Д243А характеристики: Д243А, Диод выпрямительный, СЗТП | купить в розницу и оптом

Содержание

Диод Д243 — DataSheet

Корпус диода Д243

Описание

Диоды кремниевые, диффузионные. Предназначены для преобразования переменного напряжения частотой до 1,1 кГц. Выпускаются
в металлостеклянном корпусе с жесткими выводами. Тип диода и схема соединения электродов с выводами приводятся на корпусе.
Масса диода с комплектующими деталями не более 18 г.

Пои креплении диодов усилие затяжки должно быть не более 1,96 Н·м (0,2 кгс·м). При этом запрещается прилагать к изолированному выводу усилие, превышающее 9,8 Н (1 кгс), так как это может привести к нарушению целостности стеклянного изолятора.

Размеры радиатора (теплоотвода) рассчитываются из условия, что диод является точечным источником теплоты, рассеивающим мощность 2Uпр.срIпр.ср.

При последовательном соединении диодов рекомендуется применять диоды одного типа и шунтировать каждый резистором сопротивлением 10…15 кОм на каждые 100 В амплитуды обратного напряжения.

 

Характеристики диода Д243
Параметр Обозначение Маркировка Значение Ед. изм.
Аналог Д243 1N2248
Д243Б 1N1061
Максимальное постоянное обратное напряжение. Uo6p max, Uo6p и max Д243 200 В
Д243А 200
Д243Б 200
Максимальный постоянный прямой ток. Iпp max, Iпp ср max, I*пp и max Д243 10 А
Д243А 10
Д243Б 5
Максимальная рабочая частота диода fд max Д243 1.1 кГц
Д243А 1.1
Д243Б 1.1
Постоянное прямое напряжение Uпр не более (при Iпр, мА) Д243 1.25 (10 А) В
Д243А 1 (10 А)
Д243Б 1.5 (5 А)
Постоянный обратный ток Iобр не более (при Uобр, В) Д243 3000 (200) мкА
Д243А 3000 (200)
Д243Б 3000 (200)
Время обратного восстановления — время переключения диода с заданного прямого тока на заданное обратное напряжение от момента прохождения тока через нулевое значение до момента достижения обратным током заданного значения tвос, обр Д243 мкс
Д243А
Д243Б
Общая емкость Сд (при Uобр, В) Д243 пФ
Д243А
Д243Б

Описание значений со звездочками(*) смотрите в буквенных обозначениях параметров диодов.

 

Зависимость допустимого прямого тока от температуры

Зависимость среднего прямого тока от частоты

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.

Диод Д242, Д242А, Д242Б, Д243, Д243А, Д245, Д245А, Д246, Д247, Д248

Поиск по сайту


Диоды Д242, Д242А, Д242Б, Д243, Д243А, Д245, Д245А, Д246, Д247, Д248 - диффузионные, кремниевые. Основное назначение - преобразование переменного напряжения. Граничная частота - 1 кГц. Корпус диодов - металлостеклянный. Имеются жёсткие выводы. На корпусе диодов нанесена их цоколёвка и тип.
Вместе с комплектующими деталями диоды весят около 18 г.

Электрические параметры Д242, Д243, Д245, Д246, Д247, Д248

Прямое напряжение (среднее)
Д242А, Д243А, Д245А, Д246А 1 В
Д242, Д243, Д245, Д246, Д247 1.25 В
Д242Б, Д243Б, Д245Б, Д246Б, Д247Б, Д248Б 1.5 В
Обратный ток (средний), не более 3 мА


Предельные технические характеристики диодов


Д242, Д243, Д245, Д246, Д247, Д248
Обратное напряжение (импульсное)
Д242, Д242А, Д242Б 100 В
Д243, Д243А, Д243Б 200 В
Д245, Д245А, Д245Б 300 В
Д246, Д246А, Д246Б 400 В
Д247, Д247Б 500 В
Д248Б 600 В
Прямой ток (средний)
Д242, Д242А, Д243, Д243А, Д245, Д245А, Д246, Д246А, Д247 10 А
Д242Б, Д243Б, Д245Б, Д246Б, Д247Б, Д248Б 5 А

Рабочая температура: -60...+130°C



Диод Д243А

Справочник количества содержания ценных металлов в диоде Д243А согласно паспорта на изделие и информационной литературы. Указано точное значение драгоценных металлов в граммах (Золото, серебро, платина, палладий и другие) на единицу изделия.

Содержание драгоценных металлов в диоде Д243А

Золото: 0,002 грамм.

Серебро: 0 грамм.
Платина: 0 грамм.
Палладий: 0 грамм.

Источник информации: Производитель – Россия Из справочника Связьоценка.

Фото диода Д243А:

Панель ламповая виды

Диод — электронный элемент, обладающий различной проводимостью в зависимости от направления электрического поля. Электрод диода, подключаемый к положительному полюсу источника тока, когда диод открыт (то есть имеет маленькое сопротивление), называют анодом, подключаемый к отрицательному полюсу — катодом.

О комплектующем изделии – Диод

Диод – видео.

Диод это полупроводниковый прибор основанный на PN-переходе. А если без теории, то диод в одном направлении пропускает ток, а в другом нет. Вот и все.

Как работает диод – видео.

В этом выпуске вы узнаете: что такое диод, принцип действия диода, как работает диод, что такое p – n переход; что такое прямой ток диода, что такое обратный ток диода; каково внутреннее сопротивление диода; что такое вольт- амперная характеристика диода; что такое пропускное и не пропускное напряжение диода; как работает диод в цепи постоянного тока, как работает диод в цепи переменного тока; как устроен плоскостной диод; какие существуют виды диодов; как устроен выпрямительный диод.

