваши текущие и будущие посещения будут улучшены, если будут включены файлы cookie.

4. Какие файлы cookie мы используем?

Есть два способа управлять настройками файлов cookie.

1. Вы можете установить настройки файлов cookie на своем устройстве или в браузере.
2. Вы можете установить свои предпочтения в отношении файлов cookie на уровне веб-сайта.

Если вы не хотите получать файлы cookie, вы можете изменить свой браузер так, чтобы он уведомлял вас об отправке файлов cookie, или вы можете полностью отказаться от файлов cookie. Вы также можете удалить уже установленные файлы cookie.

Если вы хотите ограничить или заблокировать файлы cookie веб-браузера, установленные на вашем устройстве, вы можете сделать это в настройках своего браузера; функция справки в вашем браузере должна подсказать вам, как это сделать.Кроме того, вы можете посетить сайт www.aboutcookies.org, который содержит исчерпывающую информацию о том, как это сделать в самых разных браузерах для настольных компьютеров.

5. Что такое Интернет-теги и как мы используем их с файлами cookie?

Иногда мы можем использовать интернет-теги (также известные как теги действий, однопиксельные GIF-файлы, прозрачные GIF-файлы, невидимые GIF-файлы и GIF-файлы размером 1 на 1) на этом сайте и можем размещать эти теги / файлы cookie через стороннего рекламного партнера. или партнер по веб-аналитике, который может находиться и хранить соответствующую информацию (включая ваш IP-адрес) в другой стране.Эти теги / файлы cookie размещаются как в онлайн-рекламе, которая приводит пользователей на этот сайт, так и на разных страницах этого сайта. Мы используем эту технологию для измерения откликов посетителей на наши сайты и эффективности наших рекламных кампаний (в том числе, сколько раз открывается страница и с какой информацией обращаются), а также для оценки использования вами этого веб-сайта. Сторонний партнер или партнер службы веб-аналитики может собирать данные о посетителях нашего и других сайтов с помощью этих интернет-тегов / файлов cookie, может составлять для нас отчеты о деятельности веб-сайта и может предоставлять дополнительные услуги, связанные с использование веб-сайта и Интернета.Они могут предоставлять такую ​​информацию другим сторонам, если это требуется по закону или если они нанимают другие стороны для обработки информации от их имени.

Если вы хотите получить дополнительную информацию о веб-тегах и файлах cookie, связанных с онлайн-рекламой, или отказаться от сбора этой информации третьими лицами, посетите веб-сайт Network Advertising Initiative http://www.networkadvertising.org.

6. Аналитические и рекламные файлы cookie

Мы используем сторонние файлы cookie (например, Google Analytics) для отслеживания посетителей на нашем веб-сайте, для получения отчетов о том, как посетители используют веб-сайт, а также для информирования, оптимизации и показа рекламы на основе чьих-либо прошлых посещений нашего веб-сайта.

Вы можете отказаться от файлов cookie Google Analytics на веб-сайтах, предоставленных Google:

https://tools.google.com/dlpage/gaoptout?hl=en

Как предусмотрено в настоящей Политике конфиденциальности (статья 5), вы можете узнать больше о файлах cookie отказа на веб-сайте Network Advertising Initiative:

http://www.networkadvertising.org

Сообщаем вам, что в таком случае вы не сможете полностью использовать все функции нашего сайта.

Terbium — обзор | Темы ScienceDirect

10.3 Выводы

Летучие комплексы Eu, а именно Eu (TTA) ₃ Phen, Eu _{( x )} Y _{(1− x )} (TTA) ₃ Phen и Eu _{( x )} Tb _{(1− x )} (TTA) ₃ Phen были синтезированы с соблюдением стехиометрического соотношения. Эти комплексы показали розовато-красное свечение под УФ-излучением. Когда эти комплексы возбуждали УФ-светом в диапазоне 250–500 нм, наблюдался широкий пик возбуждения около 370 нм со слабым плечом на 254 нм.Среди всех изученных комплексов Eu _0,4 Y _0,6 (TTA) ₃ Phen показал превосходное интенсивное излучение при 611 нм с узкой полной шириной на полувысоте по сравнению с другими синтезированными комплексами. Это может быть связано с безызлучательной передачей энергии от иона-усилителя Y ³⁺ к Eu ³⁺ в легированных комплексах. Интенсивность эмиссии увеличивалась в порядке Eu (TTA) ₃ Phen 0,5 Tb _0,5 (TTA) ₃ Phen 0.4 Tb _0,6 (TTA) ₃ Phen 0,5 Y _0,5 (TTA) ₃ Phen 0,4 Y _0,6 (TTA) ₃ Phen, доказывая их потенциальное применение в OLED.

