Фуджита нео 8000: Fujida Neo 8000. Радар-детектор с GPS — RallySale.ru Продажа спортивных автомобилей, гоночной техники и экипировки для автоспорта. Работа. Аренда и тюнинг машин

Содержание

Проверенная классика и инновации: тест радар-детектора Fujida Neo 8000

Очередной попавший к нам на тест радар-детектор – это Fujida Neo 8000, гибрид радиоприемного радар-детектора и GPS-информатора.

Устройство собрано в классическом по меркам РД корпусе, покрытом приятной на ощупь софт-тач краской, с удобным колесиком регулировки громкости, штыревым разъемом питания и mini-USB для обновления базы данных координат радаров.

Крупные разнесенные кнопки на спине прибора позволяют управлять им фактически вслепую: оперативно менять яркость экрана и переключать режимы (город-трасса-смарт), а также входить в режим настроек.

Дисплей NEO 8000 – текстовый однострочный OLED. Четкий и хорошо читаемый и на солнце, и ночью благодаря регулировке яркости, которую можно менять вручную, или выставить режим «авто». В этом случае яркость будет меняться по датчику освещенности автоматически. Удобный, надо сказать, режим, который встречается не в каждом РД.

Настройки прибора оформлены в виде закольцованного списка. Перебирая их по очереди, можно активировать и выключать отдельные диапазоны, задавать лимиты максимальной скорости, при превышении которой будет звучать сигнал, выбирать звук для радаров разных диапазонов и типов камер, контроля светофоров и полосы общественного транспорта. Там же можно выставить время часов и дату. Настройки просты, поскольку представляют собой не сложные аббревиатуры, а бегущую по экрану строку без лишних сокращений, которая вдобавок дублируется голосом.

Адаптер питания имеет, как и все гаджеты Fujida, гнездо для подключения второго потребителя с разъемом прикуривателя. Это удобно, когда гнездо 12 вольт в машине одно-единственное: можно вместе с антирадаром подключить зарядку телефона.

В работе

Прибор построен на качественном брендовом «железе». В его основе лежит процессор марки Nuvoton Technology — тайваньской компании-производителя микропроцессоров и микроконтроллеров, подразделения одного из крупнейших в мире производителей флеш-памяти Winbond Electronics.

Чипы Nuvoton стоят в устройствах Dell, Intel, Acer, Asus, LG, Samsung и других.

Приемник NEO 8000 – супергетеродин с дальнейшей цифровой обработкой сигнала. Работает в диапазонах K, Ka, Ku, X, лазерном 800-1100 нм. Имеется поддержка режимов Ultra-K, Ultra-Ka, Ultra-Ku, Ultra-X, POP, Instant-On. Также камеры, радары и системы контроля на светофорах и автобусных полосах обнаруживаются по координатам базы ГЛОНАСС/GPS приемника, которая обновляется с официального сайта марки www.fujida.su. Освежаются данные регулярно: на момент подготовки материала (22 ноября) на сайте имелись свежие базы от 15.11.2017.

Многие бюджетные детекторы грешат утомительным характером сигналов. Как вызванных помехами, так и в принципе назойливыми оповещениями. И не везде их можно откорректировать настройками. В Fujida Neo 8000 за характер оповещений отвечает режим «Smart», в котором чувствительность и автоприглушение сигналов зависят от реальной скорости автомобиля, определяемой посредством GPS. К примеру, на фактической скорости до 40 км/ч разогнаться до получения штрафа практически нереально, поэтому дистанция обнаружения снижена до 200 метров. На скорости до 60 км/ч дистанция обнаружения составляет 500 метров, 70 км/ч – 700 метров, 80 км/ч – 800 метров, 100 км/ч – 900 метров, 120 км/ч – 1000 метров, выше 120 км/ч – 1 200 метров.

В режиме «Москва» детектор отключает радиоприемную часть, поскольку в мегаполисе уровень помех просто зашкаливает, с ними не справится никакая фильтрация. В этом режиме работает только GPS-информирование, ибо в городах практически не используются радары-засады: почти все камеры стационарные и записаны в обновляемую базу координат.

Правда, даже в Москве мне встречались новые передвижные комплексы «ОСКОН» — радары, работающие в К-диапазоне, смонтированные на крышах белых микроавтобусов Peugeot Boxer. И если летом они стояли в основном на загородных шоссе, то этой осенью я уже пару раз натыкался на них в Москве. Тут детектор будет бессилен: радиоприемная часть в мегаполисе выключена, а координат «ОСКОНов» в базе обычно нет, поскольку радар предельно мобильный… В этом случае ни Fujida Neo 8000, ни какой-либо иной радар-детектор не избавляет от необходимости поддерживать некоторую бдительность.

В целом же радиомодуль NEO 8000 способен определять комплексы контроля скорости Стрелка, Кордон, Крис, Крис-П, Искра, Радис, Арена, Бинар, Беркут, Сокол, ВКС, Барьер-2М, ПКС-4, Визир, АМАТА и маломощные устройства типа Кордон-М. Все больше камер работают без излучения по принципу анализа фото и видео высокой четкости по заданному алгоритму. С ними NEO 8000 справлялся за счет GPS-обнаружения. Это не только пресловутая «Автодория», но и «Поток ПДД», комплекс «Автоураган» и прочие.

За время тестирования пропущенных радаров отмечено не было. Все предупреждения подавались своевременно, а при приближении к радару на расстояние прямой видимости (около 50 метров) на экране детектора возникала надпись «PASS» (видимо, от выражения «pass out of sight» — исчезать из виду). Согласно инструкции, в этот момент самое время поглядеть по сторонам, разглядев радар глазами и убедившись в его существовании.

Кстати, нельзя не отметить фирменное достоинство Fujida Neo 8000 – три варианта крепления его в салоне автомобиля. В комплекте прибора имеются классический держатель на лобовое стекло на присосках, силиконовый нескользящий коврик для установки детектора на торпедо, а также магнитная «таблетка» с самоклеящимся скотчем 3M, с помощью которой можно крепить NEO 8000 даже на козырек приборной панели.

Радар-детектор или смартфон?

У некоторых автовладельцев сегодня возникают сомнения в актуальности радар-детекторов как класса гаджетов ввиду распространения бесплатных и платных программ для смартфонов, информирующих о дорожных камерах. Если не учитывать возможность радар-детектора обнаруживать камеры по эфирным сигналам, то GPS-функционал действительно практически одинаков и у смартфона, и у радар-детектора в виде отдельного устройства. Однако радар-детекторы не думают исчезать, постоянно появляются все новые и новые модели. Почему?

Во-первых, мобильные приложения – вещь не самая стабильная… Количество разновидностей смартфонов столь велико, что учесть все особенности и глюки каждой модели разработчик софта не в состоянии. В итоге обновление операционной системы или самого приложения нередко вызывают несовместимость, вылеты программы, проблемы с работой в фоновом режиме после принятого звонка и так далее. Во-вторых, жизнь смартфона заметно укорачивается от регулярной работы в режиме перегрева, а в держателе на лобовом стекле с включенным GPS, активным экраном и подсоединенной зарядкой телефону всегда жарко — летом от солнца, зимой от печки. Для радар-детектора с его объемным корпусом с хорошим охлаждением и отсутствием аккумулятора и «энергожрущего» дисплея это неактуально. В-третьих, забытый на стекле смартфон в случае кражи обойдется вам существенно дороже, нежели забытый там же радар-детектор, на который не каждый наркоман позарится. Так что не всегда «комбайн» лучше узкоспециализированного гаджета!

Классический или «сигнатурный»?

У Fujida Neo 8000 традиционный для радар-детекторов приемник, реагирующий на уровни сигнала в определенных диапазонах. Однако в последнее время распространились так называемые «сигнатурные радар-детекторы». Сигнатура – это характерные признаки, по которым можно распознать что-либо. В данном случае имеются в виду сигнатуры работы разных типов радаров. Приемник обычного радар-детектора просто распознает признаки работы передатчика на определенных частотах и, к сожалению, не всегда хорошо отличает их от помех. А сигнатурный распознает именно вид и последовательность сигналов и сравнивает их со своей базой сигнатур-семплов. И подает голос только при совпадении. Поэтому «сигнатурники» должны гораздо лучше сопротивляться помехам. Но, как известно, на следующий день после изобретения круглого колеса квадратные должны исчезнуть как класс… Почему же «сигнутарники» еще не вытеснили полностью детекторы с классическими приемниками?

Комментирует основатель крупнейшего в рунете форума о радар-детекторах Владимир «MONO»:

— Проблема сигнатурных РД в том, что мощности процессоров большинства из них не хватает для обработки потока данных – того самого сравнения в режиме реального времени. В результате случаются пропуски. На данном этапе себестоимость полностью работоспособного «сигнатурника», каким он должен быть, составляет около $400. Моделей в этом сегменте сейчас очень много, но наиболее удачные, на мой взгляд — те, которые фильтруют сигнатуры помех, не пытаясь определить конкретный тип радара. Остальные, скорее, просто название. Мне случалось видеть «сигнатурники», у которых помех было больше, чем у хорошего среднего РД с классическим приемником, и те, которые, наоборот, пропускали реальные сигналы.

Так что «классику» еще рано списывать со счетов! Однако если вы по-прежнему пользуетесь стареньким детектором без функции GPS-обнаружения, то его явно пора списывать на пенсию, как и многие другие гаджеты 10-15-летней давности. Хотя и продвинутый радар-детектор с GPS может работать не в полную силу, если владелец игнорирует или забывает обновлять базы камер и радаров. Старайтесь делать это не реже, чем раз в 1-2 месяца, и тогда устройство вас не разочарует.

Отзывы Fujida Neo 8000 | Радар-детекторы Fujida

Подробные характеристики

Приемник

Диапазон K: 24050 — 24250 МГц

Диапазон Ka: 33400 — 36000 МГц

Диапазон Ku: 13400 — 13500 МГц

Диапазон X: 10475 — 10575 МГц

Детектор лазерного излучения: есть, 800-1100 нм

Угол обзора лазерного детектора: 360°

Поддержка режимов: Ultra-K, Ultra-Ka, Ultra-Ku, Ultra-X, POP, Instant-On

Приемник сигнала (радиоканал): супергетеродин

Обработка сигнала (радиоканал): цифровая

Настройки

Режим Город: есть

Режим Трасса: есть

Режим Авто: есть

Отключение отдельных диапазонов: есть

Функции

Обнаружение радаров типа «Стрелка»: есть

Обнаружение радаров типа «Автодория»: есть

Обнаружение радаров типа «Robot»: есть

Обнаружение радаров типа «Кордон»: есть

Определение координат: ГЛОНАСС, GPS, база стац. радаров

Электронный компас: есть

Антисон: есть

Отображение скорости автомобиля: есть

Вывод информации

Отображение информации: символьный дисплей

Регулировка яркости: есть

Регулировка громкости: есть

Голосовое оповещение: есть

Отключение звука: есть

Корпус

Крепление: на присоске, на коврике, на магните

Дополнительно

Потребляемый ток: 150 мА

Рабочая температура: -30 — 70 °C

Дополнительная информация: режим SMART, OLED дисплей с автоматической регулировкой яркости в зависимости от освещения

Перед покупкой уточняйте технические характеристики и комплектацию у продавца

Радар-детектор Fujida Neo 8000, описания, характеристики, отзывы покупателей

Радар-детектор Fujida Neo 8000 детектирует сигналы всех используемых в России и СНГ радарных диапазонов, а также лазерных сигналов. Благодаря Fujida Neo 8000 водитель сможет заранее обнаружить все типы радаров ГИБДД, и вовремя снизить скорость, чтобы не получить штраф.

Преимущества бренда Fujida:

Среди многих достоинств авто гаджетов от корейского бренда Fujida можно выделить следующие:

обнаружение всех видов измерителей скорости
еженедельное бесплатное обновление базы камер и радаров
возможность самостоятельного добавления камеры в базу
богатая комплектация — несколько видов крепления, кабель питания с предохранителями, USB провод для обновления
дополнительные функции АнтиСон и калибровка скорости по GPS
напоминание о необходимости обновить базу
обнаружение камер контроля на светофорах и автобусной полосе

Особенности радар-детектора Fujida Neo 8000

Режим SMART изменяет чувствительность радар-детектора в зависимости от скорости автомобиля, смена режимов «Город»и «Трасса» происходит автоматически.
Высокотехнологичный процессор второго поколения Nuvoton с технологией EXTREME SENSITIVITY PLATFORM^® (ESP^®) увеличивает чувствительность и дальность обнаружения.
Белый контрастный OLED дисплей автоматически регулирует яркость в зависимости от освещения.
Калибровка скорости позволяет скорректировать отображение скорости на радар-детекторе согласно реальной скорости автомобиля.
Высокочувствительная приемная линза ловит комплексы LASER на 360°.
Радиомодуль способен определять радары Стрелка, Кордон, Крис, Крис-П, Искра, Радис, Арена, Бинар, Беркут, Сокол, ВКС, Барьер-2М, ПКС-4 и Визир.
Лазерный модуль способен определять радары АМАТА, ЛИСД, ЛИСД 2.
GPS-приемник совместно с обновляемой базой данных камер России способен определять современные «малошумные» камеры (Кордон, Кречет, Mesta, Рапира, Вокорд «Циклоп», RedSpeed), камеры без радарного блока (Робот, Multiradar, Одиссей, Автоураган) и «парные камеры», вычисляющие среднюю скорость (Автодория), камеры контроля светофоров и автобусных полос.
Технологии Intellect Alert и фильтр слабых сигналов уменьшат количество ложных срабатываний.
Фильтр скорости сократит количество предупреждений о радарах, если водитель не превышает установленный лимит скорости.
Функция «Моя скорость» предупредит водителя о превышении установленного порога скорости.
Функция «Автоприглушение» автоматически уменьшает громкость звукового оповещения через 7 секунд после обнаружения сигнала радара скорости.
Голосовые оповещения с возможностью отключения. 9 разных типов звуков для каждого диапазон
Еженедельное бесплатное обновление базы камер через USB.
Напоминание о необходимости обновить базу камер.

Комплектация:

Радар-детектор Fujida Neo 8000
гарантийный талон
инструкция
липкий коврик
магнитное крепление
крепление на лобовое стекло
провод питания
USB-провод

Гарантия производителя 3 года.

✅ антирадар гибдд

В июле исполняется два года с момента введения в действие автоматизированной системы фото- и видеофиксации нарушений правил дорожного движения. ГИБДД отмечает, что только за прошлый год камеры на дорогах выявили более двух миллионов нарушителей. В тоже время эксперты говорят, что видеофиксаторы не совершенны и водители, по их словам, уже научились обманывать умную электронику. У нас очень часто спрашивают есть ли глушилки дорожных камер ДПС. К сожалению, таких моделей пока нет, и это обуславливается принципом работы подавителей. Все дело в том, что глушилкам камер необходимо минимум секунд 10 для старта и генерации помех. Машина быстрее проедет видеофикатор, чем сработает глушилка, а если ехать с той скоростью которая позволит ей сработать то теряется смысл – превышения скорости явно не будет. К тому же, большинство камер ГИБДД ведут запись на носитель, а передают только данные о скорости или ином нарушении (например, пересечение двойной сплошной линии). Однако отчаиваться не надо, можно найти выход из ситуации. Например одним из вариантов будет являться подавление сигнала передачи данных о Вашем местоположении: датчик скорости не сможет определить Ваши координаты и соответственно, рассчитать скорость перемещения.
антирадар 800
рейтинг антирадаров 2019 5 лучших
штраф за антирадар в россии
купить глушилку камер anticam в Твери
Все чаще мне стала попадаться реклама чудодейственных глушилок, позволяющих избежать штрафов с камер видеофиксации нарушений ПДД. Компактные устройства вставляются в прикуриватель, после чего можно забыть о письмах счастья, — так говорят продавцы. Но действительно ли прибор может заглушить передачу данных или мы опять столкнулись с мошенничеством? Давайте разбираться. В стародавние времена отечественные автомобилисты использовали антирадары, предупреждающие о гаишных засадах. С развитием технологий в ход пошли приложения для смартфонов, оповещающие о камерах фиксации нарушений, ее типе и скоростном режиме, который она отслеживает. Вместе с тем в продаже встречаются так называемые глушилки сигнала с камер. Внешний вид устройства забавляет — этакий микро-роутер, вставляющийся в прикуриватель. Стоит ли раскошеливаться на подобное устройство?

Отзывы антирадар гибдд

Камеры видеофиксации записывают или передают информацию при срабатывании какого-либо триггера, например датчика движения, открытия двери или проезда автомобиля в заданном месте или по времени. Т.е. запись производится единовременно и далее камера ожидает следующего срабатывания. Чаще всего такие камеры делают фото, либо записывают короткий видеофайл. Отзывы о антирадар гибдд

Реальные отзывы о антирадар гибдд.

Где купить-антирадар гибдд

антирадар рейтинг 2019 отзывы 5 лучших моделей купить глушилку камер anticam в Стерлитамаке антирадары рейтинг 2019 отзывы лучших

Рациональнее купить прибор заводского изготовления. По стоимости он будет равен самоделке, но эффективность и срок службы иной. Покупка прибора заводского изготовления станет удачным приобретением, поскольку имеет сертификат качества. Работники гаи не уличат в махинациях, поскольку производство глушилки официально разрешено.

антирадар сильверстоун ф1 монако

Интересный эксперимент провели с номерным знаком, специально перевернув его. Система видеонаблюдения квалифицировала предмет, как неопознанный. И это успех, поскольку автомобиль с нечитаемыми регистрационными номерами обязательно остановят на полицейском дорожном посту для выяснения. За подобное нарушение выписываются приличные штрафы.

Комплексы видеофиксации установлены как минимум в 17 регионах страны, в общей сложности их около трех тысяч, в основном они фиксируют превышение скоростного режима.

Ещё где посмотреть антирадар гибдд:Где в Новочеркасске купить глушилку AntiCamантирадар гибдд
Где в Камышине купить глушилку AntiCam, Где в Камышине купить глушилку AntiCam
антирадар гибдд,антирадар рейтинг 2019 отзывы 5 лучших моделей, глушилка камер гибдд
антирадар сильверстоун ф1 монако.

Smart Driver – удобный радар камер и ДПС, а так же видеорегистратор в одном приложении. Предупредит где камеры ГИБДД на дороге, в том числе укажет их тип.тогда можно выбрать Smart Driver АнтиРадар: детектор камер ГИБДД и ДПС. Это действительно один из самых удобных и приятных интерфейсом радаров и он. Smart Driver АнтиРадар для Андроид – многофункциональная программа для всех автовладельцев способное своевременно реагировать на камеры ГИБДД и ДПС. Смарт Драйвер имеет поддержку самых популярных навигационных. Бесплатно. Android. SmartDriver – незаменимое приложение для водителей, которое объединяет в себе видеорегистратор и предупреждения об опасностях на дороге. Если при приближении к опасному участку Ваша скорость будет выше. Радардетектор — это пассивный приемник, в отличие от антирадара не. По данным ГИБДД России, за прошлый год водителям за нарушения ПДД было выписано свыше 108 млн постановлений. Прирост по отношению. Smart Driver АнтиРадар лучший детектор камер ГИБДД и ДПС по России на Андроид. Приложение работает без подключения к интернету, но он необходим для обновления базы данных. Разумеется, данная утилита применяется.Driver Антирадар от разработчиков HUD Speed и GPS Антирадар (предыдущее. SmartDriver – незаменимое приложение для водителей, которое объединяет в себе видеорегистратор и предупреждения об опасностях на дороге. SmartDriver Антирадар ГИБДД. от Reactive Phone Ltd. Новый смартфон. АнтиРадар для смартфона!!! Работает 100%. интернетмагазин антирадаров и видеорегистраторов в Белгороде. Кроме служб ГИБДД данные о проезде транспортных средств могут использоваться органами внутренних дел, подразделениями ФСБ, таможенными и налоговыми. Если сотрудник ГИБДД все же хочет выписать штраф за антирадар. Будут ли запрещать антирадар? Уже только невнимательный или же не имеющий Интернета водитель не в курсе – ГИБДД, якобы, начинает выписывать штрафы.

Официальный сайт антирадар гибдд

Базы для радардетекторов. Вы всегда сможете бесплатно скачать актуальную базу данных радаров и камер ГИБДД на официальном сайте компании Fujida. В базу камер входят РФ, Европа И СНГ (в том числе Казахстан, Кыргызстан, Белоруссия, Армения, Азербайджан и Украина). Базы для комбоустройств. Для корректной работы плеера Fujida необходимо установить дополнительное ПО на ваш компьютер. ОБНОВЛЕНИЕ ПРОШИВКИ 1. Скачайте архивный файл с новой базой камер в соответствующем разделе для вашего устройства. Наверх. erozhe › Блог › обновить радардетектора Fujida Neo 8000. загрузилось автоматически, бегу в авто держу кнопки DIM и CITY и врубаю питание, после голосового уведомления отпускаю кнопки, всё обновилось! Недавно был приобретён радар—детектор Fujida Neo 8000. Не буду особо расписывать его качества, думаю много подобных приборов на рынке, работает от загруженной базы. Недавно был приобретён радар—детектор Fujida Neo 8000. Полный размер. Полный размер. Не буду особо расписывать его. Радардетекторы Incar являются отличным примером совмещения нескольких разных возможностей в одном устройстве. При этом база данных в этом случае обновляется точно так же, как и на прочих антирадарах. Не знаю про другие апаараты этой фирмы, но с Karma Hara так: Официальный сайт предлагает обновлять либо с помощью программы обновления, ссылку на которую они не приводят, либо через карту памяти, что приводит к зависанию на этапе обновления прошивки,. Обновление. Как его обновлять ?! На одном компьютере обновил, получилось, зашёл на официальный сайт. зайдите на оф сайт этого Г.дивайся: [Fujida], только отключите антивирус и лучше заходить через Яндекс браузер, т.к нормальные браузеры отказываються скачивать эту прошивку и обновления. Отправить. Обновим радар детекторы Incar GPS SDR 05, SDR 10, SDR 20. Fujida Karma S проезд камеры Тест комбоустройств. Очень крутой видеорегистратор с антирадаром Ambarella A7LA50 Тест видеорегистратора с радардетектором Ссылка. Для комфортного использования радардетектора мы рекомендуем своевременно обновлять базу камер ГИБДД и. Прошивка — программа управления функциями радардетектора, меню, голосовыми, звуковыми сообщениями, работой дисплея, gpsдатчика и другими аппаратными средствами радардетектора. Радардетектор Форум Отзывы Антирадары | Радардетекторы. Детектор: Fujida neo 7500. Авто: Lada Vesta SW. Эта страница была найдена по запросам: фуджида 7500 обновить базу камер. Обновим радар детекторы Incar GPS SDR 05, SDR 10, SDR 20. Хоть в названии ролика и перечислены конкретные модели. Fujida Karma S проезд камеры Тест комбоустройств: dvizhok.su/gadgets/testkomboustrojstvafujidakarmas Сайт: nbsp Радардетектор. Fujida Karma Slim поддерживает технологию iSignature, эффективно снижая количество ложных срабатываний от датчиков мертвых. Радардетектор определяет излучение от используемых в России камер контроля скорости. Разработчики Fujida Karma S решили не изобретать велосипед и сделали внешний вид прибора привычным для большинства автомобилистов. В принципе, скорее всего именно так и должно выглядеть комбо, напоминая чтото среднее между радардетектором и видеорегистратором. С другой стороны.

✅ антирадары фуджида

Смотр новых систем видеофиксации обнаружил, что обмануть видеорадары практически невозможно. Во время теста организаторы занимались заклейкой части номерного знака помасленной бумагой. Помещали регистрационный номер на радиатор. Камеры видеонаблюдения разгадали уловки организаторов мероприятия. Обман был обнаружен и изобличен. То есть номера идеально читались системой. Сегодня повсюду можно видеть большое количество камер видеонаблюдения. Они есть практически везде: в банках, магазинах, офисах, да и просто на улице. В большинстве своем камеры выполняют функцию обеспечения порядка, например в банках от грабежей, на дорогах – для обеспечения соблюдения правил дорожного движения и т.д. Однако в некоторых случаях, камеры могут быть использованы злоумышленниками для шпионажа, шантажа или иных действий злого умысла. В таком случае целесообразно использовать глушилки камер.
магазин антирадаров
антирадар скидка
neoline 4500 антирадар
антирадар neoline x cop 9000
AHD/TVI/Аналоговый сигнал подвержен воздействию электромагнитных помех, даже экранированный кабель не сможет полностью защитить сигнал от мощных наводок, создаваемых линиями высоковольтных передач или антеннами для спутникового телевидения, чем больше будет длина трассы от регистратора видеонаблюдения до камеры, тем больше кабель наловит помех. Полностью заглушить сигнал без помощи спец средств у вас вряд ли получится, а создать рябь и ухудшить качество картинки вполне возможно. Для цифровой IP системы передача осуществляется так же с помощью электрического сигнала, но регистратор и ip камера могут общаться между собой и исправлять ошибки при передаче сигнала, и картинка на выходе не пострадает. Однако у водителей появился новый способ ухода от штрафа, выписанного камерой ГИБДД. Об этом Новым известия рассказал президент Коллегии правовой защиты автовладельцев Виктор Травин. По его словам, уйти от ответственности можно путем обжалования штрафа, главное — сдать другого водителя. Если вам приходит письмо счастья (штраф из ГИБДД), то вы пишете заявление в орган, выписавший вам штраф, что за рулем был другой человек, — объясняет тонкости эксперт. — Предоставляете его номер, данные.

Отзывы антирадары фуджида

У нас очень часто спрашивают есть ли глушилки дорожных камер ДПС. К сожалению, таких моделей пока нет, и это обуславливается принципом работы подавителей. Все дело в том, что глушилкам камер необходимо минимум секунд 10 для старта и генерации помех. Машина быстрее проедет видеофикатор, чем сработает глушилка, а если ехать с той скоростью которая позволит ей сработать то теряется смысл – превышения скорости явно не будет. К тому же, большинство камер ГИБДД ведут запись на носитель, а передают только данные о скорости или ином нарушении (например, пересечение двойной сплошной линии). Однако отчаиваться не надо, можно найти выход из ситуации. Например одним из вариантов будет являться подавление сигнала передачи данных о Вашем местоположении: датчик скорости не сможет определить Ваши координаты и соответственно, рассчитать скорость перемещения. Отзывы о антирадары фуджида

Реальные отзывы о антирадары фуджида.

Где купить-антирадары фуджида

антирадар free Где в Чите купить глушилку AntiCam антирадар кобра 360 лазер инструкция

В России практика установки камер видеофиксации нарушений ПДД только начинается, но уже встречает серьезное сопротивление со стороны народных умельцев — использование глушилки от камер. За автомобилями на современных автобанах смотрят фиксирующие электронные приборы ГИБДД — камеры видеофиксации, вычленяющие из потока нарушителей ПДД (Правил Дорожного Движения). Европа давно привыкла к слежке за движением автотранспорта на автобанах.

купить антирадар silverstone

Что вообще собой представляет наше устройство- это усиленная gps глушилка, доработанная специалистами завода изготовителя вручную. В итоге Внешне это стандартная gps глушилка, но с усиленной начинкой. Обычная же gps глушилка не в состоянии как то влиять на камеру фиксации скорость.

Создаёт помехи в радиусе 15 м. Это полностью делает ваш автомобиль невидимым и неуязвимым . Вы перестаете получать многочисленные штрафы , наслаждаясь быстрой ездой . Этот подавитель GPS сигнала самый простой и удобный из тех, что используются в автомобилях. Он подавляет связь GPS (спутниковую связь) Этого достаточно, чтоб заглушить работу отслеживающих устройств.

Ещё где посмотреть антирадары фуджида:купить глушилку камер anticam в Пензеантирадары фуджида
антирадар фуджи, антирадар фуджи
антирадары фуджида,антирадар free, купить антирадар с камерой заднего вида
купить антирадар silverstone.

Качественная автоэлектроника Фуджида по доступным ценам. Радардетекторы, или антирадары – техника, которая предупредит вас о превышении скорости и предотвратит получение штрафа. Видеорегистраторы – компактные. Радардетекторы Fujida купить интернетмагазине АВТОПРОФИ.По всем вопросам покупки звоните по телефону 8 (800) 7009116. Этот прибор станет не только надежным спутником водителя в дальней дороге, предупреждая о мобильных и стационарных камерах. У нас вы можете купить радар детектор Fujida в Белгороде по выгодной цене. Вы можете сравнить цены на радар детекторы Фуджида от надёжных интернет. Комбоустройство Fujida Karma S: радардетектор, GPSинформер и видеорегистратор отзывы. Радардетектор, ночная съёмка, стабильностт работы. Недостатки: Режим syperHD профанация. Читайте также. Гаджеты / Видеорегистраторы. В знакомом облике: тест комбоустройства Fujida Karma S. Fujida Karma S – комбогаджет. Fujida Neo 7500 радардетектор с GPS базой полицейских радаров и камер, и отличным соотношением цены и качества. Белый контрастный OLED дисплей с 3мя уровнями яркости и режимом автоматической регулировки. Радардетектор Fujida Neo 8000 зарекомендовал себя как более чем достойное устройство. Девайс практически не беспокоит водителя ложными срабатываниями, при этом не пропускает реальных камер и радаров. С учетом цены в 5. Радардетектор Fujida Neo 8000 имеет классический внешний вид и привычное расположение органов управления. Если вы уже ранее использовали. Видеорегистратор Fujida Karma Hara: независимый обзор и характеристики, отзывы пользователей, преимущества и недостатки. Перед покупкой Fujida Neo 8000, обязательно почитайте отзывы покупателей, ознакомьтесь с подробными. радардетектор с лазерным приемником. диапазоны: K, Ka, Ku, X, UltraK, UltraKa, UltraX. обнаружение радаров типа. Радардетектор Fujida Neo 3000. Корпус не отсвечивает от солнца или фонарей, в отличии от предыдущего антирадара, с ним часто ловил блики в глазах. видимо изза прорезиненного покрытия. Яркость дисплея меняется.