Характеристики диодов Д243А:

Купить или продать а также цены на Диод Д243А:

Оставьте отзыв о Д243А:

Вариант 21 I. Задание Стабилитроны. Условное обозначение на схеме. Вольт-амперная характеристика. Параметры стабилитрона... Задача 1 Составить схему однофазного мостового выпрямителя, используя стандартные диоды типа Д217, Д233Б, Д243А. Параметры диодов приведены в табл. 3 в Методических... #1303064

Вариант 21 3
I. Задание 3
Задача 1 6
Задача 2 7
Задача 3 9
Вариант 21 11
Задача 1 11
Задача 2 15
Задача 3 18
Задача 4 21
Список литературы 25

Задания к работе:
I. Задание
Стабилитроны. Условное обозначение на схеме. Вольт-амперная характеристика. Параметры стабилитрона...
Задача 1
Составить схему однофазного мостового выпрямителя, используя стандартные диоды типа Д217, Д233Б, Д243А. Параметры диодов приведены в табл. 3 в Методических указаниях.
Мощность потребителя Рd = 600 Вт при напряжении питания Ud =200 В. Пояснить на основании чего сделан выбор. Начертить схему выпрямителя, описать принцип его действия, используя графики входного и выходного напряжений...
...
Задача 4
Для асинхронного электродвигателя даны следующие величины при номинальной нагрузке: суммарные потери мощности в двигателе ; коэффициент полезного действия ηном = 0,88; синхронная частота вращения магнитного поля n1 = 3000 об/мин и частота тока в роторе f2s = 1,67 Гц. Частота тока в сети равна f1 = 50 Гц.

Определить:
1) потребляемую мощность Р1 и номинальную полезную мощность Рном2;
2) скольжение Sном;
3) частоту вращения ротора nном2;
4) число пар полюсов двигателя;
5) полезный вращающий момент на валу.
Механическая характеристика асинхронного двигателя n2 = f(M)...

1. Ушаков В.Н. Электротехника и электроника. - М.: Радио и связь, 1997. – 328 с.
2. Бечева М. К. и др. Электротехника и электроника. - М.: Высшая школа, 1991. - 224 с.
3. Мучник А.Я., Парфенов К.А. Общая электротехника. - М. Высшая школа, 1967. - 446 с.
4. Фриск В.В. Основы теории цепей. - М.: Радиософт, 2002. - 288 с.
5. Попов В.П. Основы теории цепей. - M: Высшая школа, 1985. - 496 с.
6. Базлов Е.Ф., Козлов А.В., Михайлов В.А. Основы теории цепей. - Казань: ЗАО «Новое знание», 2007. – 155 с.
7. Гоноровский И.С. Радиотехнические цепи и сигналы. Учебник для вузов. - M: Радио и связь, 1986. – 512 с.
8. Важнов А.И. Электрические машины. - СПб.: Энергия, 1998. - 768 с.
9. Хвостов В. Электрические машины. Машины постоянного тока. - М.Машиностроение, 1983. – 336 с.

Тема: Вариант 21
I. Задание
Стабилитроны. Условное обозначение на схеме. Вольт-амперная характеристика. Параметры стабилитрона...
Задача 1
Составить схему однофазного мостового выпрямителя, используя стандартные диоды типа Д217, Д233Б, Д243А. Параметры диодов приведены в табл. 3 в Методических указаниях.
Мощность потребителя Рd = 600 Вт при напряжении питания Ud =200 В. Пояснить на основании чего сделан выбор. Начертить схему выпрямителя, описать принцип его действия, используя графики входного и выходного напряжений...
Артикул: 1303064
Дата написания: 06.12.2011
Тип работы: Задачи
Предмет: Электротехника и электроника
Оригинальность: Антиплагиат.ВУЗ — 87%
Количество страниц: 26

Д242, Д243, Д245, Д246, Д247, Д248

Все картинки в новостях кликабельные, то есть при нажатии они увеличиваются.

Диоды кремниевые диффузионные: Д242, Д242А, Д242Б, Д243, Д243А, Д243Б, Д245, Д245А, Д245Б, Д246, Д246А, Д246Б, Д247, Д247Б, Д248Б.

Выпускаются в металлостеклянном корпусе с жесткими выводами.

Масса диода не более 12 грамм (с комплектующими деталями 18 грамм).

Чертеж диода Д242, Д242А, Д242Б, Д243, Д243А, Д243Б, Д245, Д245А, Д245Б, Д246, Д246А, Д246Б, Д247, Д247Б, Д248Б

Электрические параметры.

Среднее прямое напряжение при Iпр.ср.=Iпр.ср.макс и Uобр=Uобр.макс, не более: от -60,15 до 74,85°С
Д242А, Д243А, Д245А, Д246А 1,0 В
Д242, Д243, Д245, Д246, Д247 1,25 В
Д242Б, Д243Б, Д245Б, Д246Б, Д247Б, Д248Б 1,5 В
при 129,85°С 1 В
Средний обратный ток при Uобр=Uобр.макс Iпр.ср.=Iпр.ср.макс, температуре от -60,15 до 129,85°С, не более 3 мА

Предельные эксплуатационные данные.