Комплексы, легированные ПММА, показали сильные пики поглощения при 334 и 336 нм, соответственно, что было приписано переходу n — π * β-дикетонатного лиганда ТТА, с другим пиком при 280 нм в обоих комплексах, приписанным переходу π — π * ТТА компоненты.Близкие коэффициенты поглощения всех комплексов указывают на одинаковую концентрацию β-дикетоната (ТТА) в полимере в соответствии со всеми соединениями, имеющими одно и то же трис-хелатное ядро. Среди трех комплексов, допированных ПММА, комплекс Eu _0,5 Tb _0,5 (TTA) ₃ Phen показал гиперхромный сдвиг, чем два других комплекса, что привело к увеличению интенсивности люминесценции. Интенсивность флуоресценции в матрицах ПММА возрастала в порядке Eu (TTA) ₃ Phen 0.5 Y _0,5 (TTA) ₃ Phen 0,5 Tb _0,5 (TTA) ₃ Phen. Полосы излучения ⁵ D ₀ → ⁷ F ₂ всех легированных систем с аналогичными профилями имеют острый пик при 611–611,4 нм в ПММА. Относительная интенсивность острого пика, а также плеч уменьшалась с повышением температуры. Эти результаты показывают, что микросреда вокруг ионов Eu ³⁺ в легированных системах при температурах 50 ° C и 80 ° C может несколько отличаться от микроклимата в легированных системах при комнатной температуре и в чистом комплексе.Термическая обработка может привести к диспергированию излучающих молекул в матрице. Для Eu (TTA) ₃ Phen, Eu _0,5 Tb _0,5 (TTA) ₃ Phen и Eu _0,5 Y _0,5 (TTA) ₃ Phen пик эмиссии наблюдался при 611 нм при комнатной температуре, а также при более высоких температурах. Но для Eu _0,5 Y _0,5 (TTA) ₃ Phen центр излучения немного сместился до 612 нм при более высокой температуре (80 ° C). Из результатов можно заметить, что эмиссионное поведение легированных систем изменялось с температурой, четко отражая влияние температуры на изменение интенсивности.На основе спектров поглощения сольватированных комплексов Eu была определена оптическая ширина запрещенной зоны, которая оказалась практически одинаковой как в кислой, так и в основной среде. Alq ₃ синтезирован простым методом осаждения при комнатной температуре. При возбуждении на длине волны 385 нм он излучал зеленый свет с длиной волны 506 нм. Фотолюминесценция показала, что любая энергия фотонов возбуждения в спектральном диапазоне от полосы электронного перехода ¹ L _a до ¹ B _b вносит вклад в широкую зеленую фотолюминесценцию.Этот металлический комплекс Al, производное 8-гидроксихинолина, показал широкополосные структурированные спектры излучения фотолюминесценции со стоксовым сдвигом 150 нм, который характерен для межмолекулярной эксимерной эмиссии. Пленки Alq ₃ + PMMA при 10, 5 и 1 мас.%, Возбужденные на длине волны 385 нм, испускали зеленый свет при 510, 512 и 511 нм соответственно. Пленки Alq ₃ + PS с концентрацией 10, 5 и 1 мас.% Излучали интенсивный зеленый свет с длиной волны 511, 510 и 508 нм, соответственно, при возбуждении на длине волны 385 нм. Все пленки Alq ₃ с ПММА и ПС показали небольшое красное смещение по сравнению с порошком Alq ₃ .Полная ширина на полувысоте чистого Alq ₃ составляет 75 нм, а Alq ₃ с ПММА при различных концентрациях 10, 5 и 1 мас.% Составляет 81, 80, 76 нм и для Alq ₃ с ПС при различных концентрациях 10, 5 и 1 мас.% составляли 82, 76 и 74 нм.

Новый п-ацетилбифенил Cl-DPQ, т.е. 2 — ([1,1′-бифенил] -4-ил) -6-хлор-4-фенилхинолин, синтезировали методом конденсации Фридлендера. Сдвиг оптических переходов π → π * и n → π * в P-ацетилбифенил Cl-DPQ, различные люминесцентные растворы с молярными концентрациями 10 ⁻³ были исследованы в основных (хлороформ, дихлорметан) и кислой (уксусная кислота, муравьиная кислота) средах.Наблюдается красный сдвиг спектра поглощения в кислотах по сравнению с хлороформом и дихлорметаном DPQ, что может быть связано с протонированием иминного азота хинолинового кольца с образованием иона хинолиния. Энергетические щели синтезированного полимерного соединения составили 3,03, 3,02, 3,40 и 3,37 эВ в муравьиной кислоте, уксусной кислоте, дихлорметане и хлороформе соответственно. При возбуждении на длине волны 377 нм в эмиссионных спектрах виден ярко выраженный синий интенсивный пик эмиссии с центром на 397 нм.Смешанные пленки полимерного соединения, полученные молекулярным легированием 2 — ([1,1′-бифенил] -4-ил) -6-хлор-4-фенилхинолина (P-ацетилбифенил Cl-DPQ) в ПС различными мас.% (10, 5 и 1 мас.%) Показали хорошую совместимость. Спектры фотолюминесценции P-ацетилбифенил Cl-DPQ показали больший сдвиг в протонных растворителях по сравнению с апротонными и неполярными растворителями. Таким образом, все эти комплексы в твердом состоянии могут быть использованы в качестве сырых красных излучающих материалов для изготовления OLED методом вакуумного осаждения.С другой стороны, те же комплексы также подходят для изготовления OLED методами растворения, когда они диспергированы в полимерной матрице и сольватированы в различных основных и кислотных растворителях. Комбинация трехцветного люминофора в подходящей пропорции дает белый свет, который можно использовать для энергоэффективного и экологически чистого SSL.