Официальный сайт антирадары фуджида

Глушилки видеокамер. Глушилка камер – это устройство, которое может обнаружить и остановить видеопередачу информации в радиусе своего действия. Глушилка камер видеонаблюдения защитит от скрытой слежки, раскрытия важной коммерческой информации при деловых переговорах, попыток. Онлайнмагазин Глушилки предлагает выгодно приобрести мобильную глушилку (подавитель) связи с доставкой по Нижнекамску. В наличии качественные и надежные подавители сотовой связи и глонасс, глушилки gsm и gps. Считая камера определяет скорость Глушилка же создаёт вокруг транспортного средства поле радиусом 10 метров. Существует разновидность камер, которые измеряют среднюю скорость. Одна стоит в точке а другая в точке б. Они засекают время за которое авто проходит отрезок времени. Глушилка GPS купить в Нижнекамске по низкой цене. Интернетмагазин Новалл качественные карманные подавители. Получить глушилку GPS по низкой цене в Нижнекамске очень легко: для этого достаточно оставить заявку нашим операторам по телефону или в онлайнчате. Оставьте отзыв первым ! Купить глушилкиgsmсигналовруб недорого в Нижнекамске. NEOPOD содержит в себе огромный каталог товаров с выгодными предложениями, по оптовым и розничным ценам. ГлушилкиGSMсигналовруб в Нижнекамске. Быстрые фильтры. Охранная сигнализация Антенны и усилители сигнала для. Популярный анти камеры хорошего качества и по доступным ценам вы можете купить . мы предлагаем тысячи разновидностей продукции всех брендов и спецификаций, на любой вкус и размер. Find глушилка для видеокамеры from a vast selection of Electronics. Покупки по категориям. Введите ключевое слово для поиска. Все категории Антиквариат Искусство Детские товары Книги Бизнес и промышленность Видео и фототехника Мобильные телефоны и аксессуары Одежда, обувь и аксессуары. Купить глушилка GSM в Нижнекамске с гарантией. Скидки. Стационарные подавители (глушилки). Обнаружители (детекторы) скрытых камер. Купить глушилку GSM в Нижнекамске вы можете, оформив заказ в интернетмагазине Safetus. Глушилка GSM: цена, отзывы, подробное описание. Привести к действию глушилки сигналов видеокамер легко нажатием лишь одной кнопки. При помощи комбинированной глушилки вы сможете заблокировать работы скрытого жучка или камеры, работающих на разных частотах. Глушилки камер видеофиксации и камер видеонаблюдения. Камеры видеофиксации записывают или передают информацию при срабатывании какоголибо триггера, например датчика движения, открытия двери или проезда автомобиля в заданном месте или по времени. Т.е. запись производится. Схема как не платить штрафы с камер!. Как не получать штрафы с камер видеофиксации Продолжительность: 9:12 HM Channel 396 514 просмотров. 9:12. ДПС! ЗА ЧТО? ЗАПРЕЩЕННЫЕ АВТОТОВАРЫ с ALIEXPRESS 2019. Сегодня любая информация – это товар, который имеет свою стоимость. Активно собираются сведения о влиятельных, знаменитых или богатых людях, да и за обывателем может быть установлена слежка. Большой каталог товаров: подавители сигналов (глушилки) в Нижнекамске сравнение цен в интернет магазинах, описания и характеристики товаров, отзывы . Выбор города. Каталог. Подавители сигналов (глушилки) в нижнекамске. Назад. Подавители сигналов (глушилки) в Нижнекамске. 132 товара.

✔ антирадары фуджида

Ключевые слова: купить глушилку камер anticam в Нижнекамске, заказать антирадары фуджида, купить антирадар с gps недорого.

антирадар x cop, купить глушилку камер anticam в Рыбинске, обновление антирадара сильверстоун, купить глушилку камер дпс, программа антирадар отзывы

Принцип действия

Используют ИК диоды для подсветки номеров. Результат от такой подсветки потрясающий. Камера не способна прочитать номер нарушителя ПДД, поскольку они засвечиваются. Вместо букв и цифр на экране — белый цвет. В стародавние времена отечественные автомобилисты использовали антирадары, предупреждающие о гаишных засадах. С развитием технологий в ход пошли приложения для смартфонов, оповещающие о камерах фиксации нарушений, ее типе и скоростном режиме, который она отслеживает. Вместе с тем в продаже встречаются так называемые глушилки сигнала с камер. Внешний вид устройства забавляет — этакий микро-роутер, вставляющийся в прикуриватель. Стоит ли раскошеливаться на подобное устройство?

Официальный сайт антирадары фуджида

Состав

Результаты испытаний

Мнение специалиста

Водителям, мечтающим, что глушилка универсальная от камер ГИБДД будет скоро изобретена, стоит разочароваться. Как показало проведенное мероприятие на автодроме Moscow Raceway, на шаг впереди разработчики систем видеофиксации нарушений автомобилистами на дорогах страны. Выявленные ошибки, недоработки исправляются в хорошо оборудованных лабораториях.

Обзор автомобильного радардетектора iBox X10 GPS: характеристики, инструкция по настройке и обновлению. Применение новых технологий дает возможность производителям выпускать качественные многофункциональные. iBOX X10 GPS. Радардетекторы, снятые с производства. Обновление базы камер РФ, СНГ и Европы для X10 GPS от 12.03.2019 (скачать). Перед покупкой iBOX X10 GPS, обязательно почитайте отзывы покупателей, ознакомьтесь с подробными характеристиками и посмотрите видео обзоры! Так же, здесь Вы можете написать и оставить свой отзыв. Радардетектор iBOX X10 GPS отзывы. Рекомендуют 90%. Качество. для лучший радардетектор, удобный в использовании. В процессе праздного шатания по Меге в Казани был выбран радардетектор ibox x10. Основной мотив — предупреждение о камерах по базе (спутниковых координат камер, прибор имеет приемник GPS, база обновляется через. Безопасность Антирадар (радар детектор). iBOX X10 GPS. Отзывы Обзор Форум Характеристики Аксессуары Гарантия. Электронная инструкция по эксплуатации Радардетектора iBOX X10 GPS, скачайте бесплатно это руководство пользователя. Инструкция, паспорт, описание, мануал.

Назначение

Глушилки видеокамер сделать сложнее, чем подавители сотовой связи. При их создании нужно собирать модель, которая будет глушить все возможные частоты данных: 3G, 4G, Wifi, Bluetooth и множество радиоканалов. Так же, следует предусмотреть необходимость подавления проводных типов камер, которые будут передавать сигнал на регистратор. Создание такого подавителя потребует больших затрат, т.к. компонентов и деталей необходимо много, а если Вам нужна глушилка, которая прослужит не неделю, а больше – то такие запчасти будут еще и дорогие. Поэтому, чтобы не рисковать, лучше все же приобрести подавитель сигнала заводского производства, который гарантированно заглушит все каналы передачи данных видеокамеры. В связи с тем, что на заводе это потоковое производство, а не эксклюзивный товар, то стоимость блокираторов видеокамер будет примерно равна стоимости самостоятельной сборки. А дополнительным плюсом будет наличие гарантии и сертификата на такой подавитель.

Как заказать?

Заполните форму для консультации и заказа антирадары фуджида. Оператор уточнит у вас все детали и мы отправим ваш заказ. Через 1-10 дней вы получите посылку и оплатите её при получении.

антирадары фуджида. Где в Люберцах купить глушилку AntiCam. Отзывы, инструкция по применению, состав и свойства.

Еще в прошлом году приобрел радар детектор Shome G800 STR, но т.к. на постоянку его еще не подключил, то в основном использую его когда выезжаю за город. Прошлой осенью была очередная мутка с часовыми поясами и переходом на летнее время, а т.к. прошивка радара была мной залита еще до этого. Антирадар SHOME G800 STR является представителем радардетекторов нового поколения с модулем GPS, который в состоянии определить на расстоянии до 1,5 км даже такие радарные комплексы, как Автодория, РОБОТ и СтрелкаСТ, и заблаговременно предупредить о них водителя. Прошивка SHOME. Здравствуйте! О радардетекторе Shome G800 STR узнал от товарища. По его совету купил такой же и не ошибся. Прекрасно зарекомендовавший себя прибор. Покупкой доволен. Поддержка на высшем уровне, никогда мои вопросы не оставались без ответа. Приятно удивило регулярное обновление. Обновления для радардетекторов, комбоустройств и видеорегистраторов с GPS shome. АРХИВ ФАЙЛОВ перейти. Обновление ShoMe G800 STR. Скачать музыку или видео. Описание. Хоть в названии ролика и перечислены конкретные модели SHOME, но это лишь малая часть, часть регистраторов и радар детекторов с одним и тем же файлом. Итак: Решил обновить ПО своего радардетектор Shome G800 STR, сделать это можно на официальном сайте (ссылка где это можно сделать: shome.ru/pro.php?pro=224 ).Скачал и установил прошивку. Обновления для радардетекторов SHOME. Обновление базы камер и радаров ГИБДДпрошивки. Радардетектор SHOME G800 STR (Бесплатно). Если прошивка не соответствует указанной, необходимо сначала обновить прошивку. Вышло обновление базы радаров и камер от 5 февраля 2019 года. See more of ShoMe on Facebook.

Официальный сайт антирадары фуджида

Купить-антирадары фуджида можно в таких странах как:

Россия, Беларусь, Казахстан, Киргизия, Молдова, Узбекистан, Украина Армения

В стародавние времена отечественные автомобилисты использовали антирадары, предупреждающие о гаишных засадах. С развитием технологий в ход пошли приложения для смартфонов, оповещающие о камерах фиксации нарушений, ее типе и скоростном режиме, который она отслеживает. Вместе с тем в продаже встречаются так называемые глушилки сигнала с камер. Внешний вид устройства забавляет — этакий микро-роутер, вставляющийся в прикуриватель. Стоит ли раскошеливаться на подобное устройство? Еще в прошлом году приобрел радар детектор Shome G800 STR, но т.к. на постоянку его еще не подключил, то в основном использую его когда выезжаю за город. Прошлой осенью была очередная мутка с часовыми поясами и переходом на летнее время, а т.к. прошивка радара была мной залита еще до этого. Антирадар SHOME G800 STR является представителем радардетекторов нового поколения с модулем GPS, который в состоянии определить на расстоянии до 1,5 км даже такие радарные комплексы, как Автодория, РОБОТ и СтрелкаСТ, и заблаговременно предупредить о них водителя. Прошивка SHOME. Здравствуйте! О радардетекторе Shome G800 STR узнал от товарища. По его совету купил такой же и не ошибся. Прекрасно зарекомендовавший себя прибор. Покупкой доволен. Поддержка на высшем уровне, никогда мои вопросы не оставались без ответа. Приятно удивило регулярное обновление. Обновления для радардетекторов, комбоустройств и видеорегистраторов с GPS shome. АРХИВ ФАЙЛОВ перейти. Обновление ShoMe G800 STR. Скачать музыку или видео. Описание. Хоть в названии ролика и перечислены конкретные модели SHOME, но это лишь малая часть, часть регистраторов и радар детекторов с одним и тем же файлом. Итак: Решил обновить ПО своего радардетектор Shome G800 STR, сделать это можно на официальном сайте (ссылка где это можно сделать: shome.ru/pro.php?pro=224 ).Скачал и установил прошивку. Обновления для радардетекторов SHOME. Обновление базы камер и радаров ГИБДДпрошивки. Радардетектор SHOME G800 STR (Бесплатно). Если прошивка не соответствует указанной, необходимо сначала обновить прошивку. Вышло обновление базы радаров и камер от 5 февраля 2019 года. See more of ShoMe on Facebook. В стародавние времена отечественные автомобилисты использовали антирадары, предупреждающие о гаишных засадах. С развитием технологий в ход пошли приложения для смартфонов, оповещающие о камерах фиксации нарушений, ее типе и скоростном режиме, который она отслеживает. Вместе с тем в продаже встречаются так называемые глушилки сигнала с камер. Внешний вид устройства забавляет — этакий микро-роутер, вставляющийся в прикуриватель. Стоит ли раскошеливаться на подобное устройство?

На дорогах России, ГИБДД только начинает активную эксплуатацию камер и они пока установлены лишь на самых значимых и оживлённых автомагистралях страны, но с каждым днём число их растёт, да и действующие, доставляют автолюбителям массу неприятностей. Но, как известно из физики – на каждое действие, есть своё противодействие, потому Интернет пестрит объявлениями о продаже глушилок, а народные умельцы проводят мастер-классы изготовления таких приборов самостоятельно. Но насколько они действенны и можно ли на них положиться в столь щекотливом вопросе? Этому и многому другому и посвящена данная статья.

Детектор радаров rd u5 v st

Ключевые теги: Видеорегистратор с антирадаром в днс, купить Детектор радаров rd u5 v st, Лучшие радары детекторы 2018 года.

Видеорегистратор радар детектор inspector cayman s, Видеорегистратор с антирадаром на алиэкспресс, Антирадар кобра, Радар детектор купить в самаре, Радар детектор три в одном

Описание

Заказать действительно качественную продукцию можно по ссылке ниже. Для этого нужно оставить заявку, указав номер телефона и дождаться звонка оператора. Товар доставляется через почтовое отделение. Если 16 Band V7 купить в Москве или СПБ, то гаджет доставляется покупателю от 1 до 3 дней, в другие регионы – до 10 дней в зависимости от удалённости. Заказ оплачивается полностью только после получения. Купил перед Новым Годом, сделал себе неплохой подарок). Радар срабатывает чётко, помех, можно сказать нет. Хороший дисплей, что не часто встретишь у радаров такого плана. Удобно, что есть детектор приближения радара, т.е. показывает силу сигнала, и можно оценить расстояние. Улавливает практически все камеры, радары. Есть голосовое оповещение. Настройки просты, разобрался вообще без проблем.

Официальный сайт Детектор радаров rd u5 v st

Состав

Отзывы Inspector RD U5-v ST. радар-детектор с лазерным приемником. диапазоны: K, Ka, X, Ultra-Ka, Ultra-X. обнаружение радаров типа Стрелка. поддержка режимов: Город, Трасса. У меня это первый радар-детектор!Прежде чем выбрать,3 дня днями и ночами штрудировал интернет и форумы,и вообщем остановился iна нем-nspector RD U5 V-st!Честно!? Данная инструкция предназначена для радар-детектора Inspector RD U5-v ST, описывает принцип работы и основные моменты эксплуатации устройства. Радар-детектор Inspector RD U5-v ST, отзывы покупателей; Ловит ли эта модель стрелку? Лучшие радар-детекторы 2015 года, список моделей Mitsubishi Lancer 73rus › Бортжурнал › Радар Детектор INSPECTOR RD-U5-v. У меня тоже такой фирмы антирадар Inspector RD U4, очень им доволен, за эти деньги лучшего не найти! Радар-детектор Inspector RD U5-v ST уверенно обнаруживает сигналы полицейских радаров в диапазонах X, K, Ka, а также способен детектировать излучения измерителей скорости, которые работают в импульсном режиме. Inspector RD U5-v ST. обнаружение Стрелки, K, Ka, X, Ultra-Ka, Ultra-X, POP, Instant-On. парктроники или датчики какие то на новых дорогихиномарках) Комментарий: неплохой радар детектор за приемлемые деньги. езжу много, порядка 2-3. Мануал к радар-детектору INSPECTOR содержит пояснения к органам управления и индикации прибора и позволит быть во всеоружии против оплаты высоких штрафов на дороге. Инструкция INSPECTOR RD U5-v ST — радар-детектор. Рад представить новинку РД Инспектор с возможностью детектирования Стрелки! На данный момент это одна из моделей младшей линейки радар-детекторов Inspector, RD U5-v ST. Радар-детектор Inspector RD U5-v ST, который предназначен для заблаговременного обнаружения сигналов радаров скорости во всех диапазонах, на текущий момент используемых в России, включая X, K, расширенный Ka и даже радаров.

Эффект от применения

У этой модели большой диапазон частот, в которых он обнаруживает радары, поэтому ее и выбрал из всех моделей, которые сейчас в большом ассортименте предлагаются на рынке. Она работает с Х, К, Ku, Kа-узким диапазоном, что для меня немаловажно — нарушаю правила частенько. Покупал около 5-ти месяцев тому назад, еще по полной стоимости. Сумма меня не смутила — я за предыдущие 2 года потратил на штрафы в 3 раза больше. Контроль за соблюдением скоростного режима с каждым днём всё строже. Надоело получать письма из ГИБДД? Автомобильный радар-детектор 16 band v7 поможет решить эту проблему. Он не позволит тратить лишние деньги из-за лёгкой оплошности на дороге. В современном ритме так легко поддаться соблазну придавить на педаль. Надо признаться, невозможно ни разу не нарушить ПДД. Это устройство сделает вас счастливчиком, который не платит штрафы и не теряет времени на заполнение протоколов. Пусть вам завидуют!

Мнение специалиста

Китайский радар-детектор V7, а также модели V8, 16 Band V9 достаточно широко продаются в интернете. Проще всего найти их на Али-Экспрессе, известном онлайн-магазине. Продажа осуществляется под разными брендами, но по сути это одни и те же модели. Об их особенностях и пойдет речь в данной статье.

Все больше на рынок выходит сигнатурных гаджетов, очередной от компании SHO-ME и это обновление всем известного COMBO SMART . Давайте посмотрим, что же изменилось, как стал работать в первую очередь радар-детектор. Комбо-устройство SHO-ME Combo SMART в этом отношении даже не пробует притворяться: оно сразу же сбивает с толку . Но это не остановило нас в решимости вывести этот регистратор, совмещенный с радар-детектором, на чистую воду. Видеорегистратор совмещенный с радар-детектором SHO-ME Combo SMART интересен тем, что в нем используется новая схемотехника радарного блока который ранее не встречался в моделях компании. радар Амата) Sho-me Combo Smart Обзор на SHO ME Combo Smart Signature видеорегистратор с антирадаром отзывы владельца Обзор Sho Me Combo Smart. Видеорегистратор, GPS трекер, радар детектор. Радар детектор с регистратором SHO-ME COMBO SMART Signature использую уже 4мес. Прибор отличный. Что называется поставил и забыл, до выхода следующего обновления базы данных. Ожидаемо вслед за серией релизов новых сигнатурных радар-детекторов, компания Sho-Me анонсировала и запустила продажи первого комбо-видеорегистратора Sho-Me Combo SMART Signature. Плохие отзывы о Sho-Me Combo SMART я читаю На Негативе.ру. Зимой не работал радар, не знаю от чего это зависит. Через 5 месяцев перестал включаться при подаче питания. SHO-ME Combo Smart — новинка осени 2018 — радар-детектор с GPS и видеорегистратор два-в-одном, привычный набор функций, процессор видеорегистратора — Ambarella A7.

Назначение

Контроль за соблюдением скоростного режима с каждым днём всё строже. Надоело получать письма из ГИБДД? Автомобильный радар-детектор 16 band v7 поможет решить эту проблему. Он не позволит тратить лишние деньги из-за лёгкой оплошности на дороге. В современном ритме так легко поддаться соблазну придавить на педаль. Надо признаться, невозможно ни разу не нарушить ПДД. Это устройство сделает вас счастливчиком, который не платит штрафы и не теряет времени на заполнение протоколов. Пусть вам завидуют!

Как заказать?

Заполните форму для консультации и заказа Детектор радаров rd u5 v st. Оператор уточнит у вас все детали и мы отправим ваш заказ. Через 1-10 дней вы получите посылку и оплатите её при получении.

Детектор радаров rd u5 v st. Антирадары рейтинг отзывы 5 лучших моделей. Отзывы, инструкция по применению, состав и свойства.

Обновление ПО для Fujida Neo 7000 выходит еженедельно и всегда бесплатно. Далее радар-детектор нужно отсоединить от компьютера и ОБЯЗАТЕЛЬНО ПЕРЕЗАГРУЗИТЬ. Отзывы Fujida Neo 7000. радар-детектор с лазерным приемником. Был Street Storm за 8к и работал он также как neo 7000. За что там переплата такая — не знаю, наверное за бренд. Безопасность Антирадар (радар детектор). Fujida Neo 7000. Покупайте Fujida Neo 7000 в сети магазинов Сайдекс! Определен город Москва. Проверенные отзывы владельцев о Fujida Neo 7000. Каждый отзыв прошел модерацию нашими специалистами. Достоинства: Приобрели не давно данную новинку среди радар-детекторов, так как предыдущий аппарат приказал долго. Fujida Neo 7000. Узнать цены и подробные характеристики. Приемник. Диапазон Ka. 33400 — 36000 МГц. Детектор лазерного излучения. Определение координат. ГЛОНАСС, GPS, база стац. радаров. Антисон. есть. Читайте плохие отзывы владельцев Fujida Neo 8000, НА НЕГАТИВЕ РУ. Вывод всей этой моей писанины в том что глючный не соответствующий описанию радар-детектор не стоит своих денег. Пользуюсь радар-детектором больше года. общее впечатление положительное. Штрафы резко перестали приходить. Самые интересные отзывы о Fujida Neo 7000. 12 отзывов, средняя оценка 5. Цена 4999 р. Очередной попавший к нам на тест радар-детектор – это Fujida Neo 8000, гибрид радиоприемного радар-детектора и GPS-информатора. Устройство собрано в классическом по меркам РД корпусе, покрытом приятной на ощупь софт-тач краской. Радар-детектор Fujida Neo 8000 имеет классический внешний вид и привычное расположение органов управления. Если вы уже ранее использовали радар-детектор. Если у вас возникли вопросы при использовании Радар-детектор Fujida Neo 7000, вы не можете определиться с выбором или нуждаетесь в консультации, задайте вопрос и наши редакторы или посетители сайта постараются ответить вам. Радар-детекторы. Купить выгодно товары в Воронеже. Цены в интернет-магазинах Воронежа. На второй автомобиль решила поставить одну из моделей линейки Фуджида. Модель нет 7000 вполне подходит для езды по городу, ничего лишнего. Вы можете сравнить предложения в 1 магазине и купить Радар-детектор Fujida Neo 7000 по выгодной цене с доставкой по Москве и всей России.

Официальный сайт Детектор радаров rd u5 v st

✅ Купить-Детектор радаров rd u5 v st можно в таких странах как:

Россия, Беларусь, Казахстан, Киргизия, Молдова, Узбекистан, Украина Армения

Отдельно стоит отметить, что цена на сайте привлечёт ваше внимание, ведь именно сейчас вы можете купить антирадар со скидкой. Ещё один довод в пользу официального сайта (вот он) – это возможность избежать развода со стороны нечистых на руку продавцов. Дело в том, что растущая популярность устройства все чаще толкает мошенников на обман. В последний год в несколько раз участились продажи некачественных подделок. Но производитель не несёт ответственности за товар, приобретённый не на официальном сайте и вызывающий отрицательные эмоции.

Устанавливала его в машину сама. К нему была приложена подробная инструкция по настройке, с которой я разобралась без посторонней помощи. Покупала стильный красненький. На торпеде смотрится гармонично, достаточно компактный. Настроила всего 1 раз и потом не стала переключать на другой.

Человеческая 2′-фосфодиэстераза локализуется в митохондриальном матриксе с предполагаемой функцией митохондриального обмена РНК

Abstract

Система позвоночных 2-5A является частью врожденной иммунной системы и играет центральную роль в противовирусной защите клеток. После активации вирусной двухцепочечной РНК, 5′-трифосфорилированные, 2′-5′-связанные олигоаденилатные полирибонуклеотиды (2-5As) синтезируются одной из нескольких 2′-5′-олигоаденилатсинтетаз. Эти необычные олигонуклеотиды активируют РНКазу L, неспецифическую эндорибонуклеазу, которая опосредует распад вирусной и клеточной РНК.Впоследствии 2-5As удаляются 2′-фосфодиэстеразой (2′-PDE), ферментом, который помимо разрыва 2’– 5 ‘связей также разрушает обычные 3′-5′-связанные олигоаденилаты. Интересно, что 2′-PDE обладает как функциональными, так и структурными характеристиками с семейством деаденилаз экзонуклеаза-эндонуклеаза-фосфатаза CCR4-типа. Здесь мы показываем, что 2′-PDE располагается в митохондриальном матриксе клеток человека и содержит активную 3′-5′-экзорибонуклеазу, проявляющую предпочтение для олигоаденозиновой РНК, как канонические цитоплазматические деаденилазы.Кроме того, мы документируем заметную отрицательную связь между 2′-PDE и уровнями митохондриальной мРНК после siRNA-направленного нокдауна и плазмид-опосредованной сверхэкспрессии, соответственно. Результаты показывают, что 2’-PDE, помимо того, что играет роль в клеточной иммунной системе, также может функционировать в митохондриальном обороте РНК.

ВВЕДЕНИЕ

Интерфероны (IFN) — это специфичные для позвоночных цитокины, играющие ключевую роль в врожденном иммунитете (1,2). Они вызывают ряд биологических реакций, из которых их противовирусное, противоопухолевое и иммуномодулирующее действие имеет большое медицинское значение (3,4).После вирусной инфекции клетки начинают синтезировать и секретировать IFN, которые затем взаимодействуют со специфическими рецепторами на поверхности клетки, чтобы активировать внутриклеточный сигнальный каскад, что в конечном итоге приводит к изменениям в экспрессии генов, которые определяют биологический результат.

Система 2-5A формирует основную часть клеточной противовирусной защиты, в которой IFN первоначально индуцируют экспрессию набора двухцепочечных РНК-зависимых 2′-5′-олигоаденлиатсинтетаз (dsRNA-зависимых 2′-5′- ОАГ). После активации вирусной дцРНК эти ферменты начинают синтезировать набор необычных 5′-трифосфорилированных, 2′-5′-связанных олигоаденилатполирибонуклеотидов (2-5As) из АТФ с общей структурой pppA (2’p5 ‘A) _n (5).Накопление 2-5А затем вызывает активацию РНКазы L, иначе латентной эндорибонуклеазы, что приводит к деградации вирусной РНК. Однако РНКаза L лишь умеренно специфична по отношению к вирусной РНК и будет разрушать клеточную РНК, если ее не деактивировать (6,7). Следовательно, внутриклеточный уровень 2-5A быстро подавляется нуклеазой, которая, в отличие от канонических экзонуклеаз, разрушает 2’– 5′-связанную РНК (8,9).

Считается, что удаление 2-5A первоначально включает дефосфорилирование с помощью 5 ‘ -фосфатазы, поскольку было показано, что активация пути вирусной инфекцией и стимуляция IFN у мышей и в культурах клеток приводит к накоплению 5 ‘ -дефосфорилированные 2-5As (молекулы ядра 2-5A), а не их 5 ‘ -трифосфорилированные аналоги (10,11).Хотя дефосфорилированные ядерные молекулы 2-5A менее активны в стимуляции РНКазы L (12), они все же обладают значительными противовирусными и противовирусными свойствами, и их необходимо полностью удалить, чтобы остановить ответ (13,14). Как фосфорилированные, так и дефосфорилированные 2-5A могут разлагаться 2 ‘-5 ‘ -специфической экзорибонуклеазой, известной как 2 ‘ -фосфодиэстераза [2′-PDE (также называемая фосфодиэстеразой 12 (PDE12))], которая является таким образом, ключевой регулятор системы 2-5А (9).

2 ‘ -PDE также способен расщеплять 3 ‘ -5 ‘-связанных олигоаденилатных РНК in vitro (9,15,16), и поэтому был классифицирован как предполагаемая РНК-деаденилаза (17 ).Деаденилазы представляют собой разнообразную группу ферментов, ответственных за удаление поли (A) -хвоста во время раннего оборота мРНК в цитоплазме эукариот. Большинство деаденилаз представляют собой экзонуклеазы 3 ′ –5 ′ , которые продуцируют AMP путем гидролиза фосфодиэфирных связей РНК зависимым от ионов двухвалентных металлов способом (17). Этот процесс представляет собой первый и лимитирующий этап во время оборота мРНК и поэтому строго регулируется (17,18). Все охарактеризованные к настоящему времени деаденилазы принадлежат либо к суперсемейству DEDD, либо к суперсемейству экзонуклеаза-эндонуклеаза-фосфатаза (EEP) (17).В нуклеазах типа DEDD активный центр состоит из трех остатков аспартата и одного глутамата, которые координируют два основных иона двухвалентных металлов (19–21). У людей члены этой группы включают белки POP2, CAF1Z, PARN и PAN2. Нуклеазы EEP-типа, к которым принадлежит 2′-PDE, также зависят от ионов двухвалентных металлов и содержат активный центр, состоящий из остатков аспартата и гистидина (22,23). Эта группа включает ферменты, активные как в отношении ДНК, так и РНК, и включает белки CCR4, Nocturnin и ANGEL.