Обратное напряжение (амплитудное значение):
Д242, Д242А, Д242Б 100 В
Д243, Д243А, Д243Б 200 В
Д245, Д245А, Д245Б 300 В
Д246, Д246А, Д246Б 400 В
Д247, Д247Б 500 В
Д248Б 600 В
Средний прямой ток:
Д242А, Д243А, Д245А, Д246А 10 А
Д242, Д243, Д245, Д246, Д247 (от -60,15 до 74,85°С) 10 А
Д242Б, Д243Б, Д245Б, Д246Б, Д247Б, Д248Б 5 А
Д242, Д243, Д245, Д246, Д247 (при 124,85°С) 5 А
Д242Б, Д243Б, Д245Б, Д246Б, Д247Б, Д248Б 2 А
Средний прямой ток перегрузки в течение 0,5 с 3 Iпр.ср
Частота без снижения режимов 1,2 кГц
Температура окружающей среды

От -60,15 до 124,85°С

Зависимость допустимого среднего прямого тока от температуры

Зависимость допустимого среднего прямого тока от температуры.

Зависимость среднего прямого тока от частоты

Зависимость среднего прямого тока от частоты.

Зависимость среднего обратного тока от напряжения

Зависимость среднего обратного тока от напряжения.


ТНВД 4PL MY-420*3478 (Д243А) (4PL318Q) 3-х WEIFU 776.1111005-01Эweifu, артикул запчасти 776.1111005-01Эweifu

Описание: ТНВД 4PL MY-420*3478 (Д243А) (4PL318Q) 3-х WEIFU 776.1111005-01Эweifu

ТНВД 4PL MY-420*3478 (Д243А) (4PL318Q) 3-х WEIFU 776.1111005-01Эweifu

Артикул: 776.1111005-01Эweifu

Характеристики: ТНВД 4PL MY-420*3478 (Д243А) (4PL318Q) 3-х WEIFU 776.1111005-01Эweifu

ТНВД 4PL MY-420*3478 (Д243А) (4PL318Q) 3-х WEIFU 776.1111005-01Эweifu

Артикул: 776.1111005-01Эweifu

Доставка: ТНВД 4PL MY-420*3478 (Д243А) (4PL318Q) 3-х WEIFU 776.1111005-01Эweifu

Наша компания сотрудничает с ведущими транспортными компаниями РФ. Доставка осуществляется по всей России.

Доставка товаров со склада в г. Ярославль до терминала ТК осуществляется БЕСПЛАТНО собственный транспортом.

Точная стоимость доставки зависит от тарифов транспортной компании и характеристики груза (вес, объем).

Самовывоз

График работы всех отделений: ПН-ПТ c 8:00 до 18:00*, СБ-ВС выходной
*Время работы указано в соответствии с часовым поясом каждого филиала

Вы можете забрать заказанные товары с пунктов самовывоза в наших филиалах:

г. Ярославль (Основной склад)
Адрес: 150044, г. Ярославль , ул. Полушкина роща, дом 16 (ориентир проходная)

г. Ярославль (Филиал)
Адрес: 150029, г. Ярославль , Промзона, ул. Декабристов, 5

г. Сургут
Адрес: 628400, Россия, ХМАО, г. Сургут, ул. Крылова д. 61. Рядом с магазином "АвтоГалактика"

г. Нижневартовск
Адрес: 628600, ХМАО-Югра, Тюменская обл., г. Нижневартовск, ул. Авиаторов 16

г. Екатеринбург
Адрес: 620050, г. Екатеринбург, ул. Билимбаевская, д. 4

г. Бузулук
Адрес: Россия, Оренбургская область, г. Бузулук, ул. Дорожная, 35

г. Оренбург
Адрес: г. Оренбург, ул. Путейская, 19

г. Барнаул
Адрес: Россия, Алтайский край, г. Барнаул, ул. Попова, 248/2, территория «Экспресс экспедиция»

Описание диодов Д242 - Д248

Диод Д242 Д242А Д242Б
U обр, (V) 100 100 100
I прямой max , (A) 10 10 5
I обрат max , (mkA) 3 3 3
Корпус:

 

Диод Д243 Д243А Д243Б
U обр, (V) 200 200 200
I прямой max , (A) 10 10 5
I обрат max , (mkA) 3 3 3
Корпус:
Диод Д244 Д244А Д244Б
U обр, (V) 50 50 50
I прямой max , (A) 10 10 5
I обрат max , (mkA) 3 3 3
Диод Д245 Д245А Д245Б
U обр, (V) 300 300 300
I прямой max , (A) 10 10 5
I обрат max , (mkA) 3 3 3
Корпус:
Диод Д246 Д246А Д246Б
U обр, (V) 400 400 400
I прямой max , (A) 10 10 5
I обрат max , (mkA) 3 3 3
Диод Д247 Д247Б Д248Б
U обр, (V) 500 500 600
I прямой max , (A) 10 5 5
I обрат max , (mkA) 3 3 3

 

Предыдущая запись

Описание tda7386 Datasheet

Следующая запись

Описание диод д226

Вам также могут понравиться

миссенс-мутаций ABCB4 D243A, K435T, G535D, I490T, R545C и S978P значительно нарушают липидную флоппазу и, вероятно, предрасполагают к вторичным патологиям в человеческой популяции

2524 E.J.Andress et al.

9. Fickert P, Zollner G, Fuchsbichler A, Stumptner C., Weiglein

AH, Lammert F, Marschall HU, Tsybrovskyy O, Zatloukal K,

Denk H, Trauner M (2002) Урсодезоксихолиевая кислота 2 (2002). у мышей с перевязкой желчных протоков и с нокаутом Mdr2 посредством разрушения холангиол.Гастроэнтерология 123 (4): 1238–1251

10. Mauad TH, van Nieuwkerk CM, Dingemans KP, Smit JJ, Schin-

kel AH, Notenboom RG, van den Bergh Weerman MA, Ver-

kruisen RP, Groen AK, Oude Elferink RP etal (1994) Мыши

с гомозиготным нарушением гена Р-гликопротеина mdr2.