ЦЕНТР ПРИБОРОВ И РАДИОЛОГИЧЕСКОГО ЗДОРОВЬЯ (ЦДРЗ)

CDRH разрабатывает политику FDA и решает проблемы, связанные со здоровьем населения и безопасностью медицинских устройств и радиоизлучающих электронных продуктов.Это оценивает заявки на предпродажное одобрение медицинских устройств, утверждает протоколы разработки продуктов и запросы на освобождение для исследовательских целей. устройств. Он классифицирует устройства по нормативным категориям, разрабатывает стандарты эффективности безопасности и правила надлежащей производственной практики, осуществляет послепродажный надзор и программы соблюдения нормативных требований, а также оказывает техническую и нефинансовую помощь мелким производителям. Центр также проводит программы по снижению воздействия на человека опасного ионизирующего и неионизирующего излучения посредством программы радиационного контроля электронных продуктов и другие программы, предназначенные для контроля и ограничения радиационного облучения.Центр разрабатывает и проводит исследовательские и тестовые программы в области физические науки, науки о жизни и инженерные науки, связанные с воздействием радиации и медицинских устройств на здоровье человека, предоставляют экспертные знания и анализы для оценки риска для здоровья, а также разрабатывает новые или улучшенные методы измерения, техники, инструменты и аналитические процедуры для оценка производительности и надежности продукта.

Возможности исследований и разработок в рамках FDA, которые поддаются производительности малого бизнеса, включают, но не ограничиваются: следующий:

А.Изучите настройку, документацию и оптимизацию нашего Sun Grid Engine (SGE). Архитектура этого сетевого приложения особенно подходит для управления избыточными мощностями в высокопроизводительных вычислениях. Моделирование многих физиологических функций и биоинформатический анализ может занять месяцы. или даже годы, чтобы работать на стандартном настольном компьютере. SGE берет на себя общую проблему и распределяет ее по облаку компьютеров в сети, чтобы ни один пользователь не знает и не заботится о том, выполняется ли вычисление на его машине в фоновом режиме.Поскольку FDA выпускает ноутбуки с многоядерными процессорами, которые оснащены огромными объемами памяти, этот эксперимент в области «облачных вычислений» может стать реальностью в кампусе Уайток. Объем работ будет разрабатывать, документировать и предоставлять системы обучения для разработчиков, сетевых архитекторов и пользователей методологиям работы для интеграции облачные вычисления с существующей стандартной сетью, соответствующей требованиям FISMA.

Б.Разработайте высокоскоростную спектральную КМОП-линейную систему визуализации при слабом освещении для измерения полных спектров множества переменных в живой ткани. Полный спектры сигналов флуоресценции (включая автофлуоресценцию и FRET) могут быть измерены вдоль линии на высоких скоростях (10 кГц) с помощью прямоугольной CMOS сетка (например, 10 x 1000 пикселей -> 10 сайтов 1000 длин волн).

C. Разработать биоанализы / биосенсоры для выявления повреждающих уровней нервной стимуляции с использованием биолюминесценции и обнаружения нейротрансмиттеров. технологии.Необходимые исследовательские возможности включают фиксацию напряжения, токовую фиксацию и внеклеточные методы на периферических нервах и срезах мозга для изучить протоколы стимуляции, которые высвобождают нейроактивные вещества, высвобождаемые при травмах и воспалениях, которые обычно не возникают при нормальных условиях. физиологические условия.

D. Спроектировать, построить и проверить фантом, который прослеживается до национального метрологического института (NMI), такого как NIST (или любой другой NMI), чтобы улучшить точность и клиническая применимость измерений минеральной плотности костной ткани, выполненных с помощью двухэнергетической рентгеновской абсорбциометрии (DXA).Калибровочный фантом должен быть построены с использованием биосуррогатных материалов с известными / табличными данными для тканей тела и заменителей тканей.

Red Special: история гитары Брайана Мэя и характеристики

Comparte este artículo en

Red Special — так называется мифическая гитара Брайана Мэя, гитариста Queen, которую он построил вместе со своим отцом, мы расскажем вам ее историю и секреты.

Особая история Брайана Мэя Рэда

Почему Брайан Мэй создал Red Special?

Это был 1963 год, и у Брайана Мэя, которому тогда было 16 лет, была акустическая гитара, которую ему подарили родители, которую он хранит до сих пор.Но чтобы играть музыку, которую он хотел, ему нужна была электрогитара. К сожалению, у его семьи не было денег на покупку Fender Stratocaster или Gibson.

Гарольд Мэй, отец Брайана, был инженером-электронщиком и прекрасным строителем, настоящим мастером. Итак, отец и сын обсудили сами, как сделать электрогитару. Музыкант даже говорит, что они сказали: «Может быть, мы сможем сделать что-то лучше, чем кто-либо когда-либо делал». Таким образом, оба начали амбициозный проект, отвечающий собственным требованиям Брайана, высочайшего качества и с авангардными концепциями.Таким образом, Red Special был построен единственным в своем роде, и его история увлекательна.