Здесь мы показываем, что 2′-PDE человека, в отличие от других компонентов, составляющих систему 2–5A (24–29), находится в компартменте митохондриального матрикса и включает общую 3′ – 5′-экзорибонуклеазу, проявляющую предпочтение олигонуклеотидов. -аденозиновая РНК, подобная каноническим цитоплазматическим деаденилазам (21,22,30–33). Кроме того, мы документируем наличие заметной отрицательной ассоциации между 2′-PDE и уровнями митохондриальной мРНК после направленного нокдауна siRNA и опосредованной плазмидой сверхэкспрессии, соответственно.В совокупности результаты предполагают, что 2′-PDE может играть двойную роль в клетках, участвуя в обороте митохондриальной РНК, а также в системе 2-5A.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Культивирование и трансфекция клеток

Клетки HeLa, HEK293 или COS-7 выращивали в среде DMEM (Gibco BRL / Life Technology), содержащей 10% FBS и 1% пенициллин / стрептомицин (Gibco BRL / Life Technology). Клетки HEK293 и HeLa трансфицировали с использованием реагента для трансфекции PolyFect (Qiagen), а клетки COS-7 трансфицировали с использованием липофектамина (Invitrogen).Клетки лизировали 1% NP40, 0,5 M CH ₃ COOK, содержащим 2 × полный коктейль ингибиторов протеазы (Roche). Лизаты клеток центрифугировали при 20000 g в течение 3 минут и супернатанты извлекали в виде белковых экстрактов. Концентрацию белка оценивали с помощью набора для анализа белков BCA (Pierce).

Экспрессия Escherichia coli и очистка белка

Клетки Escherichia coli BL21 (DE3) трансформировали 2′-PDE ₆₁₅ -His, 2′-PDEΔmTP ₆₀₀ -His и OAS1-p42 в pTriEx- 3 Neo, а также в качестве контроля с пустым вектором pTriEx-3 Neo.Затем бактерии выращивали в среде LB, содержащей 50 мкг / мл ампициллина, перед индукцией при OD ₆₀₀ = 0,8 с помощью 1 мМ IPTG в течение 10 ч при 25 ° C. Бактерии осаждали при 10 000 г в течение 20 мин и ресуспендировали в 300 мМ KCl, 15% глицерине, 5 мМ MgCl ₂, 5 мМ β-меркаптоэтаноле, 1 мМ PMSF, 1х коктейле ингибиторов протеазы и 50 мМ Трис– HCl, pH 7,5. Эта суспензия была обработана ультразвуком и лизирована путем гомогенизации под высоким давлением при 15 000–20 000 фунтов на квадратный дюйм. Клеточные остатки центрифугировали при 30 000 г в течение 1 ч и отбрасывали.Для очистки супернатант фильтровали через фильтр 0,45 мкм и наносили на колонку Ni-NTA (QIAGEN), предварительно уравновешенную 300 мМ KCl, 20 мМ имидазолом, 5 мМ β-меркаптоэтанолом, 1 мМ PMSF, 1 × ингибитором протеазы. коктейль и 50 мМ Трис-HCl, pH 7,5. Белки элюировали ступенчатым градиентом с использованием 300 мМ имидазола. Элюат Ni-NTA разбавляли и наносили на колонку MonoQ HR 16/10 (GE Healthcare), предварительно эквалиброванную в 50 мМ KCl, 5 мМ β-меркаптоэтаноле и 50 мМ Трис-HCl, pH 7,5, и элюировали линейным KCl. градиент 0.2% / мл от 50 до 500 мМ. Фракции объединяли и концентрировали на фильтре Vivaspin MWCO 5 кДа (Sartorius) и хранили в 50% глицерине.

SDS – PAGE и иммуноблоттинг.

Белки денатурировали при 95 ° C в течение 5 минут и наносили на 10% SDS – PAGE. Гели окрашивали кумасси бриллиантовым синим R-250 (Pierce). Для иммуноблоттинга белки подвергали электроблоттингу на PVDF-мембранах Immobilon-P (Millipore). Мембраны блокировали в 5% сухом обезжиренном молоке в PBS-T (PBS с 0,05% Tween-20), промывали PBS-T и инкубировали с антителами против His (Rockland или GenScript Corporation).Мембраны промывали PBS-T и инкубировали с одним из двух конъюгированных с HRP IgG, козьими антителами против кролика (DakoCytomation) или козьими антителами против мыши (GE Healthcare). Белки определяли с помощью реагента ECL (Amersham ECL Plus ^TM, GE Healthcare).

Иммуноцитохимия

Клетки HeLa и HEK293 высевали на покровные стекла, трансфицировали PolyFect и инкубировали в течение 36 часов. В среду для роста добавляли 100 нМ Mitotracker (Red CMXRos, Invitrogen) в течение 30 мин.Клетки фиксировали 4% PFA, промывали PBS, повышали проницаемость 0,2% Triton-X 100, снова промывали и, наконец, блокировали 0,1% Tween-20 в PBS. Затем клетки инкубировали с антителом против His (Rockland или Genscript), промывали и инкубировали с вторичным антителом, конъюгированным с FITC (Sigma). Наконец, клетки промывали, сушили на воздухе и закрывали покровные стекла с помощью Vectashield (Vector Laboratories). Изображения были получены с помощью микроскопа Zeiss LSM510 MetaConfocal. Яркость и контраст полученных изображений были отрегулированы с помощью программного обеспечения LSM Image.

Синтез 2′-5′-олигоаденилатного тетрамерного ядра, ApApApA

В 200 мл инкубировали 17 мкг / мл высокоактивного 2’– 5′-OAS1 с 2 мМ АТФ в 4 мМ Mg (OAc) ₂, 0,2 мМ DTT, 40 мкМ EDTA, 0,2 мг / мл Poly (I) -Poly (C), 0,1 мг / мл BSA, 2% глицерина и 4 мМ Tris-HCl, pH 7,8 в течение 3 часов при 37 ° C. Концентрация АТФ увеличивалась с 2 до 10 мМ добавлением 1 мМ АТФ каждые 10 мин. Образец инактивировали нагреванием при 85 ° C в течение 15 минут, фильтровали (0,45 мкм) и затем наносили 100 ед / мл щелочной фосфатазы (Roche Applied Science) на ночь при 37 ° C.Затем образец был разделен на аликвоты по 10 мл, и каждую аликвоту загружали в колонку MonoQ HR 16/10, предварительно уравновешенную 20 мМ Трис-HCl, pH 7,5, и элюировали 1 М NaCl с использованием ступенчатого линейного градиента 0– 10% при объемах на 3,6 колонки и 10–30% при объемах на 24 колонки. Фракции тетрамерного олигоаденилата затем объединяли, разбавляли 20 мМ трис-HCl, pH 7,5, снова наносили на колонку MonoQ HR 16/10 и, наконец, элюировали ступенчатым градиентом до 0,5 М NaCl. Идентичность тетрамерного ядра определяли с помощью МС, а оценку концентрации получали с помощью MonoQ Sepharose с использованием АТФ в качестве внутреннего контроля.

Анализ разложения и определение

K _m и V _max

Для 2′-5′-связанного тетрамера ApApApA реакции проводили с 1 пмоль / мкл 2′-PDE и 0,5 мМ субстрат в 5 мМ MgCl ₂, 1 мМ DTT, 1 мг / мл БСА, 1x коктейль ингибиторов протеазы и 20 мМ Hepes, pH 7,0 в течение 1 ч при 37 ° C. Образцы разбавляли 20 мМ трис-HCl, pH 7,5 и фильтровали на фильтровальных планшетах AcroPrep ^TM 10K (Pall Corporation). Фильтраты наносили на колонку MonoQ HR 5/5 (GE Healthcare), предварительно уравновешенную 20 мМ трис-HCl, pH 7.5, и элюировали 1 М NaCl с использованием ступенчатого линейного градиента 0–12% и 12–16% по 18 и 20 объемам колонок, соответственно. Процент превращения тетрамерного ядра рассчитывали путем интегрирования индивидуальных пиков.

Анализ разложения 2′-5′-олигоаденилата повторяли с 3′-5′-связанными тетрамерными субстратами, ApApApA и CpCpCpC (Dharmacon), используя 1 пмоль / мкл 2′-PDE и различные концентрации субстрата (25 мкМ – 1,5 мМ). Реакции инкубировали 20 мин при 37 ° C и обрабатывали, как описано выше, фильтрацией, фракционированием MonoQ-сефарозы и интегрированием пиков. K _m и V _max кинетические параметры определяли нелинейной регрессией и кинетикой фермента Михаэлиса-Ментен с использованием программного обеспечения GraphPad Prism.

Для анализа 30-мерной РНК- и ДНК-деградации были синтезированы субстраты РНК-Poly (A), РНК-Stemloop-Poly (A) и ДНК-Poly (A) с 5′-флуоресцентной меткой, тогда как субстрат РНК-Poly (C) синтезировали с меткой 5′-TAMRA (Invitrogen). Все субстраты очищали в геле. In vitro реакции содержали 100-кратный избыток фермента (1 мкМ) над РНК (10 нМ) и проводили в 50 мМ KCl, 7.1 мМ MgCl ₂ и 10 мМ Трис-HCl, pH 8,0. Реакции инкубировали при 30 ° C в течение до 2 часов, гасили загрузочным буфером для РНК (8 М мочевина, 0,5% (масс. / Об.) Бромфенолового синего, 0,5% (масс. / Об.) Ксилолцианола FF, 20 мМ ЭДТА и 5%). мМ Tris-HCl, pH 8,0), разделенных денатурирующим гель-электрофорезом на 20% мочевинно-акриламидных гелях при 15 Вт и полосах, визуализированных с помощью сканеров Typhoon 9400 и Typhoon Trio (GE Healthcare). Лестницы РНК и ДНК были сконструированы путем ограниченного щелочного гидролиза соответствующих субстратов в 50 мМ NaCO ₃, pH 8.9 в течение 10 мин при 96 ° C с последующей нейтрализацией 300 мМ Na (CH ₃ COO), pH 4,5.

Дифференциальная обработка клеток

Клетки собирали в PBS с использованием скребка для клеток, осаждали при 1000 г в течение 10 мин, ресуспендировали в 220 мМ манните, 70 мМ сахарозе, 1 мМ EDTA, 2 мг / мл BSA, 2 × протеазы коктейль ингибиторов, 0,5 мМ PMSF и 20 мМ Hepes, pH 7,6, гомогенизировали с помощью гомогенизатора Даунса, и клеточный дебрис осаждали при 1000 г в течение 10 мин. Извлеченные супернатанты центрифугировали в течение 20 минут при 10 000 g , после чего осадок (митохондрии) и супернатант (цитозоль и микросомы) разделялись.Митохондрии ресуспендировали, как описано выше, но без BSA, и любой оставшийся клеточный дебрис осаждали при 1000 г в течение 10 мин. Супернатанты центрифугировали снова в течение 20 мин при 10 000 g , и полученные митохондриальные осадки ресуспендировали в буфере мочевины (6 М мочевина и 50 мМ трис-HCl, pH 8,0) для МС и гель-фракционирования или 1x раствор OFFGEL. (6,7 M мочевина, 2 M тиомочевина, 60 мМ DTT и 1,2% амфолитов, pH 3–10) для фракционирования вне геля или буфер BSA (3 мг / мл BSA без жирных кислот, 250 мМ сахароза, 80 мМ KCl, 5 мМ MgCl ₂, 2 мМ KH ₂ PO ₄, 5 мМ метионин и 10 мМ MOPS-KOH, pH 7.2) для импорта митохондрий in vitro и . Цитозоль и микросомы разделяли центрифугированием при 330 000 g в течение 30 мин, а супернатант (цитозоль) TCA осаждали и ресуспендировали в буфере мочевины. Концентрацию митохондриального белка оценивали с использованием реагента для анализа Брэдфорда (Pierce), а концентрацию цитозольного белка — с помощью метода BCA.

³⁵ S-мечение и in vitro митохондриальный импорт

³⁵ S-меченный 2′-PDE ₆₁₅ -His был синтезирован при 30 ° C в течение 1.5 часов с использованием системы быстрой транскрипции / трансляции TNT T7 (Promega). Импортные реакции проводили в 1% этаноле, 0,45 мг / мл митохондрий, 1,25 мкл ³⁵ S-меченного 2′-PDE, 5 мМ АТФ, pH 7,0 и 10 мМ сукцината натрия, pH 7,5 в буфере BSA. Мембранный потенциал (Δψ) был нарушен заменой этанола на 80 мкМ антимицина A, 10 мкМ валиномицина и 20 мкМ олигомицина и без сукцината натрия. Реакции проводили при 30 ° C в разные моменты времени и останавливали 2 мМ валиномицина.Неимпортированный белок расщепляли в течение 10 минут при 4 ° C с использованием 50 мкг / мл протеиназы K с последующим ингибированием протеазы 2 мМ PMSF при 4 ° C в течение 10 минут. Митохондрии осаждали, как описано выше, и промывали ресуспендированием в буфере SEM (250 мМ сахароза, 1 мМ EDTA, 2 мМ PMSF и 10 мМ MOPS-KOH, pH 7,2). Осадки окончательно растворяли в буфере для образцов, содержащем 2 мМ PMSF, и наносили на SDS-PAGE. Для эксперимента по экстракции карбоната митохондрии подвергали воздействию 0,1 М карбоната натрия (pH 11,5) в течение 30 минут на льду после импорта белка.Затем образцы ультрацентрифугировали при 100000 g в течение 30 минут при 4 ° C и супернатанты (растворимые и периферические мембранные белки) подвергали осаждению TCA в дезоксихолате натрия 125 пг / мкл. Наконец, белки повторно растворяли в буфере для образцов, содержащем PMSF, и позволяли солюбилизироваться путем инкубации в течение 10 минут при комнатной температуре. Ультрацентрифугированные осадки (интегральные мембранные белки) ресуспендировали в буфере для образцов, содержащем PMSF. Для эксперимента по набуханию митохондрий митохондрии ресуспендировали в буфере SM (250 мМ сахарозы с 10 мМ MOPS-KOH, pH 7.2) после импорта белка и обработки девятью объемами 10 мМ MOPS-KOH, pH 7,2 в течение 15 минут на льду, или в качестве контроля, сохраненных нетронутыми путем замачивания в девяти объемах буфера SM. Доступные белки удаляли обработкой протеиназой К или оставляли без обработки в качестве контроля. Затем митохондрии / митопласты осаждали центрифугированием, промывали буфером SEM и повторно растворяли в буфере для образцов.

Для авторадиографии образцы наносили на SDS-PAGE, гель фиксировали и сушили. Белки визуализировали с помощью фосфорного изображения с использованием сканеров Typhoon 9400 и Typhoon Trio.

Триптический гидролиз неочищенных митохондрий

Митохондриальные белки (~ 1 мг), растворенные в буфере мочевины, восстанавливали в 10 мМ DTT в течение 18 часов при 37 ° C, затем алкилировали в 30 мМ йодацетамида в течение 1 часа при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением дополнительного количества DTT до 40 мМ. Белки разводили в 10 раз 1 мМ CaCl ₂ в 10 мМ Трис-HCl, pH 8,0, и расщепляли с использованием 5 нг / мкл трипсина в течение 18 часов при 37 ° C. PH образцов для анализа MS доводили примерно до 2–3 с помощью 0.1% ТФК.

Фракционирование вне геля и подготовка для MS

Белки фракционировали вне геля при 200 В в течение 25 ч (5 кВ · ч) и 50 мкА (фракционеры 3100 OFFGEL, Agilent) на 12 фракций с использованием полосок геля с иммобилизованным градиентом pH, покрывающих pH. интервал 3–10. Фракции обрабатывали трипсином, а пептиды очищали с помощью Zip-Tips (0,2 мкл смолы C ₁₈, Millipore). Наконец, пептиды сушили центрифугированием SpeedVac и повторно растворяли в 0,1% TFA.

RP-HPLC и MS

Образцы анализировали с использованием системы UltiMate 3000 LC (Dionex), связанной с масс-спектрометром micrOTOF-Q ESI-Qq-TOF (Bruker Daltonics, Bremen).Программное обеспечение Bruker Compass HyStar (версия 3.2-SR2, Bruker Daltonics) использовалось для связи пакетов программного обеспечения для RP-HPLC и масс-спектрометра. Для ВЭЖХ использовали RP-колонку C ₁₈ (наноколонка PepMap 100, Dionex) для фракционирования пептидов. Пептиды наносили на колонку, колонку промывали 2% ацетонитрилом + 0,1% муравьиной кислоты и пептиды элюировали линейным градиентом 98% ацетонитрила в 0,1% водной муравьиной кислоте. Градиент составлял от 0% до 2%, от 2% до 42% и от 42% до 99% соответственно на 20, 160 и 76 мкл со скоростью потока 4 мкл / мин.Спектры пептидов МС и МС / МС регистрировали онлайн с помощью масс-спектрометра.

файлов образцов MS были обработаны, обозначены и деконволютированы с использованием DataAnalysis (версия 4.0 SP1, Bruker Daltonics, Германия). Спектры пептидов были экспортированы в BioTools (версия 3.1, Bruker Daltonics, Германия) и сопоставлены с пептидами, полученными в результате виртуального триптического гидролиза 2′-PDE. Для оценки митохондриальной чистоты данные MS / MS были применены к поисковой машине Mascot (версия 2.2, Matrix Science, Соединенное Королевство) и исследованы по полному репертуару белков человека, содержащемуся в базе данных белков Swiss-Prot.Степень чистоты определялась на основании известной клеточной локализации обнаруженных белков.

нокдаун миРНК и плазмид-опосредованная сверхэкспрессия 2′-PDE в клетках HeLa, для qRT-PCR

Пул из четырех миРНК (последовательности-мишени: 5′-GAAGAUUGAAUUAGCGUGU-3 ‘, 5′-AGUACAAGGUGGAGC’, 5′-AGUACAAGGUGGAGC ‘ ‘-CGGCAUCUCUACACGAAGA-3′ и 5’-CAAACUCAGCCUCGAAUUU-3 ‘) (Dharmacon) использовали для подавления уровня экспрессии гена 2′-PDE (2′-PDE ON-TARGET плюс siRNA SMARTpool). МиРНК отрицательного контроля нацелена на GFP (целевая последовательность: 5’-GACGTAAACGGCCACAAGTC-3 ‘) (Dharmacon).Плазмидно-опосредованную сверхэкспрессию белка проводили с использованием конструкции 2’-PDE ₆₁₅ -His, клонированной в pcDNA3.

Трансфекцию

миРНК и плазмид клеток HeLa проводили в 6-луночных планшетах с использованием реагентов для трансфекции DharmaFECT 1 (Dharmacon) или PolyFect (Qiagen), соответственно, в соответствии с инструкциями производителя. Через 72 часа (миРНК) и 36 часов (плазмида) после трансфекции клетки собирали и общую РНК выделяли с использованием набора RNeasy Mini Kit (Qiagen).

Количественный анализ ПЦР с обратной транскриптазой

Первую цепь кДНК получали с использованием 1.5 мкг общей РНК, олиго (dT) ₁₈ праймер и обратная транскриптаза MMLV (Epicenter Biotechnologies) в конечном объеме 50 мкл. Каждая количественная реакция с обратной транскриптазой (qRT) -PCR содержала 1 мкл кДНК первой цепи и 200 нМ как прямого, так и обратного праймеров в конечном объеме 20 мкл, и ее проводили с использованием набора Platinum SYBR Green qPCR SuperMix UDG Kit с добавлением ROX Эталонный краситель (Invitrogen). Наборы ген-специфичных праймеров были следующими: 2′-PDE прямой, 5′-GTCATCAATGGCAGCATTCCAGAG-3 ‘; 2′-PDE обратный, 5’-CTATTTCCATTTTAAATCACATACAAGTGC-3 ‘; CoxI вперед, 5’-ACCCTAGACCAAACCTACGCCAAA-3 ‘; CoxI, обратный, 5’-TAGGCCGAGAAAGTGTTGTGGGAA-3 ‘; CoxII вперед, 5’-ACAGATGCAATTCCCGGACGTCTA-3 ‘; CoxII, обратный, 5’-GGCATGAAACTGTGGTTTGCTCCA-3 ‘; CoxIII вперед, 5’-ACTTCCACTCCATAACGCTCCTCA-3 ‘; CoxIII обратный, 5’-TGGCCTTGGTATGTGCTTTCTCGT-3 ‘; CytB вперед, 5’-TCCTCCCGTGAGGCCAAATATCAT-3 ‘; CytB обратный, 5’-AAAGAATCGTGTGAGGGTGGGACT-3 ‘; ND4 вперед, 5’-ACAAGCTCCATCTGCCTACGACAA-3 ‘; ND4 обратный, 5’-TTATGAGAATGACTGCGCCGGTGA-3 ‘; ND6 вперед, 5’-AGGATTGGTGCTGTGGGTGAAAGA-3 ‘; ND6 обратный, 5’-ATAGGATCCTCCCGAATCAACCCT-3 ‘; RPL13A вперед, 5’-CCTGGAGGAGAAGAGGAAAGAGA-3 ‘; RPL13A обратный, 5’-TTGAGGACCTCTGTGTATTTGTCAA-3 ‘.Результаты были получены с помощью системы Mx3005P (Stratagene), а условия термоциклирования ПЦР были следующими: 95 ° C в течение 10 минут и 40 циклов при 95 ° C в течение 10 с, 58 ° C в течение 20 с и 72 ° C в течение 20 с. . Размеры полос продуктов ПЦР проверяли стандартным электрофорезом в агарозном геле, и анализ кривой плавления всех продуктов ПЦР показал одиночные пики плавления. Уровни сигналов были нормализованы по эталонному красителю ROX для исправления ошибок из-за различий в прозрачности и отражательной способности пластиковых изделий или ошибок аликвотирования.Полученные значения Ct были преобразованы в количества с использованием сравнительного метода Ct с учетом эффективности реакции с каждым набором праймеров, которые были определены, как описано ранее (34). Относительные уровни экспрессии генов были нормализованы до значений гена RPL13A, кодирующего стабильно экспрессируемый рибосомный белок (35).

РЕЗУЛЬТАТЫ

2′-PDE содержит N-концевой сигнальный пептид митохондрий

Первоначально полноразмерный 2′-PDE (609 аминокислот) был клонирован из кДНК человека в вектор эукариотической экспрессии pcDNA3, чтобы кодировать 615 аминокислотных остатков. слитый белок с кислотами (68 кДа), содержащий C-концевую 6 х His-метку (2′-PDE ₆₁₅ -His) (A).После временных трансфекций наблюдали две (клетки HEK293, B) или три (клетки HeLa, C) специфические полосы, соответствующие полноразмерному белку и продуктам, подвергшимся деградации или посттрансляционному процессингу. При экспрессии контрольной конструкции, содержащей 2′-5′-олигоаденилатсинтетазу, OAS1-p42, деградации не наблюдалось, что позволяет предположить, что процессинг белка может участвовать в образовании множества полос.

Конструкции и экспрессия 2′-PDE в клетках человека. ( A ) Конструкции 2′-PDE.2′-PDE ₆₁₅ -His кодирует полноразмерный белок с добавленной C-концевой His-меткой, тогда как 2′-PDEΔmTP ₆₀₀ -His составляет N-концевую усеченную форму 2′-PDE ₆₁₅ -He лишен первых 16 остатков (вертикальная стрелка в верхнем ряду) и содержит искусственный инициатор метионин (M). Домен EEP-нуклеазы выделен красным, а пептид, нацеленный на митохондриальный матрикс, mTP — синим. Указаны нацеленный на матрицу мотив R2, xRx ↓ (S / x) и связанный сайт протеолитического расщепления (MPP).Вертикальные красные линии обозначают конечный остаток природного белка. Инициатор метионин в 2′-PDEΔmTP ₆₀₀ -His, не присутствующий в нативном белке, выделен красным. MPP, митохондриальная процессинговая пептидаза. ( B ) и ( C ) 2′-PDE ₆₁₅ -His трансфицировали в клеточные линии человека HEK293 и HeLa, и экспрессии белка позволяли продолжаться в течение 36 часов, после чего клетки лизировали и анализировали иммуноблоттингом с использованием антитело против His-tag (Rockland).Экстракты из клеток, трансфицированных конструкцией, кодирующей His-tagged OAS1-p42 или вектор пустой pcDNA3 (EV), использовали в качестве положительного и отрицательного контролей соответственно. Стрелки указывают на полноразмерные белки, а стрелки указывают на процессируемые на N-конце формы. В каждую дорожку загружали 20 мкг общего белка.

Для дальнейшего анализа вероятности процессинга белка и, возможно, субклеточной локализации, отличной от цитозоля, были использованы алгоритмы WoLF PSORT и pTARGET для прогнозирования клеточной локализации 2′-PDE на основе последовательности (36).Оба четко идентифицировали митохондриальный сигнальный пептид, также называемый нацеливающим на матрикс пептидом, mTP, на N-конце 2′-PDE (37,38). MitoProtII (39), биоинформатический инструмент, разработанный специально для идентификации mTP, а также наиболее вероятного сайта N-концевого процессинга, подтвердил предполагаемую локализацию митохондрий с вероятностью 95% с прогнозируемым mTP, составляющим остатки 1-16 предшественника. (А). В частности, N-конец 2′-PDE содержит мотив R2, xRx ↓ x (S / x), где стрелкой отмечен сайт протеолитического расщепления, в данном случае между Thr16 и Ala17.Присутствие мотива R2 в 2′-PDE предполагает, что импорт в митохондрии происходит через единичное событие расщепления, опосредованное локализованной в матриксе протеазой, известной как митохондриальная процессинговая пептидаза, MPP (40). Характерной особенностью mTPs является присутствие амфипатической α-спирали на N-конце белка, которая распознается мембранно-связанными импортными рецепторами в митохондриях (41–43). Чтобы исследовать эту возможность, GPMAW (44) был использован для предсказания вторичной структуры в N-конце 2′-PDE и был обнаружен вероятный спиральный элемент, покрывающий начальные 27 остатков.Анализ спирального колеса впоследствии подтвердил, что аминокислотные остатки 7-24 соответствуют амфипатической спирали (дополнительный рисунок S1).

Рекомбинантно экспрессируемая 2′-PDE совместно локализуется с митохондриями mTP-зависимым образом

Вдохновленные нашими биоинформатическими открытиями, мы затем захотели экспериментально подтвердить субклеточную локализацию рекомбинантной 2′-PDE, экспрессируемой в линиях клеток человека. Соответственно, конструкцию 2′-PDE ₆₁₅ -His трансфицировали в клетки HeLa, а затем клетки анализировали с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии, в которой митохондрии отслеживались с помощью органеллоспецифического красителя (Mitotracker) и 2′-PDE с помощью антитело к C-концевой His-метке ().Результаты ясно продемонстрировали почти полную совместную локализацию 2′-PDE с митохондриями в этих условиях (A – C). Меченные His конструкции, кодирующие известный локализованный в матрице белок теплового шока 60, Hsp60 (45) и немитохондриальный белок, OAS1-p42 (26), были включены в качестве положительного и отрицательного контролей соответственно. Чтобы подтвердить значимость предсказанного mTP, варианта, не имеющего ожидаемого сигнального пептида, 2′-PDEΔmTP ₆₀₀ -His (A) анализировали аналогичным образом. Этот вариант с делецией показал равномерное распределение по клетке, и, кроме того, было обнаружено, что он не подвергается посттрансляционному процессингу в той же степени, что и полноразмерный белок (M).Учитывая обнаружение неспецифической полосы в иммуноблоттинге в M, было важно убедиться, что перекрестная реактивность анти-His-антитела не препятствовала интерпретации результатов, описанных в A – L. Это было подтверждено проведением параллельных иммунофлуоресцентных анализов на нетрансфицированных клетках HeLa в дополнение к клеткам HeLa, трансфицированным пустым вектором pcDNA3, которые не выявили никакого фонового окрашивания (данные не показаны). Наконец, эти данные, определяющие 2′-PDE как митохондриальный белок, были подтверждены аналогичным окрашиванием, проведенным на трансфицированных 2′-PDE клетках HEK293, которые также показали митохондриальное распределение рекомбинантного белка (дополнительный рисунок S2).

Клеточная локализация и посттрансляционная обработка 2′-PDE. ( A – L ) Изображения с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии клеток HeLa, временно трансфицированных конструкциями, кодирующими 2′-PDE ₆₁₅ -His (A – C), His-tagged Hsp60 (D – F) и контроль OAS1-p42 (G – I) или вариант с делецией 2′-PDEΔmTP ₆₀₀ -His (J – L). Через 36 часов клетки зондировали антителом, специфичным к His-метке (Genscript), и окрашивали вторичным антителом, конъюгированным с FITC (зеленый). Митчондрии визуализировали обработкой живых клеток Mitotracker (красный).Масштабные линейки; 10 мкм. ( M ) Иммуноблоттинг экстрактов белка HeLa, полученных через 36 часов после трансфекции 2′-PDE ₆₁₅ -His и 2′-PDEΔmTP ₆₀₀ -His с использованием антитела, специфичного для His-tag (Genscript). EV (вектор empty-pcDNA3) использовали в качестве отрицательного контроля. Стрелки указывают полноразмерные 2′-PDE, тогда как стрелки обозначают «промежуточные» ( i ) и «зрелые» ( m ) обработанные формы 2′-PDE ₆₁₅ -His. Звездочки указывают на неспецифическую полосу.В каждую дорожку загружали 20 мкг общего клеточного лизата. Обратите внимание, что по практическим причинам результаты были получены с другим антителом против His по сравнению с тем, которое использовалось в.