Новая модель на животных для изучения негнойных заболеваний у женщин-

маторный холангит и гепатоканцерогенез. Am J Pathol

145 (5): 1237–1245

11.Икенага Н., Лю С.Б., Свердлов Д.Ю., Йошида С., Нассер И., Кэ Q,

Канг П.М., Попов Ю. (2015) Новая модель мыши Mdr2 (- / -)

склерозирующего холангита с быстрым прогрессированием фиброза,

ранняя портальная гипертензия и рак печени. Am J Pathol

185 (2): 325–334

12. Tougeron D, Fotsing G, Barbu V, Beauchant M (2012) ABCB4 /

Мутации гена MDR3 и холангиокарциномы. J Hepatol

57 (2): 467–468

13. Degiorgio D, Crosignani A, Colombo C, Bordo D, Zuin M, Vas-

sallo E, Syren ML, Coviello DA, Battezzati PM (2016) ABCB4

мутации у взрослых пациентов с холестатической болезнью печени: влияют на

и фенотипическую экспрессию.J Gastroenterol 51 (3): 271–280

14. Pauli-Magnus C, Curb R, Fattinger K, Lang T, Anwald B,

Kullak-Ublick GA, Beuers U, Meier PJ (2004) BSEP and

Структура гаплотипа MDR3 у здоровых европеоидов, первичный цирроз печени и первичный склерозирующий холангит. Гепатология

39 (3): 779–791

15. Лусена Дж. Ф., Эрреро Дж., Кирога Дж., Сангро Б., Гарсия-Фонсильяс

Дж, Забалеги Н., Сола Дж., Херрайс М., Медина Дж. Ф., Прието Дж. (2003 )

Мутация гена с множественной лекарственной устойчивостью 3, вызывающая холелитиаз,

холестаз при беременности и билиарный цирроз во взрослом возрасте.Гастро-

энтерология 124 (4): 1037–1042

16. Итон Дж. Э., Талвалкар Дж. А., Лазаридис К. Н., Горс Г. Дж., Линдор К. Д.

Патогенез первичного склерозирующего холангита и достижения в диагностике и лечении

. Гастроэнтерология 145 (3): 521–536

17. Rizvi S, Gores GJ (2013) Патогенез, диагностика и лечение холангиокарциномы

. Гастроэнтерология

145 (6): 1215–1229

18. Разумилава Н., Горс Г.Дж. (2013) Классификация, диагностика и лечение холангиокарциномы

.Clin Gastroenterol Hepatol

O ff Clin Pract J Am Gastroenterol Assoc 11 (1): 13–21

19. Broome U, Olsson R, Loof L, Bodemar G, Hultcrantz R, Dan-

ielsson A, Prytz H, Sandberg -Gertzen H, Wallerstedt S, Lindberg

G (1996) Естественная история и прогностические факторы у 305 шведских

пациентов с первичным склерозирующим холангитом. Gut 38 (4): 610–615

20. Бурак К., Ангуло П., Паша Т.М., Иган К., Петц Дж., Линдор К.Д.

(2004) Заболеваемость и факторы риска холангиокарциномы при первичном склерозирующем холангите.Am J Gastroenterol 99 (3): 523–526

21. Акисава Н., Маеда Т., Цуда К., Нисимори И., Морита М., Ивасаки

С., Томита А., Сайбара Т., Ониши С., Киёку Ю., Энзан Х ( 1998)

Первичный билиарный цирроз, связанный с холангиокарциномой.

Dig Dis Sci 43 (9): 2138–2142

22. Welzel TM, Graubard BI, El-Serag HB, Shaib YH, Hsing AW,

Davila JA, McGlynn KA (2007) Факторы риска для внутрипеченочных и

внепеченочная холангиокарцинома в Соединенных Штатах: популяционное исследование

случай-контроль.Clin Gastroenterol Hepatol O ff

Clin Pract J Am Gastroenterol Assoc 5 (10): 1221–1228

23. Groen A, Romero MR, Kunne C, Hoosdally SJ, Dixon PH,

Wooding C, Williamson C, Seppen J, Van den Oever K, Mok

KS, Paulusma CC, Linton KJ, Oude Elferink RP (2011) Com-

дополнительных функций ipase ATP8B1 и oppase

ABCB4 в поддержании целостности канальцевой мембраны. Гастро-

энтерология 141 (5): 1927–1937

24.Andress EJ, Nicolaou M, Romero MR, Naik S, Dixon PH, Wil-

liamson C, Linton KJ (2014) Молекулярно-механическое объяснение

спектра холестатического заболевания, вызываемого разновидностью S320F,

муравья ABCB4. Гепатология 59 (5): 1921–1931

25. Шинделин Дж., Арганда-Каррерас I, Фризе Э., Кайниг В., Лонгаир

М., Пицш Т., Прейбиш С., Рюден С., Заальфельд С., Шмид Б.,

Тиневез. JY, White DJ, Hartenstein V, Eliceiri K, Tomancak P,

Cardona A (2012) Фиджи: платформа с открытым исходным кодом для биологического анализа изображений

.Nat Methods 9 (7): 676–682

26 Loo TW, Clarke DM (1997) Коррекция дефектного белка

кинезис мутантов человеческого P-гликопротеина с помощью субстратов и модуляторов