Строительство длилось около полутора лет, начиная с августа 1963 года и заканчивая 1964 годом.

Как называется гитара Брайана Мэя?

Электрогитара Брайана Мэя называется Red Special, но у него есть и другие прозвища, такие как Old Lady и The Fireplace, поскольку она была сделана из части старого дома.

Характеристики Red Special

Red Special, настоящая гитара Diyer

Одна из самых удивительных особенностей этой гитары заключается в том, что она была сделана, по большей части, из переработанных материалов, которые были у Мэй, с использованием элементарных и простых инструментов, которые у них были.

За исключением ладов и колышков, которые они купили в магазине рядом с домом, все было разработано и изготовлено ими. Они сделали бридж, тремоло и другие пьесы. Первоначально звукосниматели были изготовлены к Маю, но позже они купили стандартные звукосниматели Burns, которые Брайан перемотал и модифицировал.

Продукт вторичной переработки

Основными материалами, из которых была изготовлена ​​гитара, были вещи, которые у них были под рукой. Гриф гитары сделан из дерева из старого камина, которому в то время было более 100 лет.Колпачок и вставки рычага тремоло изготовлены с помощью пуговиц и спицы от мамы музыканта. Для тела использовались части старого стола. Для обвязки корпуса использовали белый пластик с некоторых полочек.

Хотя тот факт, что большая часть гитары была сделана вручную из переработанных материалов, действительно примечателен, вероятно, самым удивительным и достойным восхищения является качество и авангардный дизайн и концепции, с которыми была построена Red Lady.

Несомненно, первый пример высокого уровня инноваций и инженерии, которым обладает эта культовая гитара, — это роликовый мост и нулевой лад для минимизации трения при использовании тремоло. Таким образом, на настройку не влияют резкие изменения натяжения, вызванные «рычагом».

Еще один отличный пример — 24 лада. Что-то очень редкое в то время, и даже сегодня, учитывая, что его масштаб всего 24 дюйма.

Разнообразие аудиозаписей на Red Special остается примечательным даже сегодня.Имея три переключателя ON / OFF — вкл. И выкл. — и три независимых переключателя фазы / вне фазы для каждого из трех звукоснимателей, они выдают множество исключительных тонов. Таким образом, вы можете получить звук, подобный Stratocaster, подключив один звукосниматель или комбинацию грифа и середины, при этом, подключив все три, можно получить усиление Les Paul.

Фирменный звук Брайана Мэя исходит от этой уникальной гитары, подключенной к каналу Normal Vox AC30, монеты Sixpense вместо медиатора и, конечно же, пальцев Брайана.

Мэй сделала всю эту гитару со спецификациями по своему вкусу и желанию, например, одной из вещей, которые она искала, было достижение сцепления или обратной связи. Брайан признается, что его увлекает игра. На это он был вдохновлен, увидев, как Джефф Бек играет вживую и издает разные звуки, просто перемещая гитару перед усилителем. Он хотел, чтобы инструмент был живым и взаимодействовал с ним и с воздухом вокруг него.

Брайан использовал Red Special почти исключительно и исключительно на альбомах Queen и на живых выступлениях с момента основания группы в начале 1970-х годов.Практически все песни Queen записаны на этом инструменте, за исключением Crazy Little thing под названием love, в котором использовался старый и эффективный Telecaster и некоторые треки, записанные с акустической гитарой.

Брайан несколько раз говорил, что когда он начал гастролировать, его друг, который был журналистом, сказал ему не брать Red Special. Гитарист сказал ему, что не может, что, если он его не наденет, часть его тела будет отсутствовать. К счастью, «Старушка» пережила все эти поездки, оставшись в отличном функциональном состоянии.

Строительство Red Special

Изготовление гитары было трудным и трудным делом. Сам Брайан Мэй сказал, что у них не было сложных инструментов. Те немногие, что у них были, были простыми бытовыми инструментами, такими как стамески, перочинные ножи, наждачная бумага и т. Д., И в некоторых случаях им приходилось создавать свои собственные специальные инструменты, чтобы двигаться вперед со строительством.

Рассказанный музыкантом анекдот, показывающий, насколько сложным был процесс, когда Брайан, работая над дубовой частью корпуса гитары, с помощью стамески повредил часть дерева.Гитарист-подросток так расстроился и рассердился, что выбросил все в окно, затем, успокоившись, вернулся к работе.

Другой пример, который упомянула Мэй, — это то, что для кармана на шее, той части тела, к которой подходит шея, и пятки шеи, части, которая вставляется в тело, все инструменты, которые она использовала, были перочинным ножом и наждачной бумагой.

Общие характеристики Red Lady

The Red Special, также известная как «Камин» или «Старая леди», представляет собой гитару с грифом из красного дерева с грифом из дуба, привинченным к полому корпусу, состоящему из дуба, прессованного дерева и эстетичного листа красного дерева.и двойной переплет.