Таким образом, 2′-PDE, по-видимому, локализуется в митохондриях посредством mTP-зависимого механизма. Присутствие по крайней мере трех форм 2′-PDE при экспрессии в клетках HeLa предполагает, что для генерации зрелой митохондриальной формы 2′-PDE, которая, скорее всего, представлена полосой самого низкого молекулярная масса.Поэтому белковые формы обозначаются «предшественником», «промежуточным звеном» и «зрелым» путем уменьшения размера.

Рекомбинантный 2′-ФДЭ ассоциирует с митохондриальной субклеточной фракцией

Для дальнейшего анализа сложного процессинга и пути локализации 2′-ФДЭ клетки COS-7, временно экспрессирующие белок, были разделены на цитозольную и митохондриальную фракции с помощью дифференциального центрифугирования. клеточных компартментов. В этом случае по практическим причинам использовались клетки COS-7, и обычно предполагается, что они поддерживают функцию импорта и процессинга в митохондрии, очень гомологичную той, которая обнаруживается в клетках человека.В этой установке использовали полноразмерную форму, кодируемую 2′-PDE ₆₁₅ -His, и конструкцию без mTP, 2′-PDEΔmTP ₆₀₀ -His. Если предсказанный mTP действительно функционален, усеченная конструкция должна оставаться в цитозоле и, таким образом, представлять собой соответствующий контроль, который также может подтверждать чистоту митохондриальных фракций, используемых в этих экспериментах. После 36-часовой временной экспрессии иммуноблоттинг His-tag на общем клеточном лизате и митохондриальной фракции четко показал, что 2′-PDE ₆₁₅ -His связывается с митохондриями (A).Напротив, 2′-PDEΔmTP ₆₀₀ -His не нацелен на эту органеллу, а обнаруживается исключительно в цитозольной фракции (B).

Человеческий рекомбинантный и эндогенный 2′-PDE нацелен на митохондрии клеток. ( A ) Иммуноблоттинг на фракциях общего лизата клеток (T) и митохондрий (M), выделенных при временной экспрессии 2′-PDE ₆₁₅ -His в течение 36 часов в клетках COS-7 с использованием антитела, специфичного для His-tag (Genscript ). ( B ) Иммуноблоттинг, как в (A), на 2′-PDEΔmTP ₆₀₀ -His-специфический общий клеточный лизат (T), митхондриальные (M) и цитоплазматические (C) образцы, полученные после 36 часов рекомбинантной экспрессии в COS- 7 сот.В (A) и (B) стрелки указывают 2′-PDE, а звездочками отмечены неспецифические полосы. Двадцать микрограммов общего клеточного лизата / цитоплазмы и 5 мкг митохондриального белка загружали в соответствующие дорожки. ( C ) Внутренние и митохондриально-специфичные пептиды 2′-PDE (красный) в клетках HEK293, как определено с помощью ЖХ-МС / МС триптического гидролизата, приготовленного из всех белков во фракции 6 вне геля (выделено красным на дополнительном рисунке. S4). Обнаруженные y-ионы (верхние красные прямоугольники) и b-ионы (нижние красные прямоугольники) показаны, а остатки Arg (R) / Lys (K) подчеркнуты в последовательности белка.

Идентичность полосы 2′-PDE, связанной с митохондриями, впоследствии была подтверждена с помощью ЖХ-МС / МС триптических пептидов, полученных из всех белков, содержащихся во фракциях митохондрий. Соответственно, в 2′-PDE ₆₁₅ -His-специфическом образце было обнаружено двенадцать пептидов, соответствующих 2′-PDE (дополнительная фигура S3), тогда как ни один не был идентифицирован в митохондриальной фракции клеток, экспрессирующих 2′-PDE ΔmTP ₆₀₀ -Его. И это несмотря на относительно низкую оценку митохондриальной чистоты ~ 39%, основанную на известной локализации широкого спектра других идентифицированных белков в образцах.

Эндогенные 2′-PDE ассоциируются с митохондриями

Поскольку экспрессия белка посредством временной трансфекции потенциально может вызывать артефакты локализации (46), мы решили проверить, локализуется ли эндогенный 2′-PDE также в митохондриях, используя аналогичный подход, основанный на MS. В данном случае использовали клетки человека HEK293 из-за известного высокого уровня экспрессии эндогенного 2′-PDE (9). Митохондриальные фракции были выделены, как и раньше, и сложность белков уменьшилась с помощью изоэлектрического фокусирования вне геля в интервале pH 3–10.В этой установке один митохондриальный препарат был разделен на 12 отдельных образцов, различающихся разницей в pH (дополнительный рисунок S4). Затем отдельные образцы обрабатывали трипсином и анализировали с помощью LC-MS / MS. Два пептида, специфичных для 2′-PDE, были идентифицированы в образце, соответствующем pI, равному приблизительно 6, что согласуется с предсказанным pI, равным 6,11 для полноразмерного 2′-PDE (C). В остальных образцах не было обнаружено 2′-PDE-специфических пептидов. Всего было идентифицировано 545 белков, из которых 225 представляли известные митохондриальные белки, обеспечивающие митохондриальную чистоту ~ 41%.Обратите внимание, что по сравнению с этой специфической ферментативной идентификацией HEK293, пептиды, полученные из эндогенного 2′-PDE, не были идентифицированы в митохондриальном препарате 2′-PDEΔmTP ₆₀₀ -His, выделенном из клеток COS-7 (описанном в предыдущем разделе). В частности, это несоответствие, вероятно, является результатом либо (1) того факта, что образец COS-7 не был фракционирован вне геля перед анализами ЖХ-МС / МС, либо (2) просто тем, что 2′-ФДЭ демонстрирует дифференциальная экспрессия между клетками COS-7 и HEK293.

Синтезированный 2′-ФДЭ

in vitro нацелен на митохондриальный матрикс

Далее мы хотели проанализировать функциональное значение наблюдаемой митохондриальной локализации 2′-ФДЭ, определив, в каком субкомпартменте митохондрий, то есть внешней мембране, происходит межмембранное пространство, внутренняя мембрана или матрица, белок расположен. Присутствие мотива последовательности R2 сразу предполагает, что белок будет локализоваться в матрице, место назначения также поддерживается инструментом субклеточного прогнозирования PSORT (47).Кроме того, серверы трансмембранного предсказания, Phobius (48) и TopPred (49), не обнаружили никаких мембранно-ассоциированных элементов, предполагая, что 2′-PDE, скорее всего, является растворимым матричным белком.

Чтобы подтвердить эту гипотезу, импорт синтезированного in vitro , ³⁵ S-меченного 2′-PDE ₆₁₅ -His в митохондрии исследовали путем инкубации радиоактивного белка с органеллами, полученными из клеток HeLa. Во-первых, был проведен контрольный эксперимент с течением времени, в ходе которого компоненты, т.е.е. ³⁵ S-меченные 2′-PDE и митохондрии смешивали в течение 2–30 минут с последующим гель-электрофоретическим анализом митохондрий, предварительно обработанных протеиназой K, для выявления эффективности импорта (A). В этом случае полосы белка, соответствующие «предшественнику», «промежуточной» и «зрелой» формам 2′-PDE, появлялись с течением времени, показывая, что 2′-PDE ₆₁₅ -His импортируется в митохондрии и одновременно time подвергается N-концевому процессингу, как это наблюдается для рекомбинантно экспрессируемого белка.Кроме того, было обнаружено, что импорт митохондрий зависит от мембранного потенциала через внутреннюю мембрану (Δψ), что согласуется с локализацией в матриксе, поскольку только белки-предшественники, предназначенные для внутренней мембраны или матрикса, а в редких случаях — для межмембранного пространства, показывают Δψ-зависимость при импорте (50).

Митохондриальный импорт радиоактивно меченого 2′-ФДЭ. ( A ) Временной эксперимент, в котором митохондрии ³⁵ S-меченых 2′-PDE ₆₁₅ -His и HeLa инкубировали в течение 2-30 минут с последующим протеолизом неимпортированных белков обработкой протеиназой K ( + ПК).Секвестрированные ³⁵ S-меченные белки были впоследствии разделены с помощью SDS-PAGE и визуализированы с помощью фосфорного изображения. Δψ указывает, был ли нарушен потенциал митохондриальной мембраны (-) или нет (+). Дорожка ввода 10% показывает результат транскрипции / трансляции in vitro перед импортом и относится к общему количеству ³⁵ S-меченых 2′-PDE, добавленных в каждую реакцию импорта (100%). Стрелка отмечает положение 2′-PDE ₆₁₅ -His, а стрелки — расположение обработанных «промежуточных» ( i ) и «зрелых» ( м ) форм.( B ). Эксперимент по экстракции карбоната, в котором импорт осуществляли, как в (A), в течение 30 и 60 минут, после чего митохондрии были разделены путем экстракции карбонатом на белковые фракции, содержащие интегральную мембрану (P) и растворимую и периферическую части мембраны (S). В частности, в то время как дорожки Т обеспечивают общее количество и структуру ³⁵ S-меченого белка после импорта из митохондрий, но до экстракции карбоната, полоса ввода 5% представляет ³⁵ S-2′-PDE ₆₁₅ -His -стартовый материал до импорта и относительно количества, используемого для каждой реакции (100%).(C) Эксперимент с осмотическим набуханием, в котором митопласты (M) были получены после импорта в течение 30 и 60 минут путем осмотического разрыва внешней мембраны с последующим протеолизом (где указано). Звездочкой отмечено, что эта ПК-обработка представляет собой вторую обработку, используемую для удаления доступных белков при удалении внешней мембраны. Показаны также контрольные эксперименты, в которых мембрана не была повреждена (I).

Затем мы хотели выяснить, является ли 2′-PDE частью растворимого митохондриального протеома, представленного матрицей и межмембранным пространством, или, альтернативно, ассоциируется с внутренней митохондриальной мембраной.Чтобы проанализировать это, митохондрии были подвергнуты карбонатной экстракции после импорта пре-белка, метод, который позволяет отделить растворимые и периферические мембранные белки (S) от интегральных мембранных белков (P) (51). В частности, ³⁵ S-меченный 2′-PDE ₆₁₅ -His сначала инкубировали с митохондриями, на этот раз в течение 30-60 минут, после чего органеллы, предварительно обработанные протеиназой К, экстрагировали карбонатом, и полученный фракции анализировали гель-электрофорезом (B).Результаты ясно показали, что 2′-PDE присутствует в растворимой фазе, то есть либо в межмембранном пространстве, либо в матрице.

Осмотически индуцированное набухание митохондрий, при котором внешняя мембрана разрывается за счет снижения внешней концентрации растворенного вещества в митохондриальной суспензии, при этом внутренняя мембрана остается нетронутой, может использоваться для различения белков матрикса от белков, расположенных в межмембранном пространстве. В этом методе белки внутри или перед межмембранным пространством становятся доступными для внешней протеазы, в то время как белки, расположенные в матрице, остаются экранированными.Соответственно, последующее выделение и анализ митопластов, оставшихся частиц, составляющих матрикс, окруженный внутренней мембраной, позволяет различать межмембранное пространство и матричные белки (52). Таким образом, используя митопласты, выделенные из митохондрий HeLa, инкубированных с ³⁵ S-меченым 2′-PDE ₆₁₅ -His в течение 30-60 минут, суборганелларная локализация 2′-PDE может быть определена с помощью гель-анализа (C) . «Зрелый» белок, по-видимому, не подвергался влиянию протеазной обработки изолированных митопластов [дорожки, обозначенные М (митопласты) с обработкой протеиназой К или без нее], что позволяет предположить, что 2′-PDE является матриксным белком.Хотя это формально не исключает того, что 2′-ФДЭ может быть частично встроен во внутреннюю мембрану без каких-либо частей, выступающих в межмембранное пространство, мы уже показали, что 2′-ФДЭ является частью растворимой митохондриальной фазы, и поэтому пришли к выводу, что 2′-ФДЭ является частью растворимой митохондриальной фазы. -ПДЭ является исключительно белком митохондриального матрикса.

2′-PDE содержит домен деаденилазы EEP-типа и является активной 3’– 5 ‘экзорибонуклеазой

Анализ последовательностей показывает, что 2′-PDE содержит так называемый домен нуклеазы EEP и, следовательно, имеет сходство с семейством цитоплазматических деаденилаз CCR4, Nocturnin и ANGEL (дополнительный рисунок S5).Чтобы охарактеризовать активность деаденилазы in vitro 2′-ФДЭ, фермент был гетерологично экспрессирован и очищен от E. coli . При этом матрицы, кодирующие 2′-PDE ₆₁₅ -His и 2′-PDEΔmTP ₆₀₀ -His, были сначала субклонированы в индуцируемый IPTG вектор pTriEx-3 Neo, и эти конструкции трансформировали в E. coli. BL21 (DE3). Затем, перед очисткой, индуцированные IPTG лизаты, экспрессирующие 2′-PDE ₆₁₅ -His и 2′-PDEΔmTP ₆₀₀ -His, соответственно, были протестированы на их способность разрушать 2′-5′-связанный тетрамер аденозина. core (ApApApA), чтобы выявить потенциальное влияние удаления mTP на активность фермента.В частности, было обнаружено, что лизаты разлагают 2’– 5 ‘субстрат с аналогичной эффективностью, что позволяет предположить лишь незначительное влияние (если таковое имеется) mTP на ферментный катализ (дополнительный рисунок S6A). Лизат клеток, трансформированных вектором empty-pTriEx-3 Neo, был использован в качестве контроля и оказался неактивным в соответствии с тем фактом, что 2’– 5 ‘РНК не является естественным субстратом для каких-либо эндогенных клеток E. coli ферменты. Иммуноблоттинг был использован для подтверждения того, что две конструкции одинаково хорошо экспрессируются в штамме BL21 (DE3) (дополнительная фигура S6B).

Следовательно, на основе неизмененной реакции активности (по сравнению с полноразмерной 2′-PDE) был выбран 2′-PDEΔmTP ₆₀₀ -His и очищен до гомогенности (A), чтобы моделировать зрелую митохондриальную форму как насколько это возможно. Во время экспрессии и очистки 2′-PDEΔmTP ₆₀₀ -His также был выделен стабильный продукт разложения ~ 45 кДа, обозначаемый как 2′-PDEΔN ₃₄₄ -His (A). Как 2′-PDEΔmTP ₆₀₀ -His, так и его укороченная форма были активны в деградации 2′-5′-связанных субстратов, но неожиданно укороченный белок оказался более активным, чем 2′-PDEΔmTP ₆₀₀ -His ( Б).Картирование N-конца 2′-PDEΔN ₃₄₄ -His с помощью N-концевого секвенирования показало, что в нем отсутствуют первые 256 остатков по сравнению с 2′-PDEΔmTP ₆₀₀ -His, и он начинается непосредственно перед ядром 2 ‘. -PDE домен нуклеазы (C). Аналогичным образом был проведен иммуноблоттинг, специфичный для His-метки, который подтвердил, что как в 2’-PDEΔmTP ₆₀₀ -His, так и в 2′-PDEΔN ₃₄₄ -His сохраняется C-концевая His-метка (D).

Очистка и проверка 2′-PDE, экспрессированного в E.coli BL21 (DE3). ( A ) Гель, окрашенный кумасси синим, после SDS-PAGE, показывающий 20 мкг очищенного 2′-PDEΔmTP ₆₀₀ -His и 2′-PDEΔN ₃₄₄ -His. Pop2p представляет собой очищенную деаденилазу DEDD-типа из Schizosaccharomyces pombe , используемую в качестве контроля в (B) (20). Стрелки указывают положение указанных белков. Дорожка M содержит маркерные белки различной молекулярной массы. ( B ) Анализ деградации 2′-5′-олигоаденилата в очищенных белковых фракциях из (A) с использованием 2′-5′-тетрамерного олигоаденилата, ApApApA, в качестве субстрата.Деаденилаза Pop2p активна только на 3′-5′-связанной РНК и, таким образом, представляет собой отрицательный контроль для деградации 2′-5′-олигоаденилата. Реакции проводили в трех экземплярах (среднее значение / стандартная ошибка среднего) с использованием 10 мкг белка. ( C ) 2′-PDEΔN ₃₄₄ -His усеченный фрагмент и сравнение с 2′-PDEΔmTP ₆₀₀ -His. Показаны пять секвенированных на N-конце остатков 2′-PDEΔN ₃₄₄ -His (коричневая рамка). ( D ) Иммуноблоттинг белков 2′-PDE из (A) с использованием антитела, специфичного к His-метке (Genscript).Общий лизат клеток HEK293, экспрессирующий 2′-PDE ₆₁₅ -His, использовали в качестве положительного контроля. Стрелки обозначают индивидуальные белки, а острие стрелки обозначает однократно процессируемую форму 2′-PDE ₆₁₅ -His, присутствующую в лизате клеток HEK293. В каждую дорожку загружали 10 мкг общего белка.

Чтобы изучить возможную роль 2′-PDE в деаденилировании РНК, был проведен анализ деградации in vitro с использованием определенных 30-мерных 3′-5′-связанных олигонуклеотидов РНК, флуоресцентно меченных на 5′-конце (A ).Субстрат РНК-Poly (A) содержал общую неструктурированную последовательность РНК из 20 остатков, за которой следовали 10 остатков аденозина, в то время как РНК Stemloop-Poly (A) содержала прочную спиральную структуру из 8 п.н., за которой следовали 10 остатков аденозина (20). Разложение субстратов 2′-PDE отслеживали в экспериментах с течением времени, проводимых с 2′-PDEΔmTP ₆₀₀ -His или 2′-PDEΔN ₃₄₄ -His с использованием денатурирующих гелей РНК (B и C, соответственно. ). Когда 2′-PDEΔmTP ₆₀₀ -His инкубируется с РНК-Poly (A), субстрат удаляется медленно и процессно, что видно по немедленному накоплению небольших фрагментов РНК размером 5-8 н. без появления РНК промежуточной длины.Напротив, усеченный белок, 2′-PDEΔN ₃₄₄ -His, первоначально удаляет только поли (A) хвост из РНК-Poly (A), что видно по накоплению полностью деаденилированных РНК размером 20 нуклеотидов через ~ 10 мин ( C). Однако при более длительной инкубации РНК распадается на небольшие фрагменты размером 4–11 н. 2′-PDEΔmTP ₆₀₀ -His также расщепляет РНК-Poly (C) с разумной эффективностью, демонстрируя, что 2′-PDE неспецифичен по отношению к аденозину. Субстрат РНК-Poly (C) аналогичным образом расщепляется 2′-PDEΔN ₃₄₄ -His, хотя и гораздо медленнее по сравнению с субстратом РНК-Poly (A).Эти результаты предполагают, что 2′-PDE придает некоторую степень предпочтения последовательностям аденозину, но все же обладает способностью разрушать другие последовательности. Это поведение очень похоже на то, что наблюдается для канонических цитоплазматических ферментов деаденилирования (21). 2′-PDEΔN ₃₄₄ -His не только быстрее, чем 2′-PDEΔmTP ₆₀₀ -His, но, по-видимому, работает в более распределенном режиме деградации, что указывает на внутреннюю функциональную значимость N-концевого домена. РНК, содержащие сильную вторичную структуру, также по-разному процессируются двумя вариантами 2′-PDE.В то время как 2′-PDEΔmTP ₆₀₀ -His способен удалять сильный элемент вторичной структуры до фрагментов 4–5 нуклеотидов, короткий вариант, 2′-PDEΔN ₃₄₄ -His, задерживает 2 нуклеотида перед стеблем. Это предполагает, что N-конец 2′-PDE содержит элементы, которые влияют как на процессивность, так и на раскручивание вторичной структуры основного экзонуклеазного домена, наиболее вероятно через РНК-связывающий домен. К сожалению, биоинформатика, похоже, не поддерживает это представление, предполагая, что, если он присутствует, этот РНК-связывающий домен 2′-PDE может существенно отклоняться от известных РНК-связывающих областей.Ни один из вариантов 2′-PDE не был способен расщеплять 2′-дезокси-субстрат, ДНК-Poly (A), который эквивалентен РНК-Poly (A), но в форме ДНК. Кроме того, фракция BL21 (DE3) -специфического белка, полученная из клеток, трансформированных пустым вектором pTriEx-3 Neo и очищенных в соответствии с теми же параметрами, которые использовались для 2′-PDE, была неактивна на всех субстратах РНК (данные не показаны). , что убедительно свидетельствует о том, что любые загрязняющие следы совместно очищенной нуклеазной активности вряд ли повлияют на результаты, наблюдаемые в.

Экзорибонуклеазная активность 3’– 5 ‘2’-ФДЭ человека. ( A ) Последовательность и предсказанная вторичная структура используемых субстратов РНК. ( B и C ) Анализы зависимости от времени, в которых очищенный 2′-PDEΔmTP ₆₀₀ -His (B) или 2′-PDEΔN ₃₄₄ -His (C) инкубировали с определенными РНК (или ДНК, где указано) при 30 ° C в течение указанного количества минут. Олигомер ДНК – Поли (А) был подобен олигомеру РНК – Поли (А), но по форме ДНК. Лестница — это однонуклеотидная лестница, полученная ограниченным щелочным гидролизом субстратов.Контрольные дорожки определяют реакции, в которых РНК (или ДНК) инкубировали в течение 120 мин при 30 ° C в отсутствие фермента.

В заключение, 2′-PDE проявляет общую 3′-5′-рибоэксонуклеолитическую активность с небольшим предпочтением аденозину, как это наблюдается для канонических деаденилаз.

2′-PDE расщепляет 3′-5′-связанную РНК с предпочтением аденозина

Для решения очевидного предпочтения аденозина дополнительно используются два 3′-5′-связанных субстрата (ApApApA, oligo-A и CpCpCpC, oligo -C) были использованы для определения значений Михаэлиса – Ментен K _m и V _max для 2′-PDE.Оба 2′-PDEΔmTP ₆₀₀ -His и 2′-PDEΔN ₃₄₄ -His были способны полностью расщеплять эти короткие субстраты до нуклеозида (аденозина или цитидина соответственно) и 5′-монофосфатного нуклеотида (AMP или CMP). соответственно) по результатам хроматографического анализа продуктов и определения соотношений пиков (∼1: 3) (дополнительный рисунок S7). Для обеих форм 2′-PDE значение K _m на олиго-A составляет примерно половину от измеренного для олиго-C с V _max 1.В 4–1,7 раза выше для субстрата олиго-А (). Таким образом, 2′-PDE обладает более высоким сродством и активностью в отношении полиаденозиновой 3′-5′-связанной РНК и, следовательно, близко соответствует субстратной специфичности цитозольных деаденилаз, определяемой как 3′-5′-экзорибонуклеазы, которые предпочитают РНК, состоящие из аденозинов (21). ).

Таблица 1.

Субстрат	2′-PDEΔmTP ₆₀₀ -His		2′-PDEΔN ₃₄₄ -His
	1 V / с * / пмоль)*	K _м (мкМ)	V _макс. (фмоль AMP * / с * / пмоль)	K _м (мкМ)
олиго-A, ApApApA	11.4 ± 0,5	74 ± 13	18,7 ± 0,8	72 ± 14
олиго-C, CpCpCpC	8,2 ± 0,4	126 ± 26	10,8 ± 0,6	142 ± 31

Существует отрицательная корреляция между 2′-PDE и уровнями экспрессии митохондриальной мРНК

Чтобы выяснить, участвует ли 2′-PDE функционально в обороте митохондриальной РНК, либо как РНК-деаденилаза, либо, альтернативно, как общий фермент распада РНК, клетки HeLa были трансфицированы смесью четырех 2′-PDE миРНК для подавления естественного белка.Через 72 часа после трансфекции была получена общая клеточная РНК и проведена qRT-PCR для оценки эффекта нокдауна 2′-PDE на выбранные митохондриальные мРНК, то есть субъединицу I цитохром с оксидазы (CoxI), CoxII, CoxIII, цитохром b ( CytB), субъединица 4 НАДН-дегидрогеназы (ND4) и ND6. В частности, было обнаружено, что подавление 2′-PDE на ~ 50% не вызывает каких-либо статистических различий в уровнях экспрессии митохондриальной мРНК по сравнению с клетками, трансфицированными контрольной siRNA GFP (A). Несмотря на это, результаты, по-видимому, указывают на небольшую отрицательную корреляцию между 2′-PDE и митохондриальными мРНК, предполагая, что 2′-PDE может в конечном итоге действовать, дестабилизируя эти РНК.

2′-PDE дестабилизирует митохондриальные мРНК. qRT-PCR анализ митохондриальных мРНК после нокдауна ( A ) siRNA или ( B ) сверхэкспрессии 2′-PDE в клетках HeLa, опосредованной плазмидой. В (A) клетки трансфицировали пулом 2′-PDE siRNA и инкубировали в течение 72 часов перед проведением анализа qRT-PCR. Клетки, трансфицированные GFP-специфической миРНК, использовали в качестве отрицательного контроля. В (B) трансфектанты 2′-PDE ₆₁₅ -His анализировали с помощью qRT-PCR через 36 часов после трансфекции.Клетки, обработанные пустым вектором (EV) pcDNA3, использовали в качестве отрицательного контроля. (A и B) Относительную экспрессию рассчитывали путем нормализации уровней экспрессии RPL13A с последующей генной нормализацией, устанавливая контроли на 1. Данные представляют собой средние значения трех повторных реакций qRT-PCR, а полосы ошибок обозначают стандартные отклонения. Оба эксперимента были повторены трижды, каждый раз с аналогичными результатами. Звездочки обозначают те мРНК, которые проявляют дифференциальную экспрессию.

Чтобы проверить и подтвердить эту гипотезу, полноразмерную конструкцию 2′-PDE ₆₁₅ -His (в pcDNA3) трансфицировали в клетки HeLa, и белок сверхэкспрессировался в течение 36 часов.Любой заданный эффект 2′-PDE на митохондриальные мРНК затем оценивали с помощью qRT-PCR, как указано выше. Было обнаружено, что сверхэкспрессия 2′-PDE заметно дестабилизирует митохондриальные мРНК по сравнению с клетками, трансфицированными контрольным пустым вектором pcDNA3 (B). В частности, три из шести мРНК были значительно подавлены, считая мРНК CoxI (28% ↓), CoxIII (34% ↓) и CytB (32% ↓). Остальные мРНК были восстановлены незначительно. Таким образом, в совокупности эти данные выдвигают 2′-PDE в качестве вероятного катаболического игрока, участвующего в обороте митохондриальной РНК.

ОБСУЖДЕНИЕ

Считается, что 2′-PDE человека контролирует клеточный уровень 2-5A посредством специфической деградации, тем самым действуя как негативный регулятор IFN-индуцированной системы 2-5A (9). В этой статье мы представляем убедительные доказательства того, что фермент содержит N-концевой митохондриальный сигнальный пептид и обладает субклеточной локализацией в митохондриальном матриксе. В настоящее время известно, что две локализованные в матриксе пептидазы, MPP и митохондриальная промежуточная пептидаза (MIP), участвуют в созревании митохондриальных белков (53).Небольшое количество кодируемых ядром белков созревает в результате последовательного расщепления MPP и MIP (54). Появление полосы 2′-PDE среднего размера в клетках HeLa может указывать на то, что 2′-PDE претерпевает такое двухступенчатое созревание. Последовательное созревание белков-предшественников происходит за счет распознавания мотива R10, xRx | (F / L / I) xx (S / T / G) xxxx ↓, где вертикальная линия и стрелка указывают сайты расщепления для MPP и MIP, соответственно ( 40). Таким образом, MPP оставляет промежуточное соединение с удлинением N-концевого октапептида, которое впоследствии удаляется MIP (54,55).Однако два открытия показывают, что последняя стадия созревания 2′-PDE не катализируется MIP. Во-первых, в 2′-PDE был обнаружен мотив R2, специфичный для MPP, а не для MIP, а не для мотива R10. Во-вторых, разница в размерах между «промежуточными» и «зрелыми» формами ~ 7 кДа несовместима с удалением октапептида (~ 1 кДа). Следовательно, возможно, что второе событие расщепления при созревании 2′-PDE является результатом активности еще не идентифицированной пептидазы (56,57). Три аналогичные формы 2′-PDE ранее наблюдались в клетках человека, но в данном случае это явление было приписано использованию альтернативных стартовых кодонов трансляции, запускаемых «слабыми» сигналами Козака (9).В частности, консенсус Козака относительно инициации трансляции у позвоночных: (G / A) CCATGG (58). В этом смысле «сильный» сигнал Козака содержит пурин (либо G, либо A) в положении -3 и нуклеотид G в положении +4 относительно аденина инициатора ATG, расположенного в +1 (положение с номером 0 отсутствует. ). Кроме того, «адекватный» консенсус содержит только один из этих сайтов, а «слабый» консенсус — ни одного из них. Действительно, последовательность генома вокруг стартового кодона ATG в 2′-PDE, TTCATGT, представляет «слабый» сигнал Козака, что делает этот триплет ATG склонным к пропуску рибосом.Однако наличие «сильной» последовательности Козака во втором триплете ATG, GCGATGG, кодирующем Met35, делает пропуск рибосом в этом положении крайне маловероятным. Более того, даже несмотря на то, что кодон ATG в Met35 соответствует наблюдаемой разнице в размерах между «предшественником» и «промежуточной» формой (2–4 кДа), следующий триплет ATG, обнаруженный в Met63, несовместим с ~ 7 кДа. который разделяет «промежуточную» и «зрелую» группу. Следовательно, мы утверждаем, что появление трех форм 2′-PDE является результатом процессинга белка, а не использования альтернативных стартовых кодонов трансляции.