. J Biol Chem 272 (2): 709–712

27 Poupon R, Arrive L, Rosmorduc O (2010) Графические особенности cholangio-

тяжелых форм дефицита ABCB4 / MDR3-

, ассоциированного с холангиопатией у взрослых. Гастроэнтерол Clin Biol

34 (6–7): 380–387

28 Ямашики М., Косака Ю., Нисимура А., Ватанабе С., Номото

М., Ичида Ф (1998) Анализ уровней цитокинов в сыворотке первичных

желчных протоков пациенты с циррозом печени и здоровые взрослые.J Clin Lab Anal

12 (2): 77–82

29 Neuman M, Angulo P, Malkiewicz I, Jorgensen R, Shear N,

Dickson ER, Haber J, Katz G, Lindor K (2002) Некроз опухоли

Фактор-альфа

и трансформирующий фактор роста-бета отражают серьезность

повреждения печени при первичном билиарном циррозе. J Gastroenterol

Hepatol 17 (2): 196–202

30 Popov Y, Patsenker E, Fickert P, Trauner M, Schuppan D (2005)

Mdr2 (Abcb4) - / - у мышей спонтанно развиваются тяжелые желчные протоки

через массивную дисрегуляцию про- и антифиброгенных генов

.J Hepatol 43 (6): 1045–1054

31 Fickert P, Fuchsbichler A, Wagner M, Zollner G, Kaser A, Tilg

H, Krause R, Lammert F, Langner C, Zatloukal K, Marschall

HU, Denk H, Trauner M (2004) Регургитация желчных кислот из

протекающих желчных протоков

вызывает склерозирующий холангит у мышей с нокаутом Mdr2 (Abcb4)

. Гастроэнтерология 127 (1): 261–274

32 Katzenellenbogen M, Mizrahi L, Pappo O, Klopstock N, Olam

D, Jacob-Hirsch J, Amariglio N, Rechavi G, Domany E, Galun

E, Goldenberg D. (2007) Молекулярные механизмы карциногенеза печени у мышей с нокаутом mdr2.Mol Cancer Res

5 (11): 1159–1170

33 Aller SG, Yu J, Ward A, Weng Y, Chittaboina S, Zhuo R, Harrell

PM, Trinh YT, Zhang Q, Urbatsch IL, Chang G (2009) Структура

P-гликопротеина раскрывает молекулярную основу связывания полиспецифического лекарственного средства

. Science 323 (5922): 1718–1722

34 Choudhury HG, Tong Z, Mathavan I, Li Y, Iwata S, Zirah

S, Rebu at S, van Veen HW, Beis K (2014) Структура антибактериального препарата

пептид АТФ-связывающий кассетный транспортер в

- новое закрытое состояние наружу.Proc Natl Acad Sci USA

111 (25): 9145–9150

35 Dawson RJP, Locher KP (2006) Структура бактериального переносчика ABC коврика multid-

. Nature 443 (7108): 180–185

36 Nicklisch SC, Rees SD, McGrath AP, Gokirmak T, Bonito LT,

Vermeer LM, Cregger C, Loewen G, Sandin S, Chang G, Ham-

doun A (2016) Глобальные загрязнители морской среды ингибируют P-гликопротеин:

Уровни окружающей среды, ингибирующие эффекты и сокристаллическая структура.

Sci Adv 2 (4): e1600001

Содержание предоставлено Springer Nature, применяются условия использования.Права защищены.

У захваченного комплекса PPM1A-фосфопептид человека обнаружены структурные особенности, критические для регуляции активности протеинфосфатазы PPM.

Металл-зависимые протеинфосфатазы (PPM) эволюционно не связаны с другими серин / треониновыми протеинфосфатазами и характеризуются необходимостью добавления миллимолярных протеинов. концентрации ионов Mg 2+ или Mn 2+ для активности in vitro . Кристаллическая структура человеческого PPM1A (также известного как PP2Cα), первая определенная структура PPM, отображает два прочно связанных иона Mn 2+ в активном сайте и небольшой субдомен, называемый Flap, расположенный рядом с активным сайтом.Некоторые недавние кристаллические структуры бактериальных или растительных фосфатаз PPM выявили два прочно связанных иона металла и дополнительный третий ион металла в активном центре. Здесь кристаллическая структура каталитического домена PPM1A человека, PPM1A cat , в комплексе с циклическим фосфопептидом c (MpSIpYVA), циклизованным вариантом петли активации p38 MAPK (физиологический субстрат PPM1A), выявила три металлических ионы в активном центре. Комплекс PPM1A cat D146E – c (MpSIpYVA) подтвердил присутствие ожидаемого третьего иона металла в активном центре фосфатаз PPM метазоа.Биофизические и вычислительные методы показали, что образование комплексов приводит к немного более компактной конформации раствора за счет снижения конформационной гибкости субдомена Flap. Мы также наблюдали, что положение субстрата в активном центре позволяет растворителю доступ к лабильному третьему сайту связывания металла. Кинетика фермента PPM1A cat по отношению к фосфопептидному субстрату подтверждает случайный двухсубстратный механизм со значительным взаимодействием между связанным субстратом и лабильным ионом металла.Эта работа освещает структурные и термодинамические основы врожденного механизма регуляции активности фосфатаз PPM.

циклический пептид

Рентгеновская кристаллография

структура фермента

металлофермент

молекулярная динамика

белок серин / треонинфосфатаза (PSP)

передача сигнала

рекомендованное рентгеновское рассеяние

(SA

) статьиЦитирующие статьи (0)

Рекомендуемые статьи

Цитирующие статьи

Синдром MELAS - NORD (Национальная организация по редким заболеваниям)

TEXTBOOKS

Beers MH, Berkow R, eds.Руководство Merck, 17-е изд. Станция Уайтхаус, Нью-Джерси: Исследовательские лаборатории Мерк; 1999: 2478.