У него короткая 24-дюймовая шкала и 24 лада без учета нулевого лада -Zero Fret-. У него есть тремоло-система и роликовый мост, разработанный Брайаном и его отцом, который отлично работает.

Звукосниматели представляют собой три звукоснимателя Burns Tri-Sonic с независимой активацией и переключателями, которые позволяют подключать их по фазе или не в фазе, обеспечивая большой объем доступного звука.

Шея красного особого

Red Special — горловина изготовлена ​​из дерева от камина.Этой доске было около 100 лет, более чем достаточно времени для хорошей стоянки и сушки древесины без вопросов. Древесина была из красного дерева, изъеденного молью, однако Брайан и Гарольд Мэй увидели потенциал этого древнего дерева.

Профиль грифа был вручную изготовлен по форме, желаемой Брайаном, что усложнялось из-за возраста и качества древесины. Гитарист объяснил, что отверстия, сделанные жуками, были прикрыты спичками и слоем пластикового покрытия Растина.

Что касается натяжителя или полотна, Брайан и Гарольд нагрели один конец стального стержня, а затем согнули его в виде крючка. Указанный крючок ввинчивается в боковую часть корпуса гитары, а остальная часть планки проходит через гриф до конца грифа.

Гриф камина

Гриф имеет дубовый гриф или гриф, окрашенный в черный цвет, имитирующий эбеновое дерево, которое является ценным и очень дорогим деревом. У нее 24 лада, что-то очень новаторское, и даже сегодня это все еще странно, особенно если учесть, что гитара построена с короткой шкалой всего в 24 дюйма.Инструмент по-прежнему сохраняет оригинальные лады, по крайней мере, так было до 2014 года, когда гитарист Queen рассказал об этом в интервью Absolute Radio.

Радиус 7,25 дюйма, как у крыльев того времени. Каждая из инкрустаций — это перламутровые пуговицы, которые ей подарила мама. Мэй, придав ему индивидуальность, решил расположить их оригинальным образом: две точки на 7 и 19 ладах и три на 12 и 24.

Гайка: Zero Fret of the Red Special

Еще одна невероятная деталь изобретательности и новаторства Брайана Мэя заключается в том, что вместо стандартной гайки он включил нулевой лад вместе с бакелитовой направляющей струны, похожей на гайку, так что струны хорошо скользят при использовании тремоло.В 2005 году «Old Lady» получила новый нулевой лад.

Передняя бабка «Старушки»

Передняя бабка гитары спроектирована так, чтобы поддерживать минимальное трение струн, обеспечивая почти прямую линию. Таким образом, Брайан заставил всю систему тремоло и натяжения инструмента работать идеально, с минимальным трением, не влияя на настройку.

Тело «старушки»

Центр корпуса сделан из дуба, взятого со старого стола.Брайан говорит, что с ним было очень сложно работать, потому что он был «твердым как сталь». Контур корпуса сделан из прессованной древесины, то есть из полосок мягкой древесины, зажатых между двумя листами фанеры. Наконец, чтобы придать ему лучший внешний вид, корпус покрыт шпоном из красного дерева сверху, снизу и по бокам, что придает ему вид гитары с твердым корпусом из красного дерева.

Полуполый корпус

Брайан, помимо большой полости для органов управления, оставил акустическую камеру в верхней части корпуса.Конечным результатом технически была полуакустическая гитара. Он сделал это, чтобы добиться более «живого» взаимодействия с усилителем и иметь возможность поиграть с обратной связью и легко добиться связи с усилителем, вдохновленный Джеффом Беком.

Мэй сказал, что изначально идея заключалась в том, чтобы у гитары были отверстия типа «f», но так и не удалось этого сделать.

Затем на верхний и нижний края была нанесена белая пластиковая полка, чтобы крепления придавали ей гладкий, высококачественный вид гитары.

Пикапы Red Special

На гитаре установлено три звукоснимателя с одной катушкой. Первоначально в нем были звукосниматели, сделанные и намотанные Брайаном, что, по его словам, звучало неплохо. Проблема заключалась в том, что, когда я наклонялся, у них было странное поведение и звук. Вот почему позже он купил звукосниматели Burns Tri-Sonic. Он перемотал два из них и покрыл катушки эпоксидной смолой Araldite, чтобы уменьшить шум. Средний планшет остался без перемотки и покрытия.

В 80-х ДиМарцио исследовал звукосниматели, чтобы разработать звукосниматели для первой копии Red Special от Guild.В это время магнит был повернут, чтобы изменить его полярность, и провода, припаянные к стойкам, были заменены, чтобы имитировать катушку, подключенную назад — «катушка с обратной намоткой» -. Это сделало Брайаном Мэем предпочтительную комбинацию бриджа хамбакера и средних звукоснимателей.

Переключатели звукоснимателей на электрогитаре Брайана Мэя

Система смены звукоснимателей — одно из самых заметных отличий Red Special от любой другой гитары. Большинство гитар имеют трех- или пятипозиционный селекторный переключатель для выбора одного из двух или трех звукоснимателей.У «Старушки» шесть переключателей.