Наблюдаемая локализация 2′-PDE в митохондриальном матриксе сразу же показалась загадочной в свете его известной роли в преобладающей ядерной и цитозольной системе 2-5A, предполагающей дополнительную, более специфичную для митохондрий активность этого фермента (24). –29). Основываясь как на функциональном, так и на структурном сходстве 2′-PDE с РНК-деаденилазами, это вполне может быть связано с оборотом митохондриальной РНК (9,15-17). Текущее открытие обратной связи между 2′-PDE и уровнями экспрессии митохондриальной мРНК поддерживает эту гипотезу и демонстрирует, что 2′-PDE может действовать, разрушая эти РНК.Однако остается выяснить, является ли это результатом основной роли в деаденилировании РНК или в общем распаде РНК.

В митохондриях человека как деаденилирование РНК, так и общий распад РНК остается нерешенной проблемой (59,60). Ранее предполагалось, что полинуклеотидфосфорилаза (PNPase) млекопитающих ответственна за деаденилирование РНК в митохондриях (61). Однако открытие того, что PNPase локализована в митохондриальном межмембранном пространстве и что нокдаун не влияет на уровни РНК внутри матричного компартмента, недавно поставило под сомнение эту гипотезу (59).Приведенные здесь данные, определяющие 2′-PDE как общую 3′-5′-экзорибонуклеазу с некоторым предпочтением аденозина, совместимы с тем, что наблюдается для большинства деаденилаз, и, следовательно, согласуются с ролью в деаденилировании РНК (21,22,30– 33). Например, в Saccharomyces cerevisiae основная часть цитоплазматического деаденилирования поддерживается субъединицей Ccr4 комплекса Ccr4-Not (62), большого комплекса, состоящего из семи основных белков, включая две деаденилазы (Ccr4 и Pop2p) (63,64 ). In vitro нуклеазы как Ccr4, так и Pop2p показывают предпочтение поли (A) -содержащим субстратам, но также способны разрушать другие последовательности (21,22,33).Подобно многим ферментам, разрушающим РНК, возможно, что 2′-PDE связывается с другими белками in vivo внутри митохондрий, что более точно определяет его субстраты, но в настоящее время это чистое предположение.

В отличие от исключительного стабилизирующего эффекта, обеспечиваемого поли (А) хвостами, добавленными к цитоплазматическим мРНК, поли (А) хвост митохондриальных мРНК человека, как известно, обеспечивает стабильность и нестабильность РНК, причем результат определяется точным сайт присоединения поли (А) (61,65,66).В частности, митохондриальные мРНК человека могут быть поли (A) модифицированы (i) внутренним полиаденилированием после эндонуклеолитического расщепления РНК или (ii) «нормальным» полиаденилированием, происходящим на зрелых 3′-концах. В первом случае транскрипты помечаются как подлежащие деградации, тогда как во втором они стабилизируются. Предположим, 2′-PDE осуществляет деаденилирование митохондриальной РНК, причем поли (A) хвосты, то есть внутренние добавленные хвосты или зрелые 3′-концевые хвосты, затем составляют главную мишень для 2′-PDE.Хотя это, конечно, остается спекулятивным, способность 2′-PDE дестабилизировать и подавлять митохондриальные мРНК д. Быть совместимой с ролью в процессинге зрелых 3′-концевых хвостов, обычно известных для стабилизации их РНК-мишеней. Напротив, 2′-PDE может также или исключительно обрабатывать внутренние добавленные хвосты и тем самым вызывать дестабилизацию РНК.

Как указано, 2′-PDE не обязательно должны быть отнесены к молекулярной роли в деаденилировании РНК, но, альтернативно, могут, как правило, участвовать в деградации целых митохондриальных РНК.Например, в дрожжах, где митохондриальные РНК, что примечательно, не являются полиаденилированными (67), распад РНК поддерживается большим ферментным механизмом, называемым «митохондриальная деградосома», содержащим активность РНК-геликазы (Suv3p) и 3′-5′-экзорибонуклеазы (Dss1p). (68,69). Основываясь на сходных свойствах, признанных здесь для 2′-PDE, то есть общей 3’– 5′-экзорибонуклеазной активности в сочетании со способностью раскручивать вторичные структуры, митохондриальные РНК человека действительно могут обрабатываться этим ферментом.

Что касается его роли в системе 2-5A, мы предполагаем, что основные молекулы 2-5A, а не их 5′-фосфорилированные варианты, являются естественными субстратами для 2′-PDE.Во-первых, вирусная инфекция вызывает накопление ядер 2-5А, а не 2-5А, до уровней микромолярных величин, предполагающих, что 5′-фосфатаза инициирует катаболизм 2-5А (11,70). Во-вторых, дефосфорилированные и, следовательно, менее заряженные ядерные молекулы 2-5A с большей вероятностью будут пассивно проходить через гидрофобный барьер, образованный внутренней мембраной митохондрий (71,72). Альтернативно, если он не перемещается путем диффузии, расположенный на мембране ядерный носитель растворенного вещества 2-5А, аналогичный АДФ / АТФ-антипортеру, может существовать и транспортировать ядерные молекулы 2-5А в митохондриальный матрикс.Наконец, микромолярные значения K _m, оцененные для 2′-PDE на фосфорилированных 2’– 5 ‘субстратах (15), намного выше по сравнению с наномолярными уровнями 2-5A, достаточными для активации РНКазы L (12), что указывает на что 5’-фосфатаза действительно выполняет начальное расщепление в общем катаболизме 2-5А.

Основываясь на этих выводах, мы представляем модель (), которая помимо учета полного катаболизма 2-5A включает механизм регуляции клеточного уровня 2-5A после воздействия вируса.В этой схеме и РНКаза L, и 5′-фосфатаза активируются уровнями 2-5A в наномолярном диапазоне для (i) освобождения клеток от вирусной инфекции и (ii) защиты от цитотоксических событий, возникающих в результате накопления 2 -5А. Соответственно, при повышении до наномолярного уровня 2-5A не только стимулируют РНКазу L, но одновременно преобразуются в менее токсичные для клеток ядерные молекулы 2-5A. Полученные «ядра» затем концентрируются до микромолярных уровней и транспортируются через внутреннюю мембрану митохондрий в матрикс, где они функционируют как субстраты для 2′-PDE.Обратите внимание, что, несмотря на определение здесь 2′-PDE как митохондриального белка, возможное появление любых немитохондриальных форм, например возникающие в результате альтернативного сплайсинга, создающего изоформы, лишенные N-концевого mTP, в настоящее время не могут быть исключены. В частности, поскольку ожидается, что свойства таких вариантов будут очень похожи на свойства митохондриального белка, ядерные молекулы 2-5A также должны составлять их первичные субстраты. Гипотетическое присутствие немитохондриальных 2′-PDE было включено, чтобы проиллюстрировать еще один фактор, потенциально участвующий в катаболизме 2-5A.

Система 2-5А — регуляция и катаболизм. Обычно клеточная концентрация 2-5A поддерживается ниже наномолярного диапазона (10,73), поддерживая путь в неактивном состоянии. Затем, при увеличении до наномолярного уровня с помощью IFN-индуцированных 2’– 5′-OAS, 2-5As активируют РНКазу L и 5′-фосфатазу, что приводит к деградации вирусной РНК и превращению цитотоксического 2- 5As в дефосфорилированные молекулы ядра 2-5A. Накопление ядер 2-5A молекул до микромолярных концентраций впоследствии приводит к транспорту через внутреннюю мембрану митохондрий в матрицу по еще неустановленному механизму.В митохондриальном матриксе 2′-PDE завершает катаболизм 2-5A за счет деградации входящих ядер 2-5A молекул. Катаболический путь 2-5A обозначен красными стрелками, а возможное участие еще не обнаруженных немитохондриальных 2′-PDE (2′-PDE?) Показано красной пунктирной стрелкой.

В заключение, мы показали, что 2′-PDE, подавляющий регулятор цитоплазматической системы 2-5A, включает в себя локализованный в матриксе митохондриальный белок, который, скорее всего, также участвует в круговороте органеллярной РНК.Остается определить, является ли эта роль в общем распаде РНК или в деаденилировании РНК.

Факторы, индуцируемые гипоксией, активируют промотор CD133 через факторы транскрипции семейства ETS

Abstract

CD133 представляет собой белок клеточной поверхности, который, как сообщается, является маркером раковых стволовых клеток, и, таким образом, считается потенциальной мишенью для лечения рака. Однако механизм, регулирующий экспрессию CD133, еще не изучен. В этом исследовании мы проанализировали активность пяти предполагаемых промоторов (P1 – P5) CD133 в клетках 293 эмбриональной почки человека (HEK) и линии клеток рака толстой кишки WiDr и обнаружили, что активность промоторов, особенно P5, повышается за счет сверхэкспрессия факторов, индуцируемых гипоксией (HIF-1α и HIF-2α).Анализ делеции и мутации идентифицировал один из двух сайтов связывания E-26 (ETS) (EBS) в области P5 как важный для его промоторной активности, индуцированной HIF-1α и HIF-2α. Кроме того, анализ имунопреципитации хроматина продемонстрировал, что HIF-1α и HIF-2α связываются с проксимальным промотором P5 в EBS. Анализ иммунопреципитации показал, что HIF-1α физически взаимодействует с Elk1; однако HIF-2α не связывался с Elk1 или ETS1. Кроме того, нокдаун как HIF-1α, так и HIF-2α приводил к снижению экспрессии CD133 в WiDr.Взятые вместе, наши результаты показали, что HIF-1α и HIF-2α активируют промотор CD133 через белки ETS.

Образец цитирования: Ohnishi S, Maehara O, Nakagawa K, Kameya A, Otaki K, Fujita H, et al. (2013) Факторы, индуцируемые гипоксией, активируют промотор CD133 через факторы транскрипции семейства ETS. PLoS ONE 8 (6): e66255. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066255

Редактор: Каустуб Датта, Медицинский центр Университета Небраски, Соединенные Штаты Америки

Поступила: 6 февраля 2013 г .; Принята к печати: 2 мая 2013 г .; Опубликован: 20 июня 2013 г.

Авторские права: © 2013 Ohnishi et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Это исследование было поддержано грантом на научные исследования (C) Японского общества содействия науке (JSPS) и Мемориальным фондом Ясуда. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Растущее количество доказательств поддерживает идею о том, что небольшая часть недифференцированных клеток участвует в инициации и поддержании роста опухоли. Эти клетки называются раковыми стволовыми клетками (РСК) [1], а CD133 считается маркером РСК в опухолях различных тканей, включая головной мозг [2], простату [3], печень [4], поджелудочную железу [5]. ] и двоеточие [6], [7].

CD133 представляет собой гликопротеин клеточной поверхности, состоящий из пяти трансмембранных областей и двух гликозилированных внеклеточных петель, и имеет молекулярную массу 97–120 кДа [8], [9]. Сообщалось, что транскрипция гена CD133 регулируется пятью альтернативными промоторами: P1, P2, P3, P4 и P5 (рис. 1A) [10]. Недавние исследования показали, что статус метилирования сайтов CpG в P1 и P2 участвует в эпигенетической регуляции CD133 в колоректальных и глиобластомных опухолях [11], [12]. Однако механизмы, лежащие в основе регуляции экспрессии CD133, до конца не изучены.

Рисунок 1. Положение промоторов CD133 P5 и их активность после сверхэкспрессии HIF и в условиях гипоксии.

(A) Схематическое изображение положения пяти промоторов CD133 (P1 – P5) и экзонов 1 (A – E). (B) Активность промотора P1, P2, P3, P4 и P5 в клетках 293 эмбриональной почки человека (HEK) (слева) и клетках WiDr рака толстой кишки человека (справа) после сверхэкспрессии HIF-1α и HIF-2α. (C) Промоторная активность P1, P2, P3, P4 и P5 в клетках HEK293 в условиях нормоксии и гипоксии в течение 3 часов (слева) и 24 часов (справа).(D) Промоторная активность P1, P2, P3, P4 и P5 в клетках WiDr в условиях нормоксии и гипоксии в течение 24 часов.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066255.g001

Повышенная экспрессия факторов, индуцируемых гипоксией (HIF) была зарегистрирована во многих солидных опухолях, а высокие уровни экспрессии HIF-1α обычно связаны с плохой прогноз у онкологических больных, в том числе с колоректальным раком [13] — [15]. HIF представляет собой гетеродимер белков основной спираль-петля-спираль / Per-ARNT-Sim (bHLH-PAS) и состоит из O ₂ -лабильных α-субъединиц и β-субъединиц, действующих вместе для связывания с ДНК на определенные места, называемые элементами реакции на гипоксию (ОПЧ) [16].Из трех типов α-субъединиц наиболее широко изучены HIF-1α и HIF-2α [17].

Считается, что

CSC зависят от HIF-1α и HIF-2α в плане выживания и роста опухоли [18]. Кроме того, несколько линий доказательств предполагают, что HIF способствуют размножению CD133-положительных клеток глиомы [19] или экспрессии CD133 в клетках рака легких [20]; однако, как экспрессия маркерного белка CSC регулируется HIF-1α и HIF-2α, остается в значительной степени неизвестным.

Таким образом, мы исследовали активность промоторов CD133 после сверхэкспрессии HIF-1α и HIF-2α и идентифицировали ETS-сайт связывания E-26 (ETS) (EBS) в качестве мишени для HIF-1α и HIF-2α.Впоследствии мы исследовали связывание HIF-1α и HIF-2α в EBS и регулируют ли HIF-1α и HIF-2α экспрессию CD133 в клетках рака толстой кишки.

Материалы и методы

Ячейки

клеток HEK 293 (предоставленных RIKEN BRC через Национальный проект биоресурсов MEXT, Япония) и клеточной линии WiDr рака толстой кишки человека (предоставлено Health Science Research Resources Bank, Осака, Япония) культивировали в модифицированном Dulbecco’s Eagle’s среда (Вако, Осака, Япония) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (Invitrogen, Carlsbad, CA), 100 Ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина (Invitrogen), и инкубировали при 37 ° C в условиях нормоксии (20% O ₂, 5% CO ₂) или гипоксия (1% O ₂, 5% CO ₂).

Плазмиды и малые интерферирующие РНК (миРНК)

Комплементарные кДНК HIF-1α, HIF-2α, ETS1 и Elk1 были получены с помощью RT-PCR, и полученные фрагменты были клонированы в векторы pCMV-3 × FLAG и pCI-neo-2 × S, которые были сконструированы путем вставки олигонуклеотидов. кодирование 3 × FLAG и 2 × S тегов в векторы pcDNA3.1 (Invitrogen) и pCI-neo (Promega, Мэдисон, Висконсин, США) соответственно. O ₂ -стабильные мутанты HIF-1α (P402 / 564A) и HIF-2α (P405 / 531A) и доминантно-отрицательные мутанты ETS1 и Elk1 (ETS1-DN; аминокислоты 350–485 и Elk1-DN; амино кислоты 1–168 соответственно) были получены методом ПЦР.Клоны CD133, содержащие промоторные фрагменты P1-P5-Luc и -1368, -768, -368, -25-Luc из P5, были предоставлены доктором С. Танака из Университета Хоккайдо, Япония [21]. Мутанты двух EBS (EBS1 и EBS2) в промоторе P5 были сконструированы путем введения заменяющих мутаций в коровую последовательность ETS (GGAA на TTAA) с использованием метода на основе ПЦР. миРНК для HIF-1α и HIF-2α были приобретены в Qiagen (Hilden, Германия).

Переходная трансфекция и анализ репортерного гена

Клетки высевали с плотностью 1 × 10 ⁵ клеток в 24-луночные планшеты, содержащие 500 мкл культуральной среды.После инкубации в течение 24 часов при 37 ° C клетки трансфицировали 100 нг люциферазной плазмидной ДНК с 10 нг вектора Renilla pGL4.75 (hRluc-CMV) (Promega) в качестве внутреннего контроля, используя липофектамин 2000 (Invitrogen). Анализ репортерного гена выполняли с использованием системы анализа репортерной двойной люциферазы (Promega), а интенсивность люминесценции измеряли с использованием AB-2000 Luminescencer-PSN (Atto, Токио, Япония) в соответствии с протоколом производителя. Активность транскрипции нормализовали по активности люциферазы Renilla.Эксперименты проводили в трех экземплярах.

Количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией в реальном времени (qRT-PCR)

Суммарную РНК

экстрагировали из клеток с использованием набора RNeasy Mini Kit (Qiagen) в соответствии с инструкциями производителя. РНК количественно определяли спектрометрическим методом, а качество подтверждали гель-электрофорезом. Один микрограмм общей РНК подвергали обратной транскрипции в кДНК с использованием обратной транскриптазы M-MLV (Invitrogen). ПЦР-амплификацию проводили в 50 мкл, содержащих 1 мкл кДНК, и 25 мкл смеси Platinum SYBR Green PCR Mix (Invitrogen).мРНК β-актина, амплифицированная из тех же образцов, служила внутренним контролем. После начальной денатурации при 95 ° C в течение 2 минут использовалась процедура двухэтапного цикла (денатурация при 95 ° C в течение 15 секунд, отжиг и удлинение при 60 ° C в течение 1 минуты) в течение 40 циклов в детекторе последовательности 7700 ( Прикладные биосистемы). Уровни экспрессии генов определяли с использованием метода сравнительного порогового цикла (ddCt) с β-актином в качестве эндогенного контроля. Данные анализировали с помощью программного обеспечения Sequence Detection Systems (Applied Biosystems).

Вестерн-блоттинг

Клетки промывали ледяным трис-буферным физиологическим раствором (TBS) (-) и лизировали в 1 × SDS буфере для образцов, содержащем 2% 2-меркаптоэтанол. Образцы нагревали при 95 ° C в течение 5 минут, а затем подвергали электрофорезу в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE). Разделенные белки переносили на мембраны из поливинилидендифторида (PVDF) Immobilon-P (Millipore, Bedford, MA), которые затем инкубировали в TBS с 0,05% Tween 20 (TBST), содержащим 5% сухого обезжиренного молока, в течение 30 минут при комнатной температуре.Мембраны зондировали первичными антителами к HIF-1α (1-250, BD Biosciences, Бедфорд, Массачусетс), HIF-2α (1-200, Santa Cruz Biotechnology, Санта-Крус, Калифорния), CD133 (1-1000, Cell Signaling, Danvers, MA), и связанные антитела детектировали с помощью меченных пероксидазой кроличьих или мышиных антител (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) и визуализировали с использованием реагентов для обнаружения субстратов Immobilon Western Peroxidase (HRP) Substrate (Millipore).

Анализ иммунопреципитации хроматина (ChIP)

ячеек WiDr (1.8 × 10 ⁶ клеток) высевали в чашку 10 см с 10 мл культуральной среды. После инкубации в течение 24 часов при 37 ° C клетки трансфицировали 4000 нг плазмиды, кодирующей HIF-1α и HIF-2α с меткой FLAG. После того как инкубационный период продлили на 48 часов при 37 ° C, клетки фиксировали 1% формальдегидом, а затем хроматин впоследствии получали с использованием ChIP-IT ^® Express Kit (Active Motif, Карлсбад, Калифорния) и обрабатывали ультразвуком. Иммунопреципитацию проводили с использованием 15 мкг срезанного хроматина и 2 мкг антитела против FLAG (Sigma, St.Луис, Миссури). ДНК, собранную с помощью ChIP, амплифицировали с помощью qRT-PCR. Праймер-мишень был разработан для расположения P5 между -98 и +10 (5′-CAGTGTCTCCCCAGAGAG-3 ‘и 5′-GCAACTTCTACCAGCCTAAGG-3′). Для нормализации конструировали контрольный праймер для экзона 2 CD133 (5’-GGAACACGCTTGCCTTCCCCA-3 ‘и 5′-CCCAGCAGCAACAGGGAGCC-3’).

Иммунопреципитация

клеток HEK293 или WiDr (5 × 10 ⁵ клеток соответственно) высевали в чашки диаметром 6 см с 6 мл культуральной среды. После инкубации в течение 24 часов при 37 ° C клетки трансфицировали 8000 нг плазмидной ДНК (5000 нг S-меченных HIF-1α или HIF-2α и 3000 нг факторов транскрипции ETS, меченных FLAG).После инкубации в течение 48 часов при 37 ° C клетки лизировали в 0,4 мл буфера для лизиса, содержащего 20 мМ трис-HCl (pH 7,5), 137 мМ NaCl, 0,5% NP-40, 0,5 мМ дитиотреитол (DTT), полный коктейль ингибиторов протеаз. (Roche, Мангейм, Германия) и коктейль ингибиторов фосфатазы (Sigma), затем предварительно очищали центрифугированием при 15000 об / мин в течение 15 минут при 4 ° C. Супернатант собирали в виде лизата целых клеток. Иммунопреципитацию проводили с использованием агарозы FLAG M2 (Sigma), и лизат целых клеток (360 мкл) добавляли в 10 мкл агарозы FLAG M2, затем вращали в течение 1 часа при 4 ° C.После промывания буфером для лизиса антиген элюировали, используя 200 мкг / мл пептида 3 × FLAG (Sigma) в TBS, затем предварительно очищали центрифугированием при 5000 об / мин в течение 2 минут при 4 ° C. Буфер для образца 5 × SDS, содержащий 10% 2-меркаптоэтанол, добавляли к собранному супернатанту и определяли как загрузочный образец. Эти образцы анализировали вестерн-блоттингом с использованием антител против FLAG M2 и антител против S-tag (Novagen, Madison, WI) или антител к HIF-1α и HIF-2α.

Статистический анализ

Данные выражены как среднее значение ± стандартная ошибка (S.E.). Сравнение параметров между группами проводилось с помощью одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим применением критерия Ньюмана-Кеулса. Различия считались значимыми при P <0,05.

Результаты

HIF-1α и HIF-2α активируют промотор CD133

Чтобы выявить молекулярные механизмы экспрессии гена CD133, мы сначала использовали клетки HEK293. Анализ репортерного гена показал, что базальная активность P5 была самой высокой среди пяти предполагаемых промоторов CD133, а сверхэкспрессия HIF-1α и HIF-2α увеличивала активность всех промоторов (рис.1Б). В частности, активность промотора P5 повышалась примерно в 4 и 2,5 раза после сверхэкспрессии HIF-1α и HIF-2α, соответственно. Клетки WiDr рака толстой кишки человека имели эффект, аналогичный эффекту клеток HEK293 (фиг. 1B). Хотя активность промотора P5 повышалась при гипоксии, степень усиления не была такой огромной, как при сверхэкспрессии HIF-1α или HIF-2α в клетках HEK293 и WiDr (рис. 1C и 1D, соответственно).

Область между -98 и -25 необходима для усиления активности промотора CD133 P5 с помощью HIF-1α и HIF-2α

Для определения области промотора P5, необходимой для HIF-1α- и HIF-2α-индуцированной активации, мы выполнили анализы репортерного гена с использованием серии мутантов с делецией промотора P5 (pGL3enh-P5-768 bp, -368 bp, — 98 п.н., -25 п.н.).Без сверхэкспрессии HIF-1α или HIF-2α делеция до -98 п.н. демонстрировала наивысшую активность; однако дальнейшая делеция до -25 п.н. привела к значительному снижению активности (рис. 2А), предполагая, что для активности промотора требуется область между -98 и -25 п.н. Повышение активности P5 с помощью HIF-1α и HIF-2α сохранялось до удаления до -98; однако при дальнейшей делеции до -25 наблюдалось заметное снижение активности промотора. HIF-1α и HIF-2α дозозависимо увеличивали активность промотора P5 — 98 п.н. соответственно (рис.2Б).

Рисунок 2. Делеционный анализ активности промотора CD133 P5 и дозозависимый эффект HIF.

(A) Люциферазная активность в клетках эмбриональной почки человека (HEK) 293, трансфицированных серией делеционных мутантов промоторов CD133 P5 и HIF-1α или HIF-2α. (B) Активность промотора P5 -98 п.н. клеток HEK293, трансфицированных другой дозой HIF-1α и HIF-2α.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066255.g002

EBS требуется для активности промотора CD133 P5

Область между -98 и -25 п.н. промотора P5 содержит два EBS [21], [22].Чтобы определить, требуются ли эти EBS для активации промотора HIF-1α и HIF-2α, были сконструированы мутанты EBS (mEBS1 и mEBS2), и был проведен анализ репортерного гена. Активность промотора мутанта проксимального сайта (mEBS2) значительно снижалась при сверхэкспрессии HIF-1α или HIF-2α (фиг. 3A). Чтобы исследовать участие белков семейства ETS в этой области, были сконструированы два доминантно-отрицательных мутанта ETS (ETS1-DN и Elk1-DN) и проанализирована промоторная активность P5 — 98 п.н.Активность промотора, управляемая HIF-1α и HIF-2α, снижалась ETS1-DN и Elk1-DN, соответственно, предполагая, что HIF-1α и HIF-2α регулируют активность промотора P5 — 98 п.н. через белки семейства ETS (рис. 3B и 3С).

Рисунок 3. Влияние HIF и доминантно-отрицательных форм семейств ETS на промотор P5 — 98 п.н.

(A) Люциферазная активность промотора P5 — 98 п.н. с мутацией в двух предполагаемых EBS (mEBS1 и mEBS2) после сверхэкспрессии HIF-1α или HIF-2α с использованием клеток 293 эмбриональной почки человека (HEK).(B, C) Люциферазная активность промотора P5 — 98 п.н. в клетках HEK293 после сверхэкспрессии HIF-1α или HIF-2α вместе с доминантно-отрицательными формами семейств ETS (ETS1-DN и Elk1-DN).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066255.g003

На экспрессию белков семейства ETS не влияет сверхэкспрессия HIF-1α и HIF-2α

Поскольку промотор P5 -98 п.н. не содержит HRE, мы предположили, что HIF-1α и HIF-2α активируют промотор P5 -98 п.н. посредством позитивной регуляции белков семейства ETS.Однако вестерн-блоттинг (фиг. 4A) и анализ qRT-PCR (фиг. 4B) продемонстрировали, что уровни экспрессии ETS1 и Elk1 не изменились после сверхэкспрессии HIF-1α или HIF-2α, соответственно. Эти результаты предполагают, что HIF-1α и HIF-2α активируют промотор P5 -98 п.н. не за счет активации белков семейства ETS, а посредством других механизмов, включающих белки семейства ETS.

Рисунок 4. Эффект сверхэкспрессии HIF на экспрессию факторов транскрипции ETS-семейства.

(A) Вестерн-блот-анализ факторов транскрипции HIF-1α, HIF-2α и семейства ETS после сверхэкспрессии HIF-1α или HIF-2α с использованием клеток 293 эмбриональной почки человека (HEK).β-актин — это внутренний контроль. (B) Количественная ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени (qRT-PCR) факторов транскрипции семейства ETS после сверхэкспрессии HIF-1α или HIF-2α с использованием клеток HEK293. Данные представлены относительно экспрессии β-актина.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066255.g004

HIF-1α связывается с проксимальным промотором CD133 P5 через Elk1

Затем мы исследовали, связываются ли HIF-1α и HIF-2α с промотором CD133 P5 — 98 п.н. через белки ETS в клетках WiDr рака толстой кишки человека, которые в большом количестве экспрессируют мРНК и белок CD133.Анализ ChIP показал, что FLAG-меченный O ₂ -стабильный HIF-1α или мутант HIF-2α связывался с областью от -98 до +10 пар оснований промотора P5, который включает EBS2, более эффективно, чем с FLAG. пустой вектор с меткой (рис. 5А). Эти результаты предполагают, что HIF-1α и HIF-2α связываются с промотором CD133 P5 через белки ETS. Затем мы использовали анализ коиммунопреципитации, чтобы исследовать, связываются ли HIF-1α и HIF-2α с белками ETS в HEK293, а также WiDr. Как показано на фиг. 5B, HIF-1α связывается с Elk1, но не с ETS1 как в HEK293, так и в WiDr.Однако HIF-2α не связывался с Elk1 или ETS1. Повышающая регуляция промотора P5 с помощью HIF-1α значительно подавлялась нокдауном Elk1 (фиг. 5C). Гипоксия не влияла на количество связывания HIF-1α и Elk1 (фиг. 5D).

Рисунок 5. Связывание HIF с проксимальным промотором CD133 P5 и белками семейства ETS.

(A) Анализ иммунопреципитации хроматина (ChIP), показывающий связывание O ₂-стабильных HIF-1α и HIF-2α (HIF-1α-P / A и HIF-2α-P / A, соответственно) с CD133 Промотор P5 (от -98 до +10 п.н.) в клетках WiDr.(B) IP-вестерн-блоттинг, показывающий связывание HIF-1α-P / A и HIF-2α-P / A с ETS1 или Elk1 с использованием клеток 293 эмбриональной почки человека (HEK) (слева) и клеток WiDr (справа). (C) Люциферазная активность промотора P5 — 98 п.н. в клетках HEK293 после сверхэкспрессии HIF-1α вместе с нокдауном Elk1. * P <0,05 по сравнению со сверхэкспрессией HIF-1α. (D) IP-вестерн-блоттинг, показывающий связывание HIF-1α с Elk1 в условиях нормоксии и гипоксии в клетках HEK293.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0066255.g005

Активность проксимального промотора P5 и экспрессия CD133 регулировались HIF-1α и HIF-2α в CD133-положительной линии клеток рака толстой кишки WiDr

Чтобы проверить механизмы, наблюдаемые в клетках HEK293, мы повторили наши эксперименты с использованием клеток WiDr. Анализ репортерного гена проводили на промоторе P5 — 98 п.н., который показал, что активность промотора значительно снижалась при нокдауне как HIF-1α, так и HIF-2α (фиг. 6A). Кроме того, нокдаун Elk1, но не ETS1, значительно снижает активность промотора P5 — 98 п.н. (рис.6Б). Снижение активности промотора P5 -98 п.н. за счет нокдауна как HIF-1α, так и HIF-2α восстанавливается после сверхэкспрессии как HIF-1α, так и HIF-2α (фиг. 6C).