Fauci AS, et al, eds. Принципы внутренней медицины Харрисона, 14-е изд. Нью-Йорк, штат Нью-Йорк: McGraw-Hill, Inc; 1998: 2454, 2480.

Adams, RD, et al, eds. Принципы неврологии. 6-е изд. Нью-Йорк, штат Нью-Йорк: McGraw-Hill, Companies; 1997: 986.

Bennett JC, Plum F, ред. Сесил Учебник медицины. 20-е изд. Филадельфия, Пенсильвания: W.B. Saunders Co; 1996: 2167.

Behrman RE, изд. Учебник педиатрии Нельсона, 15-е изд.Филадельфия, Пенсильвания: W.B. Компания Сондерс; 1996: 1715, 1754.

Lyon G, et al, eds. Неврология наследственных болезней обмена веществ в детстве. 2-е изд. Нью-Йорк, штат Нью-Йорк: компании McGraw-Hill; 1996: 256.

Menkes JH, au, Pine JW, et al, eds. Учебник детской неврологии, 5-е изд. Балтимор, Мэриленд: Уильямс и Уилкинс; 1995: 852-853.

Scriver CR, et al, eds. Метаболические и молекулярные основы наследственных заболеваний. 7-е изд. Нью-Йорк, штат Нью-Йорк; McGraw-Hill Companies, Inc; 1995: 1562-1564

Buyse ML, ed.Энциклопедия врожденных пороков. Довер, Массачусетс: Научные публикации Блэквелла; Для: Центр информационных услуг по врожденным дефектам; 1990: 1195.

СТАТЬИ ИЗ ЖУРНАЛА

Deschauer M, Tennant S, Rokicka A, et al. MELAS связан с мутациями в гене POLG1. Неврология. 2007; 68 (20): 1741-2.

Scaglia F, Northrop JL. Митохондриальная миопатия, энцефалопатия, лактоацидоз с синдромом инсультоподобных эпизодов (MELAS): обзор вариантов лечения. Препараты ЦНС. 2006; 20 (6): 443-64.

Кога Й, Акита Й, Нисиока Дж. И др. L-аргинин улучшает симптомы инсультов при MELAS. Неврология. 2005; 64 (4): 710-2.

Sue CM, et al. Детская энцефалопатия, связанная с мутацией MELAS A3243G. J Pediatr. 1999; 134: 696-700.

Singh SK, et al. Синдром МЕЛАС. Индийский J Pediatr. 1999; 66: 621-625.

Deschauer M, et al. Митохондриальная мутация 3243 A-G (мутация MELAS), связанная с болезненной жесткостью мышц. Нервно-мышечное расстройство. 1999; 9: 305-307.

Abe K, et al. Эффект коэнзима Q10 у пациентов с митохондриальной миопатией, энцефалопатией, лактоацидозом и эпизодами инсульта (MELAS): оценка с помощью неинвазивной тканевой оксиметрии. J Neurol Sci. 1999; 162: 65-68.

Хауэлл Н., Митохондриальные болезни человека: ответы на вопросы и вопрошающие ответы. Int Rev Cytol. 1999; 186: 49-116.

Сайто С. и др. Эффекты дихлорацетата у трех пациентов с MELAS. Неврология. 1998: 50: 531-534.

Sperl W, Диагностика и лечение митохондриопатий.Wien Klin Wochenschr. 1997; 109: 93-99.

Ciafaloni E, et al. МЕЛАС: клинические особенности, биохимия и молекулярная генетика. Энн Нейрол. 1992; 31: 391-398.

Goto Y, et al. Митохондриальная миопатия, энцефалопатия, лактоацидоз и инсультоподобные эпизоды (MELAS): коррелятивное исследование клинических особенностей и мутации митохондриальной ДНК. Неврология. 1992; 42: 545-550.

Hirano M, et al. МЕЛАС: исходный случай и клинические критерии диагноза. Нервно-мышечное расстройство. 1992; 2: 125-135.

Палка Дж. Другой геном человека. Наука. 1990; 249: 1104-1105.

Дрисколл П.Ф. и др. Синдром МЕЛАС с участием матери и двоих детей. Arch Neurol. 1987; 44: 971-973.

ИЗ ИНТЕРНЕТА

Синдром Скаглии Ф. МЕЛАСА. eMedicine Journal. Последнее обновление: 03.05.10. Доступно по адресу http://emedicine.medscape.com/article/946864-overview. Доступно 9/10.

МакКусик В.А., изд. Интернет-Менделирующее наследование в человеке (OMIM). Балтимор. MD: Университет Джона Хопкинса; Запись №: 540000; Последнее обновление: 13.04.10.

Genetics Home Reference - США. База данных библиотеки медицины. http://ghr.nlm.nih.gov/condition/mitochondrial-encephalomyopathy-lactic-acidosis-and-stroke-like-episodes. Обновлено 06.11. Доступ 9/10.

ДиМауро С. и Хирано М. (Обновлено 14.10.10). МЕЛАС. В GeneReviews на Genetests: информационный ресурс по медицинской генетике (база данных онлайн). Авторские права, Вашингтонский университет, Сиэтл. 1997-2010 гг. Доступно на http://www.genetests.org. Дата обращения 10.11.

Активация Gαq модулирует аутофагию, стимулируя передачу сигналов mTORC1

Экспериментальная модель и подробные сведения о предмете

Крысы

Взрослых самцов крыс линии Wistar (200–250 г / 8 недель) кормили или голодали (4–48 ч) в соответствии с утвержденными учреждениями протокол исследования на животных.Всех крыс содержали в условиях, свободных от патогенов, и с ними обращались в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Медицинского колледжа Альберта Эйнштейна (Нью-Йорк, США).