Когда он был первоначально создан, Брайан тестировал различные конфигурации для подключения звукоснимателей. Датчики могут быть подключены параллельно или последовательно, а также подключены по фазе или против фазы. Мэй не мог выбрать только одну или две настройки. Вот как они с Гарольдом создали матрицу переключателей, которая дала ему большую гибкость. Пикапы подключены последовательно. Верхний ряд переключателей включает или выключает каждую из трех пэдов. Нижний ряд переключателей меняет полярность каждого датчика, изменяя фазу.Таким образом, гитара обеспечивает универсальность звука. Брайан нередко меняет настройки во время песни, во время записи Bohemian Rhapsody он использовал почти все комбинации.

Гитарный бридж Брайана Мэя

Мост изготовлен из алюминия по меркам самого Мая. Чтобы уменьшить трение, бридж был дополнен роликами, позволяющими струнам возвращаться в идеальную настройку после использования тремоло. Таким образом, он устранил проблему, с которой обычно сталкиваются системы тремоло, которые не возвращаются в исходное положение, влияющее на настройку музыкального инструмента.

Брайан сделал каждый из роликов, используя ручную дрель как своего рода ручной токарный станок. Ролики не прикреплены к мосту, поэтому веревка, упавшая во время выступления, означает, что ролик упадет и потеряется. Поэтому запасные ролики необходимо всегда иметь под рукой.

Тремоло «Special Red»

Система тремоло изготовлена ​​из старой закаленной стали с V-образной формой лезвия и кромкой и двумя пружинами клапана двигателя мотоцикла — некоторые говорят, что они от Norton, а другие утверждают, что они от Panther 1928 года — для противодействия натяжению струн, которые составляет 36 килограммов или 79 фунтов.

Натяжение пружин можно отрегулировать с помощью винтов, которые проходят через середину пружин, входят или выходят через два небольших отверстия для доступа на стороне кнопки на заднем ремне.

Отец и сын провели три теста, прежде чем принять окончательный вариант дизайна. Трение сводится к минимуму, как обсуждалось с Zero Fret, выравнивая струны по передней бабке и роликам моста.

Рычаг тремоло состоит из держателя багажника или велосипедного рюкзака с острием спицы от матери Брайана.

Эта система была инновационной и эффективной, поэтому Брайану много раз предлагали запатентовать ее, но, по словам пользователя m : «Патенты — это головная боль, и почему бы не поделиться всем с миром?»

Встроенная схема искажения

Изначально гитара имела встроенную схему дисторшна. Брайан взял пух Vox, адаптировал и установил его внутри тела. Переключатель находился рядом с переключателями звукоснимателей. Позже Мэй обнаружила, что она предпочитает звук Vox AC30 с искажениями на полной мощности.В итоге он удалил цепь. Отверстие переключателя теперь закрыто перламутровой звездой, хотя какое-то время оно было закрыто изолентой.

«Красная книга» Брайана Мэя и ее история

В 2014 году к празднованию 50-летия инструмента Мэй вместе с Саймоном Брэдли написал книгу о конструкции и истории гитары Брайана Мэя: «Red Special Брайана Мэя: история самодельной гитары, которая потрясла. Королеве и миру.”

Видео презентации книги «Red Special Брайана Мэя» и ее истории

Восстановление Red Special

В 1998 году Брайан принес гитару Red Special австралийскому мастеру Грегу Фрайеру для точной настройки. Спорили, восстанавливать или нет. Музыкант не сомневался в этом и поручил Грегу восстановить его.

Грег сказал, что шея была прямой, хотя натяжитель ни разу не пришлось регулировать за всю историю Red Special — то есть более 30 лет.

Вы можете увидеть фотографии кишок из «Red Special» на сайте Грега Фрайера.

Но восстановление Red Special и точная настройка были не единственной работой, которую Мэй поручила Фрайер. Он также попросил построить две копии Red Special, которые Брайан будет использовать в качестве запасных частей для своей столь любимой «Red Lady».”

Брайан и Red Special, неразлучная пара

Брайан Мэй, несмотря на все предупреждения, берет гитару, где бы он ни играл, где бы она ни находилась. Его набор дополнен несколькими репликами, которые он также попеременно использует в своих выступлениях, некоторыми акустическими гитарами и телекастерами.

Но, как и все остальное, есть несколько исключений, в которых Мэй не появляется со своим любимым Red Special в истории мифической британской группы Queen.

раз, когда вы не использовали специальный

Был один случай, когда Старуху не использовали, и это было в клипах на «We Will Rock You» и «Spread Your Wings», которые были сняты вместе.Видео были сняты на снегу, и гитарист не хотел подвергать Red Special таким условиям. Вместо него он использовал копию, сделанную мастером Джоном-Берчем. Эта гитара была полностью сделана из клена с отделкой под натуральное дерево. Он также использовался в качестве резервной копии на сольных концертах, пока не был уничтожен в мае во время выступления.