Рисунок 6. Эффект нокдауна HIF или ETS на активность и экспрессию промотора CD133 в клетках WiDr.

(A) Активность промотора P5 — 98 п.н. при нокдауне HIF-1α и HIF-2α. (B) Активность промотора P5 -98 п.н. при нокдауне семейств ETS. (C) Активность промотора P5 — 98 п.н. после сверхэкспрессии HIF-1α и HIF-2α через 24 часа после нокдауна HIF-1α и HIF-2α в условиях нормоксии и гипоксии.(D) Количественный анализ ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени (qRT-PCR) CD133 при нокдауне HIF-1α и HIF-2α. * P <0,05 по сравнению с контрольной миРНК (siCont). (E) Вестерн-блоттинг HIF-1α и HIF-2α и CD133 при нокдауне HIF-1α и HIF-2α. β-актин - это внутренний контроль.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066255.g006

Чтобы подтвердить действие HIF-1α и HIF-2α на транскрипты и белки CD133, в нормоксических условиях проводили qRT-PCR и вестерн-блоттинг.В соответствии с результатами анализа репортерного гена, экспрессия мРНК CD133 и белка снижалась, когда подавлялись как HIF-1α, так и HIF-2α (фиг. 6D и 6E, соответственно).

Обсуждение

В этом исследовании мы сосредоточились на регуляции CD133 с помощью HIF-1α и HIF-2α и продемонстрировали, что 1) HIF-1α и HIF-2α повышают активность промотора CD133, особенно P5, 2) HIF-1α. и HIF-2α связываются с проксимальным промотором CD133 P5 в EBS, 3) HIF-1α физически взаимодействует с Elk1 и 4) экспрессия CD133 регулируется HIF-1α и HIF-2α в клетках рака толстой кишки.

Среди пяти альтернативных промоторов CD133, P1, как сообщается, наиболее сильно связан с индуцированной гипоксией активностью промотора и экспрессией гена CD133 в клеточных линиях рака легких [20]. Кроме того, Oct3 / 4 и Sox2, оба из которых индуцируются HIF-1α и HIF-2α, способствовали экспрессии CD133 посредством их прямого взаимодействия с промотором P1. Напротив, наше наблюдение продемонстрировало, что P5, но не P1, имел самую высокую активацию за счет сверхэкспрессии HIF-1α и HIF-2α в клетках HEK293 и WiDr (рис.1С и Г). Мы предполагаем, что эти различия связаны с использованием разных клеточных линий, разных условий гипоксии (0,1% против 1%) и разных конструкций промотора P1; длина промотора P1 была значительно больше, чем в данном исследовании (1800 п.н. против 1368 п.н.) [20]. В соответствии с нашими результатами, также сообщалось, что активность P5 была самой высокой в линии клеток рака толстой кишки Caco-2 [21]. Поэтому мы сосредоточились на регуляции активности промотора P5 с помощью HIF-1α и HIF-2α независимо от гипоксии.

Наши результаты предполагают, что HIF-1α и HIF-2α участвуют в регуляции транскрипции CD133. Однако P5 не включает HRE, а вместо этого включает два EBS.

Наши результаты согласуются с результатами предыдущего исследования, в котором избыточная экспрессия ETS2-DN и Elk1-DN значительно снижала активность промотора P5 в клетках рака толстой кишки [21]. Семейство ETS включает ядерные фосфопротеины, участвующие во многих биологических процессах, таких как рост, дифференцировка и выживание клеток [23].Недавно было сообщено, что HIF-1α и HIF-2α физически и функционально связаны с факторами транскрипции семейства ETS. Например, ETS вариант-4 (ETV4), член семейства белков ETS, может активировать промотор пролил-4-гидроксилазного домена 2 (PHD2) во взаимодействии с HIF-1α через сайт связывания HIF [24], и HIF-2α активирует промотор VE-кадгерина независимо от гипоксии и в синергии с ETS1 через EBS [25]. Кроме того, анализ глутатион-S-трансферазы (GST) показал, что HIF-2α физически взаимодействует с ETS1 [26], а анализ иммунопреципитации показал, что HIF-2α образует комплекс с Elk1 в MCF7 (рак груди) и 786-O. (почечно-клеточная карцинома) клетки [27].Таким образом, мы предположили, что HIF-1α и HIF-2α регулируют активность промотора CD133 через факторы транскрипции семейства ETS. В настоящем исследовании было обнаружено, что EBS2, расположенный в области между -98 п.н. и -25 п.н., необходим для HIF-индуцированной активации промотора P5. Кроме того, анализ ChIP показал, что HIF-1α и HIF-2α связываются с проксимальным промотором P5, несущим EBS2, а HIF-1α физически взаимодействует с Elk1. Эти данные убедительно свидетельствуют о том, что HIF-1α транскрипционно активирует промотор P5 через EBS2, образуя комплекс с Elk1.Хотя мы не смогли обнаружить физическое взаимодействие между HIF-2α и ETS1 или Elk1 (рис. 5B), анализ ChIP показал, что HIF-2α связывается с проксимальным промотором P5, несущим EBS (рис. 5A), что позволяет предположить, что HIF-2α регулирует промотор P5 через взаимодействие с другими белками семейства ETS. Дальнейший анализ необходим для идентификации факторов транскрипции семейства ETS, которые участвуют в опосредованной HIF-2α активации промотора P5.

Наши наблюдения показывают, что HIF-1α и HIF-2α регулируют транскрипцию CD133; однако активность промотора не была значительно повышена гипоксией.В отличие от наших результатов, сообщалось, что гипоксия подавляет транскрипцию CD133 и что передача сигналов mTOR и HIF-1α участвуют в регуляции экспрессии CD133 [28]. Хотя причина этого неясна, возможно, что HIF регулируются другими механизмами, такими как передача сигналов ras-митоген-активируемой протеинкиназой (RAS-MAPK). Недавно было продемонстрировано, что сигнальный путь ras / внеклеточной одиночно-активируемой киназы (RAS / ERK) способствует транскрипции CD133 в раковых клетках толстой кишки [21].Кроме того, ингибирование пути фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K) -Akt или ERK1 / 2 снижает вызванную гипоксией экспансию CD133 в клетках глиомы [19]. HIF-1α может быть стабилизирован не только посредством гипоксии, но также посредством онкогенных сигнальных путей, включая RAS, а ERK1 / 2 может непосредственно фосфорилировать HIF-1α [29], [30]. Также было показано, что HIF-1α обладает стыковочным доменом MAPK и связывается с ERK2 [31]. Следовательно, наше наблюдение может означать, что сигнальный путь RAS / ERK способствует транскрипции CD133 через HIF-1α и HIF-2α, независимо от гипоксии.

Недавно было продемонстрировано, что экспрессия CD133 повышается при гипоксии HIF-1α-зависимым образом в раковых клетках поджелудочной железы, а нокдаун HIF-1α частично отменяет повышенную экспрессию CD133 при гипоксии [32]. Кроме того, гипоксия способствовала размножению CD133-положительных стволовых клеток глиомы за счет активации HIF-1α, а уровень экспрессии CD133 повышался при химической гипоксии в клеточных линиях рака почки [19], [33]. Кроме того, гипоксия индуцировала экспрессию CD133 в клетках рака легких человека за счет активации Oct3 / 4 и Sox2 посредством HIF-1α и HIF-2α [20].Однако в настоящем исследовании гипоксия не влияла на экспрессию CD133 в клетках WiDr (данные не показаны), а повышение активности промотора P5 в условиях гипоксии не было таким значительным, как при сверхэкспрессии HIF-1α или HIF-2α в HEK293 и Клетки WiDr (рис. 1B-D). Кроме того, нокдаун как HIF-1α, так и HIF-2α в условиях нормоксии подавлял экспрессию CD133 в WiDr (фиг. 6D и 6E). Эти результаты предполагают, что HIF1-α и HIF-2α регулируют активность промотора и экспрессию CD133 независимо от гипоксии в клетках рака толстой кишки.В соответствии с нашими результатами также было продемонстрировано, что HIF-1α увеличивает частоту инициирующих опухоль клеток in vivo частично за счет регуляции экспрессии CD133 и пути Notch в клетках рака молочной железы [34].

В совокупности результаты настоящего исследования позволяют предположить, что HIF-1α и HIF-2α регулируют экспрессию CD133, контролируя активность промотора CD133, возможно, через белки ETS. Выяснение механизмов, лежащих в основе регуляции транскрипции маркеров раковых стволовых клеток, таких как CD133, может привести к разработке новой мишени для уничтожения CSC.

Благодарности

Благодарим Рику Нагашиму за техническую помощь.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: SO KN HT. Проведены эксперименты: СО ОМ АК КО HF RH KT. Проанализированы данные: СО КН МА НС МК ХТ. Внесенные реактивы / материалы / инструменты для анализа: OM KN AK KO HF RH HT. Написал статью: SO KN HT.

Ссылки

1. Visvader JE, Lindeman GJ (2008) Раковые стволовые клетки в солидных опухолях: накопление доказательств и нерешенные вопросы.Нат Рев Рак 8: 755–768.
2. Сингх С.К., Хокинс С., Кларк И.Д., Сквайр Дж. А., Баяни Дж. И др. (2004) Идентификация клеток, инициирующих опухоль головного мозга человека. Природа 432: 396–401.
3. Collins AT, Berry PA, Hyde C, Stower MJ, Maitland NJ (2005) Проспективная идентификация онкогенных стволовых клеток рака простаты. Cancer Res 65: 10946–10951.
4. Инь С., Ли Дж., Ху Ц., Чен Х, Яо М. и др. (2007) CD133-положительные клетки гепатоцеллюлярной карциномы обладают высокой способностью к онкогенности.Int J Cancer 120: 1444–1450.
5. Hermann PC, Huber SL, Herrler T., Aicher A, Ellwart JW и др. (2007) Различные популяции раковых стволовых клеток определяют рост опухоли и метастатическую активность при раке поджелудочной железы человека. Стволовая клетка 1: 313–323.
6. O’Brien CA, Pollett A, Gallinger S, Dick JE (2007) Клетка рака толстой кишки человека, способная инициировать рост опухоли у мышей с иммунодефицитом. Природа 445: 106–110.
7. Риччи-Витиани Л., Ломбарди Д.Г., Пилоцци Е., Биффони М., Тодаро М. и др.(2007) Идентификация и распространение клеток, вызывающих рак толстой кишки человека. Природа 445: 111–115.
8. Миралья С., Годфри В., Инь А.Х., Аткинс К., Варнке Р. и др. (1997) Новый пятитрансмембранный антиген гемопоэтических стволовых клеток: выделение, характеристика и молекулярное клонирование. Кровь 90: 5013–5021.
9. Инь А.Х., Миралья С., Занджани Э.Д., Алмейда-Порада Г., Огава М. и др. (1997) AC133, новый маркер гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников. Кровь 90: 5002–5012.
10. Шмелков С.В., Джун Л., Сент-Клер Р., МакГарригл Д., Дердериан К.А. и др. (2004) Альтернативные промоторы регулируют транскрипцию гена, кодирующего поверхностный белок стволовых клеток AC133. Кровь 103: 2055–2061.
11. Табу К., Сасай К., Кимура Т., Ван Л., Аоянаги Э. и др. (2008) Гипометилирование промотора регулирует экспрессию CD133 в глиомах человека. Cell Res 18: 1037–1046.
12. Yi JM, Tsai HC, Glöckner SC, Lin S, Ohm JE и др. (2008) Аномальное метилирование ДНК CD133 в колоректальных опухолях и опухолях глиобластомы.Cancer Res 68: 8094–8103.
13. Semenza GL (2003) Ориентация на HIF-1 для лечения рака. Nat Rev Cancer 3: 721–732.
14. Рашид С., Харрис А.Л., Теккис П.П., Терли Х., Сильвер А и др. (2009) Факторы, индуцируемые гипоксией-1альфа и -2альфа, экспрессируются в большинстве случаев рака прямой кишки, но только индуцируемый гипоксией фактор-1альфа связан с прогнозом. Br J Cancer 100: 1666–1673.
15. Баба Й., Ношо К., Шима К., Ирахара Н., Чан А.Т. и др. (2010) Сверхэкспрессия HIF1A связана с плохим прогнозом в когорте из 731 колоректального рака.Am J Pathol 176: 2292–2301.
16. Wang GL, Jiang BH, Rue EA, Semenza GL (1995) Фактор 1, индуцируемый гипоксией, представляет собой гетеродимер PAS с основной спиралью, петлей, спиралью, регулируемый напряжением O2 в клетке. Proc Natl Acad Sci U S A 92: 5510–5514.
17. Loboda A, Jozkowicz A, Dulak J (2010) Факторы транскрипции HIF-1 и HIF-2 — похожи, но не идентичны. Mol Cells 29: 435–442.
18. Хеддлстон Дж., Ли З., Латиа Дж., Бао С., Хьелмеланд А. и др. (2010) Факторы, индуцируемые гипоксией в раковых стволовых клетках.Br J Cancer 102: 789–795.
19. Соеда А., Парк М., Ли Д., Минц А., Андруцеллис-Теотокис А. и др. (2009) Гипоксия способствует размножению CD133-положительных стволовых клеток глиомы за счет активации HIF-1альфа. Онкоген 28: 3949–3959.
20. Iida H, Suzuki M, Goitsuka R, Ueno H (2012) Гипоксия индуцирует экспрессию CD133 в клетках рака легких человека за счет активации OCT3 / 4 и SOX2. Int J Oncol 40: 71–79.
21. Табу К., Кимура Т., Сасай К., Ван Л., Бизен Н. и др.(2010) Анализ альтернативного человеческого промотора CD133 показывает участие пути Ras / ERK в опухолевых стеблоподобных признаках. Молекулярный рак 9: 39
22. Fisher RJ, Mavrothalassitis G, Kondoh A, Papas TS (1991) Высокоаффинные ДНК-белковые взаимодействия клеточного белка ETS1: определение связывающего мотива ETS. Онкоген 6: 2249–2254.
23. Sharrocks AD (2001) Семейство факторов транскрипции ETS-домена. Nat Rev Mol Cell Biol 2: 827–837.
24.Wollenick K, Hu J, Kristiansen G, Schraml P, Rehrauer H, et al. (2012) Скрининг синтетической трансактивации показывает, что ETV4 является широким коактиватором передачи сигналов фактора, индуцируемого гипоксией. Nucleic Acids Res 40: 1928-1943.
25. Ле Бра А, Лионнетон Ф., Мэтто В., Лельевр Э., Каэтано Б. и др. (2007) HIF-2alpha специфически активирует промотор VE-кадгерина независимо от гипоксии и в синергии с Ets-1 через два основных сайта связывания ETS. Онкоген 26: 7480–7489.
26. Элверт Г., Каппель А., Хайденрайх Р., Энглмайер Ю., Ланц С. и др. (2003) Совместное взаимодействие индуцируемого гипоксией фактора-2альфа (HIF-2альфа) и Ets-1 в транскрипционной активации рецептора-2 фактора роста эндотелия сосудов (Flk-1). J Biol Chem 278: 7520–7530.
27. Апреликова О., Вуд М., Тэкетт С., Чандрамули Г. В., Барретт Дж. К. (2006) Роль факторов транскрипции ETS в отборе гена-мишени для индуцируемого гипоксией фактора-2. Cancer Res 66: 5641–5647.
28. Мацумото К., Арао Т., Танака К., Канеда Х., Кудо К. и др. (2009) сигнал mTOR и индуцируемый гипоксией фактор-1 альфа регулируют экспрессию CD133 в раковых клетках. Cancer Res 69: 7160–7164.
29. Харрис А.Л. (2002) Гипоксия — ключевой фактор регуляции роста опухоли. Nat Rev Cancer 2: 38–47.
30. Mylonis I, Chachami G, Samiotaki M, Panayotou G, Paraskeva E, et al. (2006) Идентификация сайтов фосфорилирования MAPK и их роль в локализации и активности индуцируемого гипоксией фактора-1альфа.J Biol Chem 281: 33095–33106.
31. Карапецас А., Гианнакакис А., Павлаки М., Панайотидис М., Сандальцопулос Р. и др. (2011) Биохимический и молекулярный анализ взаимодействия между киназой ERK2 MAP и фактором, индуцируемым гипоксией-1α. Int J Biochem Cell Biol 43: 1582–1590.
32. Хашимото О, Симидзу К., Семба С., Чиба С., Ку Й и др. (2011) Гипоксия вызывает агрессивность опухоли и рост CD133-положительных клеток зависимым от гипоксии фактором-1α в клетках рака поджелудочной железы.Патобиология 78: 181–192.
33. Sun C, Song H, Zhang H, Hou C, Zhai T и др .. (2012) Экспрессия CD133 при почечно-клеточной карциноме (ПКР) коррелирует с фактором, индуцирующим ядерную гипоксию 1α (HIF-1α). J Cancer Res Clin Oncol.
34. Schwab LP, Peacock DL, Majumdar D, Ingels JF, Jensen LC и др. (2012) Индуцируемый гипоксией фактор 1α способствует росту первичной опухоли и опухолевой активности клеток при раке молочной железы. Рак молочной железы Res 14: R6.

Оперативное лечение атрезии хоан: 15-летний опыт | Врожденные пороки | JAMA Отоларингология — хирургия головы и шеи

Цель Проанализировать факторы, влияющие на 15-летние хирургические результаты восстановления атрезии хоан.

Дизайн Корпус серии.

Учреждение Детский стационар третичного уровня.

Пациенты В период с 17 апреля 1996 г. по 23 марта 2010 г. в общей сложности 42 пациента в возрасте от 3 дней до 15 лет подверглись эндоскопическому или транспалатальному восстановлению атрезии хоан на нашем факультете детской отоларингологии.

Основные показатели результатов Частота повторных операций и рестеноза с учетом эффектов терапии митомицином С, стентирования и послеоперационной дилатации.

Результаты Трое из 42 пациентов были исключены из-за неадекватных данных последующего наблюдения; средний срок наблюдения за остальными 39 пациентами составил 6,3 года (диапазон 1–14,9 года). За исключением 6 пациентов, чье первоначальное восстановление было выполнено другими врачами, 31 из 33 пациентов, которым мы выполнили первоначальное восстановление, прошли в общей сложности 43 эндоскопических хирургических вмешательства (у 19 пациентов были односторонние процедуры, а у 12 пациентов — двусторонние процедуры), а еще 2 пациента перенесли двусторонняя чреспищеводная пластика.Из 43 сторон, которые мы прооперировали эндоскопически, на 9 сторонах (21%) потребовалась ревизионная операция, включая иссечение рубцовой ткани или дополнительное сверление стойкого костного стеноза. Не наблюдалось значительных различий в частоте рестеноза среди пациентов, подвергшихся эндоскопическому лечению митомицином С (22 из 43 операционных сторон, P = 0,13), стентированием (36 из 43 операционных сторон, P = 0,99) или с последующим расширением ( P = 0,45). Когда мы использовали стенты, они обычно (у 28 из 36 пациентов) оставались на месте на 15 дней или дольше.

Заключение Наша частота ревизий после первоначального эндоскопического восстановления атрезии хоан была низкой и не зависела от адъювантной терапии митомицином С или стентирования.

Атрезия хоан (АА) — это необычный порок развития верхних дыхательных путей, который может привести к значительной обструкции дыхательных путей у новорожденных. Каждый год от 1 из 7000 до 1 из 8000 детей рождается с CA. ¹ Quiz Ref ID У большинства детей атрезия односторонняя (в соотношении 2: 1), и у половины всех детей с ХА есть связанные аномалии, наиболее частым из которых является синдром ЗАРЯДА.¹

Аномалия развития при СА, по-видимому, заключается в сохранении нособуккальной мембраны (по Hochstetter), которая обычно рассасывается примерно на шестой неделе беременности. Другие вовлеченные механизмы включают сохранение щечно-глоточной мембраны передней кишки, неполную резорбцию мезодермы носоглотки или аномальную миграцию клеток нервного гребня. ¹ Анатомически СА проявляется как медиализация латеральной крыловидной пластинки (создающая латеральный аспект обструкции), увеличенный сошник (медиальный аспект обструкции) и непроходимость носоглоточных дыхательных путей на пораженной стороне с полной обструкцией. в двусторонних случаях.Обструкция чаще всего бывает чисто костной, но может быть перепончатой или сочетанием того и другого. Начальные проявления варьируются от опасной для жизни обструкции дыхательных путей до назойливой обструкции носовых дыхательных путей или ринореи, что более типично для одностороннего состояния. ²

Quiz Ref ID Двусторонняя СА с полной непроходимостью обычно диагностируется при рождении; Обычно он проявляется в виде циклического цианоза, который улучшается при плаче. Неспособность провести отсасывающий катетер через носовые ходы требует более тщательной оценки анатомии носоглотки, как правило, с помощью волоконно-оптической эндоскопии, возможно, с последующей компьютерной томографией.До тех пор, пока СА не будет восстановлена, соска Макговерна может использоваться для поддержания проходимости дыхательных путей младенца и обеспечения возможности кормления. Когда CA односторонний, хирургическое вмешательство часто может быть отложено до тех пор, пока носовые ходы не станут больше, что потенциально улучшает перспективы успешного лечения.

После первоначального описания CA Roederer в 1755 году многие авторы сообщили о различных методах восстановления и адъювантной терапии. ³ Однако несколько исследований ³ ^-8 в англоязычной литературе представляют результаты для более чем 30 пациентов.Кроме того, существуют разногласия о преимуществах стентирования, использовании адъювантной терапии митомицином С и времени восстановления при одностороннем СА. Чтобы ответить на эти вопросы, мы изучили результаты восстановления СА (необходимость повторной хирургии) в нашей педиатрической клинической больнице за последние 15 лет, включая сравнение результатов у пациентов, которым были установлены стенты, и у пациентов, получавших адъювантную терапию митомицином C.

Пациенты и вмешательства

Одобрение на это исследование было получено от Университета Алабамы в Бирмингемском институционном наблюдательном совете для людей.Для этого исследования мы провели ретроспективный обзор медицинских карт, чтобы определить всех пациентов, оперированных по поводу CA на факультете Pediatric ENT Associates и Детской больнице Алабамы в период с 17 апреля 1996 г. по 23 марта 2010 г. Из 42 идентифицированных пациентов. все они прошли полный сбор анамнеза и физическое обследование, чтобы определить, присутствуют ли связанные врожденные аномалии, и у многих пациентов было проведено формальное генетическое тестирование. Все 42 были прооперированы детскими отоларингологами, прошедшими стажировку (W.P.S., J.S.H., A.L.W. и B.J.W.) с использованием трансназальных эндоскопических или транспалатальных методов.

Медицинские карты были проанализированы на предмет возраста на момент постановки диагноза КА, возраста на момент операции, типа атрезии (костная или смешанная, включая мембранозную), наличия синдромов аномалий, техники первичного восстановления (эндоскопического или транспалатального) и использования интраоперационная терапия митомицином C, а также время последующего наблюдения и было ли CA односторонним или двусторонним, был ли стент установлен по завершении начальной операции и время до удаления стента, проводились ли последующие дилатации и проводилась ли ревизионная операция. обязательный.Ревизионная операция считалась любым хирургическим вмешательством, кроме серийной дилатации или удаления стента или грануляционной ткани.

На основании обзора медицинских карт 3 из 42 пациентов были исключены из-за неадекватных данных для анализа или недостаточного времени послеоперационного наблюдения. Шесть из оставшихся 39 пациентов были первоначально прооперированы по поводу КА другими врачами и были исключены из расчетов частоты рестенозов и повторных операций.

Статистический анализ выполняли с использованием доступного программного обеспечения (GraphPad; GraphPad Software, Inc).Был использован точный критерий Фишера, при этом значение P ≤ 0,05 было принято как статистически значимое.

Эндоскопическая оперативная техника

После проведения общей анестезии и установки эндотрахеальной трубки пациента подвешивают с помощью кляп для рта Дингмана. Телескоп (стержневая линза 120 °; Karl Storz) с ретрактором неба используется для получения прямой эндоскопической визуализации задней хоаны.Затем атретическая хоана прокалывается уретральным звуком Ван-Бюрена (обычно катетером 10F) под прямой визуализацией. Даже в случае чисто костной атрезии пункция хоан обычно может быть успешно выполнена с использованием звука. В случаях, когда костная атрезия не может быть проколота таким образом, можно использовать дрель для микродебридера. После создания отверстия в пластине атрезии для расширения отверстия используются все более крупные звуки уретры до тех пор, пока оно не станет достаточным для прохождения эндоскопа в носоглотку.

Далее выполняется ключевой этап — удаление заднего гипертрофированного сошника. Обычно это достигается с помощью эндоскопических пинцетов, хотя иногда для завершения этой части операции требуется микродебридер. Затем с помощью микродебридера удаляют заднебоковую стенку клиновидно-небной кости.

После того, как в атретической хоане будет сделано соответствующее отверстие, хирург может принять решение установить носовой стент, особенно если стеноз тяжелый.Для стентирования обычно используется эндотрахеальная трубка без манжеты диаметром 3,5 мм. Трубка модифицируется путем сгибания ее пополам в продольном направлении и разрезания на половину диаметра, что позволяет трубке сохранять этот изгиб. Затем трубку помещают по окружности вокруг участка восстановления задней хоаны с разрезанной частью, обращенной назад. Концы трубки будут немного выступать из правого и левого ноздрей. Полипропиленовый шов 0 пропускается через стент с обеих сторон, огибая заднюю хоану, и затем перевязывается спереди.Стент сконструирован таким образом, чтобы передняя часть находилась непосредственно за носовыми крыльями интраназально, чтобы предотвратить колумеллярный некроз. Родители или опекуны проинструктированы перемещать стент вперед и назад, по крайней мере, ежедневно, чтобы предотвратить образование синехий, а также орошать и отсасывать трубку, по крайней мере, 3 раза в день. После установки стента мы обычно удаляем его в операционной. Сроки во многом основаны на впечатлении лечащего хирурга при первоначальном ремонте, хотя большинство из них удаляются в течение 14–21 дня.Когда используется терапия митомицином С, ее чаще всего применяют во время удаления стента.

Техника челюстно-лицевой хирургии

Показания к транспланатальной пластике включали исключительно толстую костную атрезию или стеноз носовых крыльев, которые не позволяли использовать трансназальные эндоскопические инструменты. Для транспланатальной пластики в небо вводят местный анестетик.Разрез делают, начиная с бугристости верхней челюсти, и проводят по небно-альвеолярному гребню до носо-небных отверстий. Лоскуты поднимаются в подслизисто-надкостничной плоскости до границы твердого неба, избегая сосудисто-нервного пучка. Затем делается высвобождающий разрез на стыке твердого и мягкого неба. Мягкое небо отведено кзади. Затем с помощью фрезы или губок удаляют часть заднего твердого неба. Кость также удаляется сбоку, если необходимо, чтобы получить отверстие, через которое может легко пройти катетер 14F (или больше) уретральный расширитель звука.

После достижения достаточного отверстия в хоане слизистая оболочка неба ушивается рассасывающимся швом. Наконец, по выбору хирурга, U-образный стент, сделанный из интубационной трубки (как уже описано), закрепляется в каждой прооперированной хоане.

В течение последних 15 лет наша специализированная больничная группа, состоящая из педиатрических отоларингологов, обследовала и хирургически вылечила врожденную ХА у 42 пациентов в возрасте от 3 дней до 15 лет на момент операции.Из 39 пациентов у 23 (59%) была односторонняя атрезия, с поражением правой стороны у 14 (61%) (таблица). У 12 из 39 пациентов (31%) КА была частью синдрома, чаще всего синдрома ЗАРЯДА. Шесть из 39 пациентов (15%) с полной (костной) двусторонней ХА были в возрасте от 3 дней до 11 месяцев (в среднем 102 дня) на момент первичной операции; 1 пациенту с двусторонней частичной мембранозной атрезией было 15 лет на момент первичной операции.

Из 33 пациентов, перенесших первичную операцию в нашем учреждении, первичная процедура была выполнена эндоскопически у 31 пациента и транспалатально у 2 пациентов.Атрезия хоан была костной (у 6 пациентов) или перепончатой (у 3 пациентов) в нескольких случаях и была смешанной у 30 из 39 пациентов, наблюдавшихся в течение 1 года или дольше. Многие авторы относят СА только к костным или смешанным. Используя эти категории, среди 39 пациентов, наблюдаемых в течение 1 года и более, у 6 (15%) была атрезия кости, а у 33 (85%) — атрезия смешанного типа. Среднее время наблюдения после операции составило 6,3 года (диапазон от 1 до 14,9 года) (таблица).