Мыши

Взрослые (8–12 недель) самцы мышей с индуцируемым эндотелием Gαq / Gα11-дефицитным (Tie2-CreERT2; Gnaq f / f; Gna11 - / - [EC-q / 11-KO] 57,58 Использовалась , получавшая стандартную диету (стандартная диета, обеспечивающая 13% общих калорий из жиров, 67% из углеводов и 20% из белков; поддерживающая диета для грызунов 2014S, Teklad, Harlan, IN, USA).Поскольку в этих экспериментах мышей не лечили тамоксифеном, мы называем их мышами WT, поскольку они демонстрируют эндогенные уровни Gαq. Мышей содержали при 12-часовом цикле свет-темнота со свободным доступом к пище и воде и в определенных условиях, свободных от патогенов, при 20–24 ° C и влажности 55% ± 10%. Все процедуры экспериментов на животных соответствовали Европейским рекомендациям по уходу и использованию лабораторных животных (Директива 86/609) и были одобрены Этическими комитетами по экспериментам на животных нашего университета и Comunidad Autónoma de Madrid, Испания.Мы не использовали рандомизацию в наших исследованиях на животных. Мы не были закрыты для группы в наших исследованиях на животных.

Клеточные линии

Gαq / 11 WT и Gαq / 11 KO MEF были любезным подарком от доктора С. Офферманса (Институт исследований сердца и легких Макса Планка, Германия). MEF Atg5 WT и Atg5 KO были предоставлены доктором Н. Мидзусима (Токийский университет, Токио, Япония), а клетки DREADD-Gq-HEK-293 (женщина) - доктором Сильвио Гуткиндом (Университет Сан-Диего, Калифорния, США). ) 22 .Клетки СНО, сверхэкспрессирующие мускариновый рецептор ацетилхолина М3 (СНО-М3) (самки мышей), были любезным подарком от доктора А. Б. Тобина (Университет Глазго, Великобритания). Клеточные линии аутентифицировали с помощью анализа коротких тандемных повторов (STR) или штрих-кодирования ДНК и тестировали на загрязнение микоплазмами. MEF и клетки DREADD-Gq поддерживали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) (Gibco Life Technologies), клетки CHO-M3 в αMEM (Gibco Life Technologies) с добавлением 10% (об. / Об.) Фетальной бычьей сыворотки (Sigma-Aldrich). ) и 1 мМ l-глутамин, 50 МЕ / мл пенициллина, 50 мкг / мл стрептомицина.Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC) (мужчины) выращивали в среде 199 (Life Technologies, без NaHCO 3 ) с добавлением 2,2 г / л NaHCO 3 (pH 7,4), 1 мМ l-глутамина, 50 МЕ / мл пенициллина, 50 мкг / мл стрептомицина и 15% FBS. После первого пассажа в клетки добавляли 50 мкг / мл добавок для роста эндотелиальных клеток (Sigma-Aldrich) и 100 мкг / мл гепарина (Sigma-Aldrich). Все клеточные линии поддерживали при 37 ° C в увлажненной атмосфере с 5% CO 2 .

Подробности метода

Эксплантаты печени Ex vivo

Свеже собранные эксплантаты печени от накормленных мышей-самцов помещали в чашки с DMEM в присутствии или в отсутствие ингибитора Gαq / 11/14 (YM-254890, 40 мкМ), рапамицина ( 500 нМ) или гистамина (200 мкМ), а затем переносили в инкубатор при 37 ° C при 5% CO 2 на 1 час 59 . Эксплантаты гомогенизировали с использованием металлических шариков в Tissue Lyser (Qiagen, Hilden, Germany) 60 , а лизаты использовали для иммуноблот-анализа модуляции пути mTORC1.

Обработка клеток

Для модуляции аутофагии с помощью анализов истощения питательных веществ клетки поддерживали в 0,1% (об. / Об.) Бычьей сыворотке, сбалансированном солевом растворе Эрла (EBSS) (1 г / л d-глюкозы 2,2 г / л NaHCO 3 , 0,4 г / л KCl, 6,8 г / л NaCl, 0,6 г / л 2 NaPO 4 × 2H 2 O, 0,26 г / л CaCl 2 × 2H 2 O, 0,2 г / L MgSO 4 × 7H 2 O) или среды RPMI 1640 без аминокислот, фосфата натрия (US Biological R8999-04A) с добавлением диализованной сыворотки в течение указанных периодов времени.Эксперименты по восстановлению питательных веществ в клетках MEF проводили путем добавления увеличивающегося процентного содержания бычьей сыворотки или полной смеси аминокислот (раствор аминокислот MEM (50 ×)) (Sigma-Aldrich). Для анализа аутофагического потока клетки обрабатывали хлорохином (50 мкМ, Sigma-Aldrich) и комбинацией лизосомальных ингибиторов протеолиза хлорида аммония (20 мМ, Sigma-Aldrich) и лейпептина (100 мкМ, Sigma-Aldrich) во время указанное время. Для анализов деградации клетки обрабатывали указанными лизосомными ингибиторами и протеасомным ингибитором MG132 (0.1 мкМ, Sigma-Aldrich) в течение указанного времени. Клетки DREADD-Gq HEK-293 стимулировали клозапин-N-оксидом (CNO) (1 мкМ, Tocris) в разное время после недостатка сыворотки или аминокислот. Ингибирование Gαq / 11 осуществляли обработкой клеток специфическим ингибитором Gαq / 11/14 (YM-254890, 10 мкМ, Wako) в бессывороточной среде в течение 1 часа. Клетки CHO-M3 стимулировали карбахолом (10 мкМ, Sigma-Aldrich) в бессывороточной среде в течение указанных периодов времени. Чтобы проанализировать влияние каскадов mTORC1 или PI3K / AKT на модуляцию Gαq пути mTORC1, клетки DREADD-Gq HEK-293 обрабатывали mTOR (рапамицин, 500 нМ, Calbiochem) или AKT (AKTi-1/2, 1 мкМ, Tocris; Ref: 5773) ингибиторы.