Еще одна возможность, в которой не использовалось «красное», была в видео «Play the Game».Вместо этого он использовал дешевую копию Fender Stratocaster, поскольку в какой-то момент в видео певец Queen Фредди Меркьюри выхватывает гитару у Брайана Мэя и затем бросает ее ему. Еще одно видео, в котором не было красного выпуска, было «Princes of the Universe», где музыкант использовал белый Washburn RR11V. Причины неизвестны. Инструмент часто принимают за Джексон Рэнди Роудс. Он также записал оригинальную «Crazy Little Thing Called Love» на Fender Esquire барабанщика Queen Роджера Тейлора, но до 1992 года исполнял видео и живые исполнения песни на Fender Telecaster.

. Без сомнения, история Red Special увлекательна и увлекательна.

Красный Special и его копии

В песне Брайана Мэя «Rig Rundown», который играл на Premier Guitar во время тура Queen в 2014 году, вы могли увидеть гитары, которые использует музыкант.

У музыканта, конечно же, есть Red Special, с помощью которой он исполняет большинство песен, за исключением нескольких.Вторая гитара, запасная на тот случай, если вы разрежете аккорды с помощью Red Special. Это одна из реплик, сделанных Грегом Фрайером, довольно точная копия Красной леди. Это используется только тогда, когда у Старухи порвалась веревка и пока техник не заменит ее на новую веревку.

Техник Пит Маландрон говорит, что Брайан использует струну калибра 0,09. Довольно легкий, но раньше использовал 0,08, но очень часто режет струну, тем более что она играет монетой вместо медиатора.Он поясняет, что держит монету очень осторожно, поэтому роняет много монет, вероятно, около 10 за ночь, говорит он.

Третья гитара — еще одна копия «Old Lady», сделанная английским мастером Эндрю Гайтоном. Это «Green Special», так как у него зеленая отделка. Он настроен на Drop-D и используется только для песни «Fat Bottomed Girls». Четвертая гитара — это еще одна гитара Грега Фрайера, настроенная на Drop D и являющаяся заменой зеленой. Особенность этой гитары в том, что звукосниматели у нее немного горячее, чем у остальных.

The Queen’s Jewel, Red Special Guyton «Boutique»

Пятая и последняя гитара — еще одна гитара Guyton, это «Red Special», но «Boutique». Этот инструмент — истинная красота с особенностями, которые делают его неповторимым. У него арочный верх вместо классического плоского. Верх выполнен из очень эффектного стеганого клена. В нем есть f-отверстие, как и в оригинальном дизайне Red Lady. Очень бросается в глаза то, что накладка еще и дугообразная. Наконец, у него есть фиксированный мост и внутренний пьезодатчик.Эта гитара используется для соло в «Crazy Little Thing Called Love».

Для получения дополнительной информации о гитаре посетите сайт Грега Фрайера.

Сообщение по теме: Blackie Эрика Клэптона: история великого Fender Stratocaster и Black Strat Дэвида Гилмора и его невероятная история.

Вы можете поделиться мнением или поговорить об этом и многом другом с другими музыкантами в разделе комментариев.

Сравнить статьи

2014 BMW X1 xDrive35i Проверено

Любой, кто обращал внимание на то, как мы освещаем новейшие модели BMW, знаком с уверенным движением компании в будущее — и несколько далеким от основных ценностей, которые традиционно привлекали к бренду энтузиастов.Стремление к чистому удовольствию от вождения, которое когда-то определялось всеми BMW, ослабло перед натиском перегруженных технологиями интерьеров, адаптивных подвесок, электроусилителя рулевого управления и тяжелых бордюров. Энтузиасты беспокоятся о кончине великих BMW, таких как E39 5-й серии, E38 7-й серии и E90 3-й серии, но волшебство этих автомобилей живет в одном из старейших дизайнов, продаваемых сегодня баварским автопроизводителем. -колесный привод X1 xDrive35i тестировал здесь.

Автомобиль с неприязнью к отстой

X1 xDrive35i еще не прошел полностью процесс модернизации, который превратил 5-ю серию в плавучую баржу и стоил 3-й серии великолепного ощущения рулевого управления, и он по-прежнему обладает надлежащим рядным двигателем. -шесть (хотя и с турбонаддувом), гидроусилитель руля, приглушенный дизайн интерьера и подвеска, которая фактически была настроена вместо того, чтобы получить кучу электронных настроек.Его единственная уступка BMW новой школы — его необычный стиль кузова, который занимает определенную нишу и находится где-то между универсалом и кроссовером. Этот самый маленький спортивный автомобиль BMW Sports Activity Vehicle на самом деле представляет собой более высокий универсал E90 3-й серии, автомобиль, с которым X1 разделяет большую часть своей основы.

Скудная наклейка на стекле нашего тестового автомобиля усилила его старинный вид BMW; Приятно отсутствие таких опций, как iDrive и сопутствующие элементы управления. Это оставило после себя чистую приборную панель с настоящими кнопками и ручками и аналоговым рычагом переключения передач (четырехцилиндровый X1 xDrive28i получил электронный джойстик).Панорамный люк, передние сиденья с электроприводом, ксеноновые фары и Bluetooth входят в стандартную комплектацию. Мы бы добавили обогреватели сидений, доступные в пакете Cold Weather за 550 долларов. В нашем автомобиле был только комплект Sport Line за 1900 долларов (18-дюймовые колеса, спортивные сиденья; есть также базовые, xLine и M Sport), краска Valencia Orange за 550 долларов и бесплатная (и убедительная) псевдокожа, в результате чего получилась относительно скромная. (для современного шестицилиндрового BMW) цена 41975 долларов.