В целом, 21% (9 из 43) восстановленных хоан, подвергшихся эндоскопической пластике, потребовалась ревизионная операция.Среднее время от первоначального ремонта до ревизии составило 1,3 года (от 35 дней до> 9 лет). Тридцать три процента (1 из 3) пациентов с чисто костной атрезией нуждались в повторной операции по сравнению с 20% (8 из 40) пациентов со смешанной или мембранозной атрезией ( P = 0,51). Четыре из 10 хоан (40%), связанных с синдромным заболеванием, потребовали повторной хирургической операции, по сравнению с 5 из 33 хоан (15%), связанных с изолированной ХА ( P = 0,17). Восемь из 19 пациентов (42%) с односторонним заболеванием перенесли повторную операцию по сравнению с 2 из 24 пациентов (8%) с двусторонней атрезией.На последнем контрольном визите полный рестеноз отсутствовал у всех этих пациентов. У двух пациентов было обнаружено частичное сужение при носовой эндоскопии, но у обоих не было симптомов, и дальнейшее лечение не проводилось.

Терапия митомицином С использовалась в качестве дополнения к хирургическому вмешательству примерно в половине атретических хоан, подвергшихся эндоскопическому лечению (22 из 43 операционных сторон [51%] у 31 пациента). Не наблюдалось существенной разницы в частоте повторных операций среди тех, кто лечился (7 из 22 [32%]) и не лечился (2 из 21 [10%]) митомицином C ( P =.13) (рисунок).

интраназальных стента были использованы у 36 из 43 хоан (84%), оперированных эндоскопически. Когда мы использовали стенты, они обычно (у 28 из 36 пациентов) оставались на месте на 15 дней или дольше. Использование стентов существенно не повлияло на частоту ревизий ( P > 0,99) (рисунок). Аналогичным образом, частота ревизий среди 36 случаев врожденной СА (у 31 ребенка) существенно не различалась, независимо от того, составлял ли время между установкой и удалением стента от 1 до 14 дней (3 из 8 [38%]), от 15 до 28 дней (1 14 [7%]) или более 28 дней (4 из 14 [29%]) ( P =.19).

Послеоперационная дилатация выполнена на 25 из 43 оперированных сторон (58%). Четыре из 25 сторон (16%), леченных дилатацией, в конечном итоге потребовали повторной операции по сравнению с 5 из 18 сторон (28%) пациентов, не леченных дилатацией ( P = 0,45).

Пациенты с односторонним СА наблюдались за медицинской помощью в возрасте от рождения до 10 лет, средний возраст на момент постановки диагноза составлял 33 месяца (таблица).Возраст для первичного хирургического вмешательства составлял от 3 недель до 10 лет. Среди 19 детей, перенесших ревизионную операцию после эндоскопической пластики односторонней КА, потребность не была существенно связана с возрастом на момент первичной операции по поводу односторонней КА для детей младше 6 месяцев (2 из 5 [40%]), возраст от 7 до 24 лет. месяцев (2 из 7 [29%]) или старше 24 месяцев (3 из 7 [43%]) ( P = 0,33).

Анализ наших отдаленных (в среднем, 6,3 года) результатов первичного эндоскопического восстановления ХА у 31 пациента (43 оперированных стороны) показал, что ревизионная операция потребовалась в конечном итоге в 21% (9 из 43) случаев.Не наблюдалось значительных различий в частоте ревизий, независимо от того, использовалась ли терапия митомицином С или был установлен стент, или был ли пациент моложе 6 месяцев, от 6 до 24 месяцев или старше 24 месяцев на момент первоначального ремонта.

Некоторые большие различия между группами не были статистически значимыми. Однако мы обнаружили, что тенденции в наших данных в целом совпадают с тенденциями в литературе.

Одна из отмеченных нами тенденций заключалась в том, что пациенты с атрезией костей (1 из 3 [33%]) с большей вероятностью нуждались в повторной хирургии, чем пациенты со смешанным или перепончатым заболеванием (8 из 40 [20%]).Другие авторы сообщают, что лечение атрезии костей является более сложной задачей, чем лечение атрезии с помощью мембранного компонента, ³ ^{, 7}, возможно, из-за неоостеогенеза, как описано Ayari et al. ⁹

Мы также обнаружили, что пациенты с синдром-ассоциированной атрезией с большей вероятностью нуждались в повторной хирургии, чем пациенты с изолированным заболеванием (4 из 10 хоан [40%] против 5 из 33 хоан [15%], P = 0,17). Исследования ⁵ ^{, 10} ^-12 также выявили более высокую частоту рестеноза у пациентов с синдромальным СА, хотя 2 недавних исследования ³ ^{, 7} не обнаружили значительных различий в двух группах.

Многие хирурги считают, что терапия митомицином С предотвращает повторный рост тканей и продлевает проходимость восстановления ХА. Хотя некоторые авторы все еще продвигают его использование для предотвращения рестеноза, ⁶ ^{, 13} другие обнаружили, что он не улучшает исходы. ³ ^{, 14} Хотя разница здесь не была значительной ( P = 0,13), мы отметили более высокую долю ревизий в случаях, леченных этим агентом (7 из 22 обработанных сторон против 2 из 21 необработанной стороны) ( Фигура).Терапия митомицином С не применялась рутинно и часто применялась в более сложных случаях, что могло объяснить повышенную частоту рестеноза у пациентов, получавших этот препарат.

стента были установлены в конце процедуры у 36 из 43 хоан (84%), прооперированных нами эндоскопически. Причина установки стента заключается в том, что он предотвратит сужение новообразованного просвета по мере его заживления. Однако противники стентов утверждают, что они повреждают слизистую оболочку носа, что приводит к грануляционной ткани, образованию рубцов, бактериальному разрастанию и нарушению оттока слизи, и все это работает против конечной цели обеспечения проходимости.⁴ ^{, 10} ^{, 15} В нескольких публикациях ⁴ ^{, 6} ^{, 10} ^{, 16} ^{, 17} и в Кокрановском обзоре ¹⁸ сообщается об отсутствии разницы в показателях проходимости пациентов, получающих или не ставить стентирование после операции; наши результаты согласуются с этими авторами (рисунок). Публикации ретроспективно собранных данных, показывающих отсутствие разницы в частоте ревизий при стентировании, продолжают появляться; однако для окончательного решения вопроса необходимы дополнительные проспективные исследования.

Quiz Ref ID Несмотря на то, что мы не обнаружили разницы в частоте ревизий, когда стенты использовались или не использовались, мы подозреваем, что это может быть связано с систематической ошибкой выбора, поскольку решение о установке стента порой принималось в зависимости от большей тяжести заболевания. Из-за этого мы не делаем вывод о том, что стенты должны использоваться повсеместно или от них следует отказаться, но полагаем, что решение о установке стента лучше всего оставить на усмотрение лечащего хирурга во время ремонта.

Что касается продолжительности стентирования, некоторые авторы сообщают, что короткий период стентирования (всего 5-7 дней) сводит к минимуму негативное влияние стента на процесс заживления, в то же время улучшая показатели проходимости.⁷ ^{, 19} Однако другие исследователи предположили, что длительное стентирование (до 12 недель) необходимо. ⁵ В нашем исследовании мы обнаружили тенденцию к более низкой частоте ревизий, когда стенты оставались на месте от 15 до 28 дней (7% [1 из 14] ревизий) по сравнению с 1 до 14 дней (38% [3 из 8]) частота пересмотра), хотя разница была незначительной ( P = 0,19).

Обсуждается оптимальный возраст для проведения пластики одностороннего КА.⁶ ^{, 20} ^{, 21} В нашей серии частота ревизий была несколько ниже среди пациентов, прооперированных в возрасте от 6 до 24 месяцев (2 из 7), по сравнению с пациентами младше 6 месяцев (2 из 5) и старше. более 24 месяцев (3 из 7), хотя разница не была значимой. Другие авторы обычно откладывают операцию на пациентах с односторонним СА, у которых нет серьезных проблем с дыхательными путями или кормлением, пока ребенку не исполнится около 12 месяцев. ⁸ ^{, 22} Обоснование отсрочки восстановления как можно дольше заключается в том, что хирургически созданное отверстие не увеличивается по мере роста окружающих тканей, так что отверстие сужается по мере взросления ребенка.

Слабые стороны нашего исследования во многом обусловлены его ретроспективным характером. Поскольку хирургические процедуры выполняли 4 разных хирурга (W.P.S., J.S.H., A.L.W. и B.J.W.), мы не смогли полностью контролировать различия в методах. Все 4 хирурга используют одни и те же инструменты и обычно выполняют одни и те же действия при ремонте. Поскольку мы не выявили искаженного количества ревизий на основании посещения хирурга, маловероятно, что какие-либо небольшие различия в восстановлении привели к значительным различиям в результатах.Все 4 хирурга запланировали повторный осмотр в операционной для удаления стента при их использовании. Как упоминалось ранее, время удаления стента во многом основывалось на впечатлении лечащего хирурга при первоначальном ремонте, хотя большинство стентов удаляются в течение 14–21 дней. Ретроспективный характер нашего исследования также означал, что другие маркеры успеха обычно не регистрировались (например, диаметр хоан или степень стеноза).

Quiz Ref ID Наша общая частота ревизий после первичной эндоскопической операции в этом исследовании составила 21% (9 из 43) по сравнению с частотой, описанной в литературе, от 12% до 54.7%. ⁴ ^{, 6} ^{, 8} ^{, 17} Наша оценка несколько выше, чем у некоторых других авторов. Мы полагаем, что эта разница объясняется тремя факторами. Во-первых, мы определили ревизионную хирургию более широко, чем другие, как включающую любые поездки в операционную для вмешательства, отличного от удаления стента (с ассоциированной мягкой грануляционной тканью) или только дилатации. Во-вторых, мы представили данные о длительных периодах наблюдения (до 14,9 лет) с несколькими пациентами, которым потребовалась повторная операция через несколько лет после первоначального ремонта.В-третьих, мы, возможно, были более склонны, чем другие, рекомендовать ревизионную операцию для облегчения симптомов и достижения нормальных отверстий, о чем свидетельствует тот факт, что почти все наши пациенты не страдали от болезни во время последнего документированного посещения клиники. Конечно, в литературе существуют различные определения успешной хирургии, при этом некоторые авторы используют необходимость любого дальнейшего оперативного вмешательства, а другие используют возможную проходимость, а не необходимость повторной операции. Невозможно узнать, скольким пациентам, у которых мы (и другие авторы) выполняли дальнейшую обработку раны при повторных процедурах удаления стента, в конечном итоге потребовалось бы какое-либо дополнительное вмешательство для устранения симптомов заболевания.

В заключение, трансназальная эндоскопическая пластика эффективна при двустороннем и одностороннем КА. Отсрочка восстановления одностороннего CA до достижения ребенком возраста 6 месяцев может снизить риск того, что потребуется ревизионная операция по мере или после того, как ребенок созреет. Частота наших пересмотров была схожей с использованием или без использования терапии или стентирования митомицином С, хотя эти дополнительные методы лечения чаще применялись у пациентов с атрезией большей степени тяжести.

Для корреспонденции: Брайан Дж.Виатрак, доктор медицины, педиатрические партнеры по ЛОР и детская больница Алабамы, 1600 Seventh Ave S, Бирмингем, AL 35233 ([email protected]).

Представлено для публикации : 20 июля 2012 г .; окончательная доработка получена 21 сентября 2012 г .; принята 9 октября 2012 г.

Вклад авторов: Доктора Ньюман, Хармон, Вулли и Виатрак имели полный доступ ко всем данным в исследовании и несли ответственность за целостность данных и точность анализа данных. Концепция и дизайн исследования : Ньюман, Хармон и Виатрак. Сбор данных : Ньюман, Хармон, Ширли, Хилл, Вулли и Виатрак. Анализ и интерпретация данных : Ньюман, Хармон и Виатрак. Составление рукописи : Ньюман и Виатрак. Критический пересмотр рукописи для важного интеллектуального содержания : Ньюман, Хармон, Ширли, Хилл, Вулли и Виатрак. Статистический анализ : Ньюман и Хармон. Административная, техническая и материальная поддержка : Wiatrak. Наблюдение за исследованием : Хармон, Ширли, Хилл, Вулли и Виатрак.

Раскрытие информации о конфликте интересов: Не сообщалось.

Предыдущая презентация: Это исследование было представлено на встрече Американского общества детской оториноларингологии в 2012 году; 21 апреля 2012 г .; Сан-Диего, Калифорния.

1. Менасс-Палмер Л., Богданов А., Марион Р. В. Атрезия хоан. Педиатр Ред. . 1995; 16 (12): 475-4768559708PubMedGoogle Scholar2.Wiatrak BJ. Односторонняя атрезия хоан: первичное проявление и эндоскопическое восстановление. Int J Педиатр Оториноларингол . 1998; 46 (1-2): 27-35101

PubMedGoogle ScholarCrossref 3.Teissier N, Kaguelidou F, Couloigner V, François M, Van Den Abbeele T. Факторы, позволяющие прогнозировать успех после трансназального эндоскопического лечения атрезии хоан.

Arch Otolaryngol Head Neck Surg . 2008; 134 (1): 57-6118209138PubMedGoogle ScholarCrossref 4. Ван Ден Аббеле Т., Франсуа М., Нарси П. Трансназальное эндоскопическое лечение атрезии хоан без длительного стентирования. Arch Otolaryngol Head Neck Surg . 2002; 128 (8): 936-94012162774PubMedGoogle Scholar 5. Фридман Н.Р., Митчелл Р.Б., Бейли С.М., Альберт Д.М., Лейтон С.Е. Тактика и исход коррекции атрезии хоан. Int J Педиатр Оториноларингол . 2000; 52 (1): 45-5110699239PubMedGoogle ScholarCrossref 6.Gosepath J, Santamaria VE, Lippert BM, Mann WJ. 41 случай врожденной атрезии хоан в течение 26 лет — ретроспективный анализ результатов и методика. Ринология . 2007; 45 (2): 158-16317708465PubMedGoogle Scholar7.Romeh HE, Albirmawy OA. 13-летний опыт и предикторы успеха трансназальной эндоскопической пластики врожденной облитерации хоан. Int J Педиатр Оториноларингол . 2010; 74 (7): 737-74220381884PubMedGoogle ScholarCrossref 8.Hengerer AS, Brickman TM, Jeyakumar A. Хоанальная атрезия: эмбриологический анализ и эволюция лечения, 30-летний опыт. Ларингоскоп . 2008; 118 (5): 862-86618197129PubMedGoogle ScholarCrossref 9. Аяри С., Абедипур Д., Боссард Д., Фрёлих П.КТ-хирургия при атрезии хоан. Acta Otolaryngol . 2004; 124 (4): 502-50415224883PubMedGoogle ScholarCrossref 10. Elloy MD, Cochrane LA, Albert DM. Рефрактерная атрезия хоан: что делает ребенка восприимчивым? Великолепный опыт в больнице на Ормонд-стрит. J Otolaryngol Head Neck Surg . 2008; 37 (6): 813-8201

09PubMedGoogle Scholar 11. Coniglio JU, Manzione JV, Hengerer AS. Анатомические данные и лечение атрезии хоан и ассоциация CHARGE. Анн Отол Ринол Ларингол .1988; 97 (5 Pt 1): 448-4533178097PubMedGoogle Scholar12.Cedin AC, Fujita R, Cruz OL. Эндоскопическая трансептальная хирургия атрезии хоан с использованием техники без стента. Отоларингол Хирургия головы и шеи . 2006; 135 (5): 693-69817071296PubMedGoogle ScholarCrossref 13.Бозкурт М.К., Келес Б., Азимов А., Озтурк К., Арбаг Х. Использование дополнительного местного митомицина при эндоскопическом восстановлении врожденной атрезии хоан. Int J Педиатр Оториноларингол . 2010; 74 (7): 733-73620394996PubMedGoogle ScholarCrossref 14.Кубба Х, Беннетт А, Бейли СМ. Обновленная информация о хирургии атрезии хоан в детской больнице на Грейт-Ормонд-Стрит: предварительные результаты с митомицином С и лазером KTP. Int J Педиатр Оториноларингол . 2004; 68 (7): 939-94515183586PubMedGoogle ScholarCrossref 15.Schoem SR. Трансназальная эндоскопическая пластика атрезии хоан: зачем нужен стент? Отоларингол Хирургия головы и шеи . 2004; 131 (4): 362-36615467600 PubMedGoogle ScholarCrossref 16. Дурмаз А., Тосун Ф., Илдрм Н., Сахан М., Квракдал С., Герек М.Трансназальная эндоскопическая пластика атрезии хоан: результаты 13 случаев и метаанализ. J Craniofac Surg . 2008; 19 (5): 1270-127418812850PubMedGoogle ScholarCrossref 17. Узомефуна В., Глинн Ф., Аль-Омари Б., Хон С., Рассел Дж. Трансназальная эндоскопическая коррекция атрезии хоан в центре третичной медицинской помощи: обзор результатов. Int J Педиатр Оториноларингол . 2012; 76 (5): 613-61722418073PubMedGoogle ScholarCrossref 18. Cedin AC, Atallah AN, Andriolo RB, Cruz OL, Pignatari SN. Операция по поводу врожденной атрезии хоан. Кокрановская база данных Syst Rev . 2012; 2: CD00899322336856PubMedGoogle Scholar19.Pasquini E, Sciarretta V, Saggese D, Cantaroni C, Macrì G, Farneti G. Эндоскопическое лечение врожденной атрезии хоан. Int J Педиатр Оториноларингол . 2003; 67 (3): 271-27612633927PubMedGoogle ScholarCrossref 20. Карпентер Р.Дж., Нил Г.Б. III. Коррекция врожденной атрезии хоан у детей и взрослых. Ларингоскоп . 1977; 87 (8): 1304-1311881923PubMedGoogle ScholarCrossref 21. Ликтор Б., Чоконай Л.В., Герлингер И.Новый эндоскопический хирургический метод односторонней атрезии хоан. Ларингоскоп . 2001; 111 (2): 364-36611210891PubMedGoogle ScholarCrossref 22.

Hengerer AS, Oas RE. Врожденные аномалии носа: их эмбриология, диагностика и лечение. 2-е изд. Александрия, Вирджиния: Американская академия отоларингологии; 1987

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Prolonged Scar-in-a-Jar: инструмент для скрининга in vitro антифиброзной терапии с использованием биомаркеров синтеза внеклеточного матрикса | Респираторные исследования

Froidure A, Joannes A, Mailleux AA, Crestani B. Новые мишени при идиопатическом фиброзе легких: от воспаления и иммунитета до ремоделирования и восстановления. Мнение эксперта «Орфанные препараты». 2016; 4: 511–20.

Артикул CAS Google Scholar

Датта А., Скоттон CJ, Chambers RC. Новые терапевтические подходы к лечению фиброза легких. Br J Pharmacol. 2011; 163: 141–72.

PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar

Ричелди Л., Коллард Х. Р., Джонс МГ. Идиопатический фиброз легких. Ланцет. 2017; 389: 1941–52.

PubMed Статья Google Scholar

Винн TA. Интегрирующие механизмы легочного фиброза. J Exp Med. 2011; 208: 1339–50.

PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar

Caminati A, Madotto F, Cesana G, Conti S, Harari S.Эпидемиологические исследования идиопатического легочного фиброза: подводные камни в методологии и интерпретации данных. Eur Respir Rev.2015; 24: 436–44.

PubMed Статья Google Scholar

Хатчинсон Дж., Фогарти А., Хаббард Р., Маккивер Т. Глобальная заболеваемость и смертность от идиопатического легочного фиброза: систематический обзор. Eur Respir J. 2015; 46: 795–806.

PubMed Статья Google Scholar

Hopkins RB, Burke N, Fell C, Dion G, Kolb M. Эпидемиология и выживаемость идиопатического легочного фиброза по национальным данным в Канаде. Eur Respir J. 2016; 48: 187–95.

PubMed Статья Google Scholar

Maher TM, Evans IC, Bottoms SE, Mercer PF, Thorley AJ, Nicholson AG, Laurent GJ, Tetley TD, Chambers RC, McAnulty RJ. Снижение уровня простагландина E2 способствует парадоксу апоптоза при идиопатическом фиброзе легких.Am J Respir Crit Care Med. 2010. 182: 73–82.

PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar

Chapman HA. Эпителиально-мезенхимальные взаимодействия при фиброзе легких. Annu Rev Physiol. 2011; 73: 413–35.

PubMed Статья CAS Google Scholar

10.

Смита Б., Донохью М. Клиническая и гистопатологическая оценка ориентации коллагеновых волокон у пациентов с подслизистым фиброзом полости рта.J Oral Maxillofac Pathol. 2011; 15: 154–60.

PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

11.

Леминг Д.Дж., Санд Дж.М., Нильсен М.Дж., Дженовезе Ф., Мартинес Ф.Дж., Хогабоам С.М., Хан М.К., Кликкштейн Л.Б., Карсдал М.А. Серологическое исследование профиля деградации коллагена у пациентов с хронической обструктивной болезнью легких или идиопатическим фиброзом легких. Биомарк Insights. 2012; 7: 119–26.

PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

12.

Karsdal MAA, Nielsen SH, Leeming DJJ, Langholm LLL, Nielsen MJJ, Manon-Jensen T, Siebuhr A, Gudmann NSS, Rønnow S, Sand JMM, Daniels SJJ, Mortensen JHH, Schuppan D. Хорошие и плохие коллагены фиброза — их роль в передаче сигналов и функциях органов. Adv Drug Deliv Rev. 2017; 121: 43–56.

PubMed Статья CAS Google Scholar

13.

Jenkins RG, Simpson JK, Saini G, Bentley JH, Russell AM, Braybrooke R, Molyneaux PL, McKeever TM, Wells AU, Flynn A, Hubbard RB, Leeming DJ, Marshall RP, Karsdal MA, Lukey PT , Maher TM.Продольное изменение биомаркеров деградации коллагена при идиопатическом фиброзе легких: анализ проспективного многоцентрового исследования PROFILE. Ланцет Респир Мед. 2015; 3: 462–72.

PubMed Статья CAS Google Scholar

14.

Inchingolo R, Varone F, Sgalla G, Richeldi L. Существующие и новые биомаркеры прогрессирования заболевания при идиопатическом фиброзе легких. Эксперт Rev Respir Med. 2019; 13: 39–51.

PubMed Статья CAS Google Scholar

15.

Drakopanagiotakis F, Wujak L, Wygrecka M, Markart P. Биомаркеры идиопатического легочного фиброза. Matrix Biol. 2018; 68–69: 404–21.

PubMed Статья CAS Google Scholar

16.

Мартинес Ф.Дж., Коллард Х.Р., Пардо А., Рагху Дж., Ришельди Л., Селман М., Свигрис Дж. Дж., Танигучи Х., Уэллс АУ. Идиопатический фиброз легких. Nat Rev Dis Prim. 2017; 3: 17074.

PubMed Статья Google Scholar

17.

Richeldi L, Cottin V, du Bois RM, Selman M, Kimura T., Bailes Z, Schlenker-Herceg R, Stowasser S, Brown KK. Нинтеданиб у пациентов с идиопатическим фиброзом легких: объединенные данные исследований TOMORROW и INPULSIS (®). Respir Med. 2016; 113: 74–9.

PubMed Статья Google Scholar

18.

Noble PW, Albera C, Bradford WZ, Costabel U, du Bois RM, Fagan EA, Fishman RS, Glaspole I, Glassberg MK, Lancaster L, Lederer DJ, Leff JA, Nathan SD, Pereira CA, Swigris JJ, Valeyre D, King TE.Пирфенидон при идиопатическом фиброзе легких: анализ объединенных данных трех международных исследований фазы 3. Eur Respir J. 2016; 47: 243–53.

PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar

19.

Сомоги В., Чаудхури Н., Торриси С.Е., Кан Н., Мюллер В., Кройтер М. Терапия идиопатического фиброза легких: что дальше? Eur Respir Rev.2019; 28.

20.

Bahudhanapati H, Kass DJ. Разматывание коллагеновых фибрилл: выяснение механизма действия пирфенидона и нинтеданиба при фиброзе легких.Am J Respir Cell Mol Biol. 2017; 57: 10–1.

PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar

21.

Йейтс DH. Лечение mTOR при лимфангиолейомиоматозе: роль эверолимуса. Эксперт Rev Respir Med. 2016; 10: 249–60.

PubMed Статья CAS Google Scholar

22.

Тавейра-ДаСильва AM, Мосс Дж. Клинические особенности, эпидемиология и терапия лимфангиолейомиоматоза.Clin Epidemiol. 2015; 7: 249–57.

PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

23.

Gao Y, Xu X, Ding K, Liang Y, Jiang D, Dai H. Рапамицин ингибирует индуцированный трансформирующим фактором роста β1 фиброгенез в первичных фибробластах легких человека. Йонсей Мед Дж. 2013; 54: 437–44.

PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar

24.

Mercer PF, Woodcock HV, Eley JD, Platé M, Sulikowski MG, Durrenberger PF, Franklin L, Nanthakumar CB, Man Y, Genovese F, McAnulty RJ, Yang S, Maher TM, Nicholson AG, Blanchard AD , Маршалл Р.П., Люки П.Т., Чемберс Р.Исследование мощного ингибитора киназы PI3 / mTOR в качестве нового антифиброзного агента при IPF. Грудная клетка. 2016; 71: 701–11.

PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

25.

Люки П.Т., Харрисон С.А., Ян С., Мэн И., Холман Б.Ф., Рашиднасаб А., Аззопарди Г., Грейер М., Симпсон Дж. К., Барейл П., Пол Л., Вудкок Х.В., Тошнер Р., Сондерс П., Молино П.Л. , Thielemans K, Wilson FJ, Mercer PF, Chambers RC, Groves AM, Fahy WA, Marshall RP, Maher TM.Рандомизированное плацебо-контролируемое исследование омипалисиба (PI3K / mTOR) при идиопатическом фиброзе легких. Eur Respir J. 2019; 53: 1801992.

PubMed Статья CAS Google Scholar

26.

Nanthakumar CB, Eley J, Man Y, Gudmann NS, Chambers RC, Blanchard A, Fahy W., Maher TM. Омипаласиб модулирует обмен внеклеточного матрикса у пациентов с ИЛФ: исследовательский анализ биомаркеров из фазы I исследования механизма подтверждения. Am J Respir Crit Care Med.2019; 199: A7301. https://www.atsjournals.org/doi/abs/10.1164/ajrccm-conference.2019.199.1_MeetingAbstracts.A7301.

27.

Woodcock HV, Eley JD, Guillotin D, Platé M, Nanthakumar CB, Martufi M, Peace S, Joberty G, Poeckel D, Good RB, Taylor AR, Zinn N, Redding M, Forty EJ, Hynds RE , Swanton C, Karsdal M, Maher TM, Bergamini G, Marshall RP, Blanchard AD, Mercer PF, Chambers RC. Ось mTORC1 / 4E-BP1 представляет собой критический сигнальный узел во время фиброгенеза. Nat Commun. 2019; 10: 6.

PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar

28.

Сундаракришнан А, Чен Й, Блэк Л.Д., Олдридж Б.Б., Каплан Д.Л. Разработаны модели клеток и тканей легочного фиброза. Adv Drug Deliv Rev.2018; 129: 78–94.

PubMed Статья CAS Google Scholar

29.

Чуа Ф, Голди Дж., Лоран Дж. Дж. Легочный фиброз: в поисках модельных ответов.Am J Respir Cell Mol Biol. 2005; 33: 9–13.

PubMed Статья CAS Google Scholar

30.

Эдмондсон Р., Бройли Дж. Дж., Адкок А.Ф., Ян Л. Трехмерные системы клеточных культур и их применение в открытии лекарств и клеточных биосенсорах. Assay Drug Dev Technol. 2014; 12: 207–18.

PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar

31.

Chen CZC, Peng YX, Wang ZB, Fish PV, Kaar JL, Koepsel RR, Russell AJ, Lareu RR, Raghunath M. Шрам в банке: изучение потенциальных антифибротических соединений от эпигенетического до внеклеточного уровня за один хорошо. Br J Pharmacol. 2009; 158: 1196–209.

PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar

32.

Hall D, Minton AP. Макромолекулярное скопление: качественные и полуколичественные успехи, количественные проблемы.Biochim Biophys Acta. 1649; 2003: 127–39.

Google Scholar

33.

Lareu RR, Arsianti I, Subramhanya HK, Yanxian P, Raghunath M. Усиление образования коллагенового матрикса и сшивания in vitro для применения в тканевой инженерии: предварительное исследование. Tissue Eng. 2007; 13: 385–91.

PubMed Статья CAS Google Scholar

34.

Good RB, Eley JD, Gower E, Butt G, Blanchard AD, Fisher AJ, Nanthakumar CB.Фенотипический анализ «рубец в баночке» с высоким содержанием для быстрой количественной оценки фибриллогенеза коллагена с использованием легочных фибробластов, полученных из болезни. BMC Biomed Eng. 2019; 1:14.

Артикул Google Scholar

35.

Organ LA, Duggan A-MR, Oballa E, Taggart SC, Simpson JK, Kang’ombe AR, Braybrooke R, Molyneaux PL, North B, Karkera Y, Leeming DJ, Karsdal MA, Nanthakumar CB, Fahy Вашингтон, Маршалл Р.П., Дженкинс Р.Г., Махер TM. Биомаркеры синтеза коллагена предсказывают прогрессирование в когорте идиопатического легочного фиброза PROFILE.Respir Res. 2019; 20: 148.

PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar

36.

Holm Nielsen S, Willumsen N, Leeming DJ, Daniels SJ, Brix S, Karsdal MA. Серологическая оценка активированных фибробластов с помощью альфа-гладкомышечного актина (α-SMA): неинвазивный биомаркер активированных фибробластов при заболеваниях легких. Перевод Онкол. 2019; 12: 368–74.

PubMed Статья Google Scholar

37.

Leeming DJ, Larsen DV, Zhang C, Hi Y, Veidal SS, Nielsen RH, Henriksen K, Zheng Q, Barkholt V, Riis BJ, Byrjalsen I., Qvist P, Karsdal MA. Иммуноферментный анализ сыворотки (ELISA) для N-концевого пропептида коллагена I типа (PINP) крысы и человека — оценка соответствующих эпитопов. Clin Biochem. 2010; 43: 1249–56.

PubMed Статья CAS Google Scholar

38.

Нильсен М.Дж., Недергаард А.Ф., Сан С., Вейдал С.С., Ларсен Л., Чжэн К., Суетта К., Хенриксен К., Кристиансен К., Карсдал М.А., Лиминг Д.ELISA PRO-C3, специфичный для неоэпитопов, измеряет истинное образование коллагена типа III, связанное с параметрами печени и мышц. Am J Transl Res. 2013; 5: 303–15.

PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

39.

Лиминг Д.Дж., Нильсен М.Дж., Дай Й., Вейдал С.С., Вассилиадис Э., Чжан С., Хе И, Вайнер Б., Чжэн К., Карсдал М.А. Иммуноферментный анализ сыворотки, специфичный для домена 7S коллагена типа IV (P4NP 7S): маркера, связанного с ремоделированием внеклеточного матрикса во время фиброгенеза печени.Hepatol Res. 2012; 42: 482–93.

PubMed Статья CAS Google Scholar

40.

Вассилиадис Э., Вейдал С.С., Симонсен Х., Ларсен Д.В., Вайнер Б., Чен Х, Чжэн К., Карсдал М.А., Лиминг Д. Иммунологическое обнаружение пропептидного фрагмента коллагена V типа, PVCP-1230, при ремоделировании соединительной ткани, связанном с фиброзом печени. Биомаркеры. 2011; 16: 426–33.

PubMed Статья CAS Google Scholar

41.

Leeming DJ, Veidal SS, Karsdal MA, Nielsen MJ, Trebicka J, Busk T., Bendtsen F, Krag A, Møller S. Pro-C5, маркер истинного образования коллагена V типа и фибрилляции, коррелирует с портальной гипертензией у пациентов с алкогольный цирроз печени. Сканд Дж Гастроэнтерол. 2015; 50: 584–92.

PubMed Статья Google Scholar

42.

Сан С., Хенриксен К., Карсдал М.А., Бирьялсен И., Риттвегер Дж., Армбрехт Г., Белави Д.Л., Фельзенберг Д., Недергаард А.Ф.Оборот коллагена III и VI типа в ответ на длительную иммобилизацию. PLoS One. 2015; 10: e0144525.

PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar

43.

Bager CL, Gudmann N, Willumsen N, Leeming DJ, Karsdal MA, Bay-Jensen AC, Høgdall E, Balslev I, He Y. Количественная оценка фибронектина как метод оценки ремоделирования внеклеточного матрикса ex vivo. Biochem Biophys Res Commun. 2016; 478: 586–91.

PubMed Статья CAS Google Scholar

44.

Walker EJ, Heydet D, Veldre T, Ghildyal R. Транскриптомные изменения во время TGF-β-опосредованной дифференцировки фибробластов дыхательных путей в миофибробласты. Научный доклад 2019; 9: 20377.

PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar

45.

McAnulty RJ, Campa JS, Cambrey AD, Laurent GJ. Влияние трансформирующего фактора роста бета на скорость синтеза и разложения проколлагена in vitro. Biochim Biophys Acta. 1991; 1091: 231–5.

PubMed Статья CAS Google Scholar

46.

Roach KM, Feghali-Bostwick CA, Amrani Y, Bradding P. Липоксин A4 ослабляет конститутивную и TGF-β1-зависимую профибротическую активность в миофибробластах легких человека. J Immunol. 2015; 195: 2852–60.

PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar

47.

Туан Т.Л., Сонг А, Чанг С., Юнаи С., Нимни МЭ.Фиброплазия in vitro: сокращение матрикса, рост клеток и выработка коллагена фибробластами, культивируемыми в фибриновых гелях. Exp Cell Res. 1996. 223: 127–34.

PubMed Статья CAS Google Scholar

48.

Knüppel L, Ishikawa Y, Aichler M, Heinzelmann K, Hatz R, Behr J, Walch A, Bächinger HP, Eickelberg O, Staab-Weijnitz CA. Новый антифибротический механизм нинтеданиба и пирфенидона. Подавление сборки коллагеновых фибрилл.Am J Respir Cell Mol Biol. 2017; 57: 77–90.

PubMed Статья Google Scholar

49.

Эпштейн Шочет Г., Воллин Л., Шитрит Д. Взаимодействие фибробластов и матрикса: Нинтеданиб и пирфенидон модулируют эффект кондиционированного фибробластами матрикса IPF на нормальный фенотип фибробластов. Респирология. 2018; 23: 756–63.

PubMed Статья Google Scholar

50.

Hostettler KE, Zhong J, Papakonstantinou E, Karakiulakis G, Tamm M, Seidel P, Sun Q, Mandal J, Lardinois D, Lambers C, Roth M.Антифиброзные эффекты нинтеданиба на фибробласты легких, полученные от пациентов с идиопатическим фиброзом легких. Respir Res. 2014; 15: 157.

PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar

51.

Richeldi L, Varone F, Bergna M, de Andrade J, Falk J, Hallowell R, Jouneau S, Kondoh Y, Morrow L, Randerath W, Strek M, Tabaj G. Фармакологическое лечение интерстициальной ткани с прогрессирующим фиброзированием болезни легких: обзор имеющихся данных.Eur Respir Rev.2018; 27: 180074.

PubMed Статья Google Scholar

52.

Nakayama S, Mukae H, Sakamoto N, Kakugawa T., Yoshioka S, Soda H, Oku H, Urata Y, Kondo T, Kubota H, Nagata K, Kohno S. Пирфенидон подавляет экспрессию HSP47 в TGF. -бета1-стимулированные фибробласты легких человека. Life Sci. 2008. 82: 210–7.

PubMed Статья CAS Google Scholar

53.

Kadir S-I, Wenzel Kragstrup T, Dige A, Kok Jensen S, Dahlerup JF, Kelsen J. Пирфенидон подавляет пролиферацию фибробластов у пациентов с активной болезнью Крона. Сканд Дж Гастроэнтерол. 2016; 51: 1321–5.

PubMed Статья CAS Google Scholar

54.

Molina-Molina M, Machahua-Huamani C, Vicens-Zygmunt V, Llatjós R, Escobar I, Sala-Llinas E, Luburich-Hernaiz P, Dorca J, Montes-Worboys A. Антифиброзные эффекты пирфенидон и рапамицин в первичных фибробластах IPF и альвеолярных эпителиальных клетках человека.BMC Pulm Med. 2018; 18:63.

PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar

55.

Schuett J, Ostermann A, Wollin L. Влияние нинтеданиба по сравнению с пирфенидоном на пролиферацию фибробластов легких пациентов с IPF. Eur Respir J. 2015; 46: PA3846.

Google Scholar

56.

Wollin L, Schuett J, Ostermann A. Эффект нинтеданиба по сравнению с пирфенидоном на стимулированную сывороткой пролиферацию первичных фибробластов легких человека в клинически значимых концентрациях.Am J Resp Crit Care Med. 2015: A4940 на https://www.atsjournals.org/doi/abs/10.1164/ajrccm-conference.2015.191.1_MeetingAbstracts.A4940. По состоянию на 6 января 2020 г.

57.

Shin J-M, Park J-H, Park I-H, Lee H-M. Пирфенидон подавляет индуцированную трансформирующим фактором роста β1 продукцию внеклеточного матрикса в фибробластах, происходящих из носовых полипов. Am J Rhinol Allergy. 2015; 29: 408–13. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26637578/.

58.

Курита Ю., Арая Дж., Минагава С., Хара Х, Итикава А., Сайто Н., Кадота Т., Цубучи К., Сато Н., Йошида М., Кобаяси К., Ито С., Фудзита Ю., Утсуми Н., Янагисава Х. , Hashimoto M, Wakui H, Yoshii Y, Ishikawa T., Numata T, Kaneko Y, Asano H, Yamashita M, Odaka M, Morikawa T., Nakayama K, Kuwano K.Пирфенидон подавляет дифференцировку миофибробластов и развитие фиброза легких при недостаточной митофагии. Respir Res. 2017; 18: 114.

PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar

59.

Hisatomi K, Mukae H, Sakamoto N, Ishimatsu Y, Kakugawa T., Hara S, Fujita H, Nakamichi S, Oku H, Urata Y, Kubota H, Nagata K, Kohno S. Пирфенидон ингибирует TGF-β1 -индуцированная сверхэкспрессия коллагена типа I и белка теплового шока 47 в клетках A549.BMC Pulm Med. 2012; 12:24.

PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar

Эволюция Yu-Gi-Oh! Дуэль монстров — OTAQUEST

Модель Yu-Gi-Oh! Франшиза — одна из самых больших сцен TCG в мире, существующая последние 20 лет. Что же такое Yu-Gi-Oh !, ? Сегодня мы сосредоточимся на истоках Duel Monsters и на том, как они развивались за последние два десятилетия.

Мы начинаем с основ Duelist Kingdom и переходим к новым Rush Duels, представленным в новом аниме: Yu-Gi-Oh! Семерки .

Дуэль — это матч между двумя или более игроками, которые используют в своих колодах монстров, ловушки и карты заклинаний. Есть много разных карт уровней монстров от 0 до 12. В каждой стандартной колоде должно быть от 40 до 60 карт, и каждый игрок начинает с 8000 очков жизни. Цель игры — снизить количество жизней противника до нуля, используя свои карты для атаки.

Хотя Yu-Gi-Oh впервые был показан в 1999 году, карточная игра, которую мы все знаем, появилась только в 2000 году. Начало игры было чрезвычайно мягким с точки зрения игрового процесса и сильно отличалось от нашей игры. мы привыкли сейчас. Многие люди до сих пор смотрят это аниме, чтобы понять, как играть.

Однако аниме нарушило так много правил с точки зрения эффектов карт монстров, заклинаний и ловушек, что временами делает его плохим примером. Примером этого является то, когда Юги сражается с Кайбой, объединяет свое Кладбище мамонтов со своей картой Живая стрела, чтобы пронзить Голубоглазого Абсолютного Дракона Кайбы и снизить его очки атаки.Это заставило многих молодых игроков, включая меня, имитировать эти события, но они незаконны.

В это время самые сильные карты имели 2500-3000 очков атаки, и их было очень легко вызвать. Игроки могли призывать чрезвычайно мощные карты монстров, не жертвуя монстрами.

Другими словами, вы можете призвать Голубоглазого Белого Дракона, у которого 3000 очков атаки, как только вы вытащите его из своей колоды, и никто ничего не сможет сказать об этом. Это было исправлено во время турнира Battle City.

Изменения в Battle City

Вскоре после окончания Duelist Kingdom франшиза начала работать над исправлением игрового процесса, поскольку создание более сильных монстров было на горизонте. Battle City не только представил модифицированный дуэльный диск, который упростил дуэль на ходу, но и ввел ключевые правила, которые заложат основу для следующего поколения: жертвовать монстрами и атаковать напрямую.

Принесение в жертву монстров необходимо, если игрок хочет вызвать монстра с более чем 5 звездами.Монстры 5-6 уровня требуют одной жертвы; Уровень 7–9 требует двух жертв, а уровень 10–12 требует трех жертв. Это было добавлено, чтобы замедлить скорость дуэлей и затруднить вызов более сильных монстров.

Прямая атака не была новой концепцией для игроков PS1, Forbidden Memories . Однако для людей, которые только следили за аниме, прямая атака противников была совершенно новой концепцией. Конечно, игроки могут сделать это только в том случае, если на поле их оппонента не было карт монстров.Прямые атаки могут быть отражены магией и картами ловушек.

В этом сезоне новых дополнений к правилам не было; тем не менее, в сериале больше внимания уделяется монстрам слияния. Шоу представило больше спелл-карт, которые можно использовать для свободного объединения монстров или получения полимеризации, таких как: Fusion Gate, Fusion Recovery и Fusion Sage.

Это привело к созданию более тяжелых колод, таких как Elemental Heros, Frightfurs и Destiny Heros.

Неоспацианские карты получили новую способность, называемую контактным слиянием.Это позволяет монстрам этой серии слиться без карт слияния заклинаний, если соответствующие монстры были либо на поле, либо в руке игрока. Эта концепция была дополнительно исследована в 5D.

Не только 5D дал нам карточные игры на мотоциклах, но и дал нам синхронный вызов. Синхронный вызов основывается на концепции контактного слияния и делает еще один шаг вперед с добавлением монстров-тюнеров и синхронных монстров.

Монстры-тюнеры — это монстры, необходимые для вызова синхронного монстра.Для вызова синхронных монстров требуется по крайней мере один монстр-тюнер и один монстр-не-тюнер, и их уровни должны соответствовать уровню синхронного монстра, которого вы хотите вызвать.

Если бы я должен был вызвать шевалье де Флер 8 уровня, мне бы потребовались Флер Синхрон 2 уровня и либо один монстр 6 уровня, 2 монстра третьего уровня или монстр 3 уровня, чтобы вызвать шевалье. Для некоторых карт требуются определенные монстры-тюнеры, а для других — нет. Об этом следует помнить при вызове определенных монстров.Это дополнительно расширено в Zexal.

Zexal представляет нам новый вид призыва: XYZ. Вызов XYZ (Exceed) основан на концепции наличия карт соответствующего уровня для вызова более сильных монстров. Эти карты похожи на карты слияния и синхронизации в том смысле, что они доступны только тогда, когда выполнены требования для их вызова.

Чтобы вызвать XYZ, игроки должны иметь на поле двух или более монстров одного уровня; Затем игроки складывают материалы XYZ друг на друга и вытаскивают карту XYZ, равную уровню сложенных карт.Игроки также могут отсоединить материалы XYZ и отправить карты на кладбище. С картой XYZ ничего не происходит, если ее материалы отсоединены, если это не указано на карте.

Если отделенный материал имеет эффект, который активируется при уничтожении, эффект действительно активируется, потому что в этот момент карта рассматривается как обычная карта монстра. Также важно следить за эффектами монстра XYZ, так как некоторые из этих карт относительно бесполезны, если в них нет материалов XYZ.Использование материалов для призыва более подробно рассматривается в Арке V

Arc V знакомит нас с новой формой особого призыва и типов монстров: маятником.

Маятниковые монстры могут использоваться как обычные карты монстров или использоваться для установки параметров для вызова маятника. Подобно вызову XYZ, вызов маятника требует, чтобы у игрока было два маятниковых монстра на поле в зоне карты заклинаний / ловушек, чтобы «установить масштаб».

После того, как он установлен, игрок может вызывать столько маятниковых монстров, сколько он хочет, при условии, что они попадают между уровнями на шкале один раз за ход.В результате игроки пользуются этим и вызывают материалы, необходимые для вызова слияния, синхронизации или XYZ. Важно отметить, что карты, используемые для установки шкалы, считаются картами заклинаний, поэтому их нельзя использовать для атаки противников.

Vrains приносит нам вызов Link, новый сложный формат и скоростные дуэли. Монстры-линки похожи на монстров слияния в том смысле, что их нужно специально вызывать. Однако все остальное в них другое.

Призыв ссылки

Во-первых, линковые монстры не имеют уровня или очков защиты; вместо этого у них есть уровень связи.Уровни связи показывают, сколько монстров необходимо принести в жертву, чтобы вызвать именно этого монстра связи. Призванные монстры-линки переходят в специальную зону над зоной карты главного монстра. Следует отметить, что у монстров-ссылок есть стрелки на карточке, указывающие на зоны, на которые они указывают.

Слоты, на которые указывает монстр связи, теперь связаны с монстром связи, и эффекты этого монстра связи теперь применяются к любому монстру, установленному в зонах, на которые указывают стрелки.Эти связанные зоны также позволяют игрокам вызывать больше карт xyz, synchro и fusion. Однако у игроков должны быть соответствующие материалы, необходимые для вызова этой карты.

Новый формат

До Vrains игровое поле представляло собой сложный беспорядок. Шкала Маятника имела свою собственную зону вместо того, чтобы находиться в зоне карты заклинаний / ловушек. Кроме того, поле было окружено кладбищем, дополнительной колодой, изгнанными и полевыми ячейками для карт. Тем не менее, Vrains исправил это, изменив слоты на простое поле 2 x 12 с одним слотом над зоной карты монстров для специальных вызванных карт.

Скоростные дуэли

Скоростные дуэли такие же, как и обычные, с небольшими изменениями. Для правильной скоростной дуэли игрокам необходимо 20-30 карт в своих колодах. Вместо обычных 5 ячеек для карт монстров и заклинаний / ловушек вы получаете 3. Вместо обычных 8000 очков жизни игроки начинают с 4000.

Игроки могут использовать обычные карты монстров, заклинаний и ловушек, но игрокам нужны специальные карты навыков, которые идут рядом с колодой. Эти специальные карты навыков можно активировать только после выполнения требований карты.

Sevens началась месяц назад и состоит всего из 4 эпизодов, но в ней уже представлены Rush Duels. Однако об этих поединках известно не так много информации только потому, что аниме только началось и недавно было отложено из-за COVID-19. Однако есть кое-что, что мы знаем.

Игроки должны иметь в своих колодах традиционные 40-60 карт, но им нужны специальные карты спешки. У них также может быть одна карта легенды в своей колоде. Карты легенды — это карты, которыми дуэлянт известен больше всего.

Например, Джейден Юки будет Крылатым Курибо, а Юсей Фудо — Драконом Звездной Пыли. Такие игроки, как Сето Кайба, облажались, потому что теперь им разрешено иметь в своих колодах только одного Голубоглазого Белого Дракона.

Как и в скоростных дуэлях, здесь всего 3 зоны монстров и карты заклинаний / ловушек, но игроки начинают с 8000 очков жизни. Вместо правила брать одну карту за ход, игроки теперь должны брать до тех пор, пока в их руках не будет 5 карт в начале своего хода. Игроки могут призывать столько, сколько захотят, но они все равно должны приносить в жертву монстров, чтобы вызывать карты выше 5 уровня.

Dueling прошел долгий путь от очень упрощенного начала и остается важной частью фандомов TCG. У него даже есть свой собственный ежегодный Мировой турнир, который проводится по всему миру и привлекает много новых зрителей. Хотя для того, чтобы выучить все правила, нужно немного времени, в эту игру довольно весело играть.

Thesis Front Matter

% PDF-1.4 % 1 0 объект > эндобдж 4 0 obj >> эндобдж 2 0 obj > эндобдж 3 0 obj > ручей Microsoft® Word 2016

Thesis Front Matter

Jithamala

Microsoft® Word 20162017-04-16T21: 10: 11-06: 002017-04-16T21: 10: 11-06: 00uuid: BD5D0678-5ADA-43E3-BF19-B1B5A152F5F3uuid : BD5D0678-5ADA-43E3-BF19-B1B5A152F5F3 конечный поток эндобдж 5 0 obj > эндобдж 6 0 obj > эндобдж 7 0 объект > эндобдж 8 0 объект > эндобдж 9 0 объект > эндобдж 10 0 obj > эндобдж 11 0 объект > эндобдж 12 0 объект > эндобдж 13 0 объект > эндобдж 14 0 объект > эндобдж 15 0 объект > эндобдж 16 0 объект > эндобдж 17 0 объект > эндобдж 18 0 объект > эндобдж 19 0 объект > эндобдж 20 0 объект > эндобдж 21 0 объект > эндобдж 22 0 объект > эндобдж 23 0 объект > эндобдж 24 0 объект > эндобдж 25 0 объект > эндобдж 26 0 объект > эндобдж 27 0 объект > эндобдж 28 0 объект > эндобдж 29 0 объект > эндобдж 30 0 объект > эндобдж 31 0 объект > эндобдж 32 0 объект > эндобдж 33 0 объект > эндобдж 34 0 объект > эндобдж 35 0 объект > эндобдж 36 0 объект > эндобдж 37 0 объект > эндобдж 38 0 объект > эндобдж 39 0 объект > эндобдж 40 0 объект > эндобдж 41 0 объект > эндобдж 42 0 объект > эндобдж 43 0 объект > эндобдж 44 0 объект > эндобдж 45 0 объект > эндобдж 46 0 объект > эндобдж 47 0 объект > эндобдж 48 0 объект > эндобдж 49 0 объект > эндобдж 50 0 объект > эндобдж 51 0 объект > эндобдж 52 0 объект > эндобдж 53 0 объект > эндобдж 54 0 объект > эндобдж 55 0 объект > эндобдж 56 0 объект > эндобдж 57 0 объект > эндобдж 58 0 объект > эндобдж 59 0 объект > эндобдж 60 0 объект > эндобдж 61 0 объект > эндобдж 62 0 объект > эндобдж 63 0 объект > эндобдж 64 0 объект > эндобдж 65 0 объект > эндобдж 66 0 объект > эндобдж 67 0 объект > эндобдж 68 0 объект > эндобдж 69 0 объект > эндобдж 70 0 объект > эндобдж 71 0 объект > эндобдж 72 0 объект > эндобдж 73 0 объект > эндобдж 74 0 объект > эндобдж 75 0 объект > эндобдж 76 0 объект > эндобдж 77 0 объект > эндобдж 78 0 объект > эндобдж 79 0 объект > эндобдж 80 0 объект > эндобдж 81 0 объект > эндобдж 82 0 объект > эндобдж 83 0 объект > эндобдж 84 0 объект > эндобдж 85 0 объект > эндобдж 86 0 объект > эндобдж 87 0 объект > эндобдж 88 0 объект > эндобдж 89 0 объект > эндобдж 90 0 объект > эндобдж 91 0 объект > эндобдж 92 0 объект > эндобдж 93 0 объект > эндобдж 94 0 объект > эндобдж 95 0 объект > эндобдж 96 0 объект > эндобдж 97 0 объект > эндобдж 98 0 объект > эндобдж 99 0 объект > эндобдж 100 0 объект > эндобдж 101 0 объект > эндобдж 102 0 объект > эндобдж 103 0 объект > эндобдж 104 0 объект > эндобдж 105 0 объект > эндобдж 106 0 объект > эндобдж 107 0 объект > эндобдж 108 0 объект > эндобдж 109 0 объект > эндобдж 110 0 объект > эндобдж 111 0 объект > эндобдж 112 0 объект > эндобдж 113 0 объект > эндобдж 114 0 объект > эндобдж 115 0 объект > эндобдж 116 0 объект > эндобдж 117 0 объект > эндобдж 118 0 объект > эндобдж 119 0 объект > эндобдж 120 0 объект > эндобдж 121 0 объект > эндобдж 122 0 объект > эндобдж 123 0 объект > эндобдж 124 0 объект > эндобдж 125 0 объект > эндобдж 126 0 объект > эндобдж 127 0 объект > эндобдж 128 0 объект > эндобдж 129 0 объект > эндобдж 130 0 объект > эндобдж 131 0 объект > эндобдж 132 0 объект > эндобдж 133 0 объект > эндобдж 134 0 объект > эндобдж 135 0 объект > эндобдж 136 0 объект > эндобдж 137 0 объект > эндобдж 138 0 объект > эндобдж 139 0 объект > эндобдж 140 0 объект > эндобдж 141 0 объект > эндобдж 142 0 объект > эндобдж 143 0 объект > эндобдж 144 0 объект > эндобдж 145 0 объект > эндобдж 146 0 объект > эндобдж 147 0 объект > эндобдж 148 0 объект > эндобдж 149 0 объект > эндобдж 150 0 объект > эндобдж 151 0 объект > эндобдж 152 0 объект > эндобдж 153 0 объект > эндобдж 154 0 объект > эндобдж 155 0 объект > эндобдж 156 0 объект > эндобдж 157 0 объект > эндобдж 158 0 объект > эндобдж 159 0 объект > эндобдж 160 0 объект > эндобдж 161 0 объект > эндобдж 162 0 объект > эндобдж 163 0 объект > эндобдж 164 0 объект > эндобдж 165 0 объект > эндобдж 166 0 объект > эндобдж 167 0 объект > эндобдж 168 0 объект > эндобдж 169 0 объект > эндобдж 170 0 объект > эндобдж 171 0 объект > эндобдж 172 0 объект > эндобдж 173 0 объект > эндобдж 174 0 объект > эндобдж 175 0 объект > эндобдж 176 0 объект > эндобдж 177 0 объект > эндобдж 178 0 объект > эндобдж 179 0 объект > эндобдж 180 0 объект > эндобдж 181 0 объект > эндобдж 182 0 объект > эндобдж 183 0 объект > эндобдж 184 0 объект > эндобдж 185 0 объект > эндобдж 186 0 объект > эндобдж 187 0 объект > эндобдж 188 0 объект > эндобдж 189 0 объект > эндобдж 190 0 объект > эндобдж 191 0 объект > эндобдж 192 0 объект > эндобдж 193 0 объект > эндобдж 194 0 объект > эндобдж 195 0 объект > эндобдж 196 0 объект > эндобдж 197 0 объект > эндобдж 198 0 объект > эндобдж 199 0 объект > эндобдж 200 0 объект > эндобдж 201 0 объект > эндобдж 202 0 объект > эндобдж 203 0 объект > эндобдж 204 0 объект > эндобдж 205 0 объект > эндобдж 206 0 объект > эндобдж 207 0 объект > эндобдж 208 0 объект > эндобдж 209 0 объект > эндобдж 210 0 объект > эндобдж 211 0 объект > эндобдж 212 0 объект > эндобдж 213 0 объект > эндобдж 214 0 объект > эндобдж 215 0 объект > эндобдж 216 0 объект > эндобдж 217 0 объект > эндобдж 218 0 объект > эндобдж 219 0 объект > эндобдж 220 0 объект > эндобдж 221 0 объект > эндобдж 222 0 объект > эндобдж 223 0 объект > эндобдж 224 0 объект > эндобдж 225 0 объект > эндобдж 226 0 объект > эндобдж 227 0 объект > эндобдж 228 0 объект > эндобдж 229 0 объект > эндобдж 230 0 объект > эндобдж 231 0 объект > эндобдж 232 0 объект > эндобдж 233 0 объект > эндобдж 234 0 объект > эндобдж 235 0 объект > эндобдж 236 0 объект > эндобдж 237 0 объект > эндобдж 238 0 объект > эндобдж 239 0 объект > эндобдж 240 0 объект > эндобдж 241 0 объект > эндобдж 242 0 объект > эндобдж 243 0 объект > эндобдж 244 0 объект > эндобдж 245 0 объект > эндобдж 246 0 объект > эндобдж 247 0 объект > эндобдж 248 0 объект > эндобдж 249 0 объект > эндобдж 250 0 объект > эндобдж 251 0 объект > эндобдж 252 0 объект > эндобдж 253 0 объект > эндобдж 254 0 объект > эндобдж 255 0 объект > эндобдж 256 0 объект > эндобдж 257 0 объект > эндобдж 258 0 объект > эндобдж 259 0 объект > эндобдж 260 0 объект > эндобдж 261 0 объект > эндобдж 262 0 объект > эндобдж 263 0 объект > эндобдж 264 0 объект > эндобдж 265 0 объект > эндобдж 266 0 объект > эндобдж 267 0 объект > эндобдж 268 0 объект > эндобдж 269 0 объект > эндобдж 270 0 объект > эндобдж 271 0 объект > эндобдж 272 0 объект > эндобдж 273 0 объект > эндобдж 274 0 объект > эндобдж 275 0 объект > эндобдж 276 0 объект > эндобдж 277 0 объект > эндобдж 278 0 объект > эндобдж 279 0 объект > эндобдж 280 0 объект > эндобдж 281 0 объект > эндобдж 282 0 объект > эндобдж 283 0 объект > эндобдж 284 0 объект > эндобдж 285 0 объект > эндобдж 286 0 объект > эндобдж 287 0 объект > эндобдж 288 0 объект > эндобдж 289 0 объект > эндобдж 290 0 объект > эндобдж 291 0 объект > эндобдж 292 0 объект > эндобдж 293 0 объект > эндобдж 294 0 объект > эндобдж 295 0 объект > эндобдж 296 0 объект > эндобдж 297 0 объект > эндобдж 298 0 объект > эндобдж 299 0 объект > эндобдж 300 0 объект > эндобдж 301 0 объект > эндобдж 302 0 объект > эндобдж 303 0 объект > эндобдж 304 0 объект > эндобдж 305 0 объект > эндобдж 306 0 объект > эндобдж 307 0 объект > эндобдж 308 0 объект > эндобдж 309 0 объект > эндобдж 310 0 объект > ручей xVk @ ȷ inAl ޹ SVPт ݽ Ro0Mu3e * \ ~ Q = I ~ ͤs] ߆ JoóYxRhEa, USxL-Ӏ> PTZ4K (! T; /! k2k9 & mSw =} gEi 툌%> 5a) MS [Qc8: 1iHSNZaJo] jS ,