Шесть цилиндров подряд

X1 xDrive35i оснащается таким же турбонаддувом 3.0-литровый рядный шестицилиндровый двигатель, который находится под капотом почти любого другого BMW, вырабатывает 300 лошадиных сил и 300 фунт-фут крутящего момента. Он подключен к шестиступенчатой ​​автоматической коробке передач с прекрасным переключением, и в наших руках комбинация была хороша для разгона от 0 до 60 миль в час за 5,2 секунды (на секунду быстрее, чем у четырехцилиндрового xDrive28i), но дала скудные результаты. 17 миль на галлон (на 6 меньше, чем у xDrive28i). Холодная погода и заснеженное движение не помогли с точки зрения экономии топлива.

Когда движение прервалось, мы обнаружили, что 35i ехал по белой дороге без драматизма.Тяга на прямой или на поворотах была отличной, несмотря на спортивные 18-дюймовые всесезонные шины Pirelli X1, работающие на спуске. Контроль устойчивости может быть полностью отключен, чтобы обеспечить легкий занос (если это вам нравится), благодаря смещению крутящего момента назад в настройке xDrive, хотя мозг системы быстро переключал крутящий момент на переднюю ось, когда это было необходимо. Когда-то знакомый BMW твердый, но в то же время послушный баланс между ходовыми качествами и управляемостью производил впечатление при любых условиях. Этот 35i был маневренным, но ехал лучше, чем наш многолетний тестер X1 xDrive28i M Sport, благодаря меньшим колесам, шинам с более высоким соотношением сторон и неспортивной подвеске.Заснеженный троллейбус не позволил нам зафиксировать показатель сцепления для X1, но мы зафиксировали 0,82 г для примерно на 100 фунтов легче, не M Sport xDrive28i с аналогичными шинами. Педаль тормоза 35i была линейной и легко регулируемой — благо на скользких дорогах, с которыми мы сталкивались, — а стопоры возвращали твердую 163-футовую остановку на скорости 70 миль в час.

Помимо безупречной динамики, 35i больше всего восхищает ощущением . Двери выглядят великолепно. . в закрытом состоянии. Кузов кажется твердым, как гранит, большая шестерка впереди издает душевный звук, и, не отвлекаясь от iDrive, водители должны управлять только . Конечно, универсал 3-й серии такого же размера предлагает почти такое же удовольствие от вождения, но это BMW новой школы, и вы не можете получить его здесь с рядной шестеркой.

Знатоки должны купить 128i — последний BMW, предлагающий безнаддувный рядный шестицилиндровый двигатель, — если таковые остались в продаже у дилеров теперь, когда он был заменен четырехцилиндровым двигателем 228i с турбонаддувом. Но если вам абсолютно необходимо удобное заднее сиденье (даже если X1 немного тесноват) или дополнительный набор дверей, X1 xDrive35i — второй по популярности BMW-подобный BMW, который вы можете купить сегодня.Действуйте сейчас, прежде чем оно тоже будет «усилено» современностью.

Технические характеристики

ТИП АВТОМОБИЛЯ: с передним расположением двигателя, полный привод, 5-местный, 5-дверный универсал

ЦЕНА ПО ИСПЫТАНИЮ: 41975 долларов (базовая цена: 39 725 долларов)

ТИП ДВИГАТЕЛЯ: с турбонаддувом и 24-клапанный рядный 6-цилиндровый двигатель с промежуточным охлаждением, алюминиевый блок и головка, прямой впрыск топлива

Рабочий объем: 182 куб. дюймов, 2979 куб. 1300 об / мин

ТРАНСМИССИЯ: 6-ступенчатая автоматическая с ручным режимом переключения

РАЗМЕРЫ:
Колесная база: 108.7 дюймов
Длина: 176,5 дюйма
Ширина: 70,8 дюйма Высота: 60,8 дюйма
Снаряженная масса: 3926 фунтов

C / D РЕЗУЛЬТАТЫ ИСПЫТАНИЙ:
От нуля до 60 миль в час: 5,2 секунды
От нуля до 100 миль в час: 13,2 секунды
От нуля до 120 миль в час: 19,6 секунды
Старт с места, 5-60 миль / ч: 5,8 с
Высшая передача, 30-50 миль / ч: 3,0 с
Высшая передача, 50-70 миль / ч: 4,1 с
-Миля стоя: 13,8 сек @ 102 миль / ч
Максимальная скорость (ограничена регулятором): 128 миль / ч
Торможение, 70-0 миль / ч: 163 фута

ЭКОНОМИЯ ТОПЛИВА:
Вождение EPA по городу / шоссе: 18/27 миль на галлон
C / D , наблюдаемое: 17 миль на галлон

Этот контент создается и поддерживается третьей стороной и импортируется на эту страницу, чтобы помочь пользователям указать свои адреса электронной почты.