Плазмидная ДНК и временные трансфекции

pcDNA3 была получена от Invitrogen, а кДНК Gαq-Q209L от Ресурсного центра кДНК S&T штата Миссури. КДНК Gαq и Gαq-R183C были получены из наших лабораторий (д-р А. М. Арагай, CSIC, Барселона, Испания). Конститутивно активный мутантный белок Gαq, не обладающий способностью взаимодействовать с PLCβ (Gαq-Q209L / R256A / T257A), был предоставлен доктором Р. Лином (Университет Стони Брук, Нью-Йорк, США). Мутантные белки Gαq, у которых отсутствует способность взаимодействовать с GRK2 (Gαq-T257E, W263D, Y261F), были подарком Dr.Т. Козаса (Токийский университет, Япония). Мутанты Gαq области связывания PB1 (Gαq E234A, D236A, D243A, E245A, E234 / E245-AA, Gq-R183C-E234 / E245-AA) были созданы в нашей лаборатории с использованием набора для сайт-направленного мутагенеза QuickChange® (Stratagene) следуя инструкциям производителя 29 . КДНК GRK2, GRK2-K220R, GRK2-D110A были подарены доктором Дж. Л. Беновичем (Онкологический центр Киммела, США). КДНК домена GRK2-RH 61 была создана в нашей лаборатории. Конструкция HA-p62 была предоставлена ​​Dr.Э. Кэмпбелл (Иллинойский университет в Чикаго, США). GFP-Flag-PB1-p62 предоставлен доктором Б. Берк (Университет Рочестера, Нью-Йорк, США). mCherry-GFP-LC3 (Addgene-84572, доктор Н. Мидзусима, сконструированный Т. Кайзука (Токийский университет, Япония)). кДНК для лентивирусной конструкции pMD2.G, pSD.44 и psPAX2 (Addgene-12259, 12252, 12260, соответственно) доктора Р. Игго (Университет Сент-Эндрюс, Эдинбург, Великобритания). Желаемые комбинации конструкций кДНК трансфицировали с использованием метода Lipofectamine 2000 (Life Technologies), следуя инструкциям производителя.

Клонирование и мутагенез

psd44.Gq-wt и psd44.Gq-E234-E245-AA были созданы в нашей лаборатории из psd44.GqQL (Addgene-46826, доктор А. Мариотти) с использованием сайта-направленного мутагенеза QuickChange Lightning Комплект, следуя инструкциям производителя (Agilent Technologies, 210 518). Мутация конститутивной активации была устранена с помощью следующих праймеров для ПЦР: GqQ209L_FW: GAT GTA GGG GGC CTA AGG TCA GAG AGA и GqQ209L_REV: TCT CTC TGA CCT TAG GCC CCC TAC ATC. Впоследствии, Gαq Pb1-связывающие область мутации были выполнены с помощью следующих праймеров: GqE234A_FW: CTAGTAGCGCTTAGTGCATATGATCAAGTTCTCGTGG и GqE234A_REV: CCACGAGAACTTGATCATATGCACTAAGCGCTACTAG, GqD236A_FW: GTA GCG СТТ АГТ GAA ТАТ GCG САА ГТТ СТС GTG GAG ТСА, GqD236A_REV: ТГА СТС САС ГАГ AAC TTG CGC ATA TTC ACT AAG CGC TAC (Sigma-Aldrich).Вся информация о праймерах была включена в дополнительную таблицу 1.

Создание стабильных клеточных линий

Для создания MEF, стабильно экспрессирующих мутанты области связывания WT или Gαq PB1 на фоне Gαq / 11 KO, сначала psd44.Gq-wt и psd44.Gq-E234-E245-AA ДНК-конструкции трансфецировали вместе с psPAX2 и pMD2.G в упаковывающих клетках HEK-293-T с использованием Metafectene (Bointex) в соответствии с инструкциями производителя для получения лентивирусных частиц. Лентивирусную очистку и трансдукцию Gαq / 11 KO MEFs проводили 62 .Все генерированные линии клеток MEF, psd.44.Gq-wt (Gαq / 11 KO-rGq MEF) и pds44.Gq-EEAA (rGq-EEAA MEFs) MEF поддерживали при обработке пуромицином 1 мкг / мл.

Генерация стабильных клеточных линий MEF mCherry-GFP-LC3

mCherry.GFP-LC3 стабильные сверхэкспрессирующие клетки получали в Gαq / 11 WT и Gαq / 11 KO MEF. Клетки высевали в шестилуночный планшет за день до трансдукции. Затем получали смесь 2х полибренов, добавляя к клеткам 0,5 мл среды + 1 мкл исходного раствора полибрена (10 мг / мл) вместе с 0.5 мл супернатанта вируса mCherry-GFP-LC3, полученного по тому же протоколу, что и для лентивирусных векторов psd.44. Затем, через 24 ч после трансдукции, к клеткам добавляли 1 мл обычной среды без удаления вирусного супернатанта. Через 48–72 ч клетки проверяли на наличие положительного сигнала GFP с помощью флуоресцентной микроскопии и высевали для эксперимента. В зависимости от типа клеток эти стабильные клеточные линии использовали до 3–4 пассажа.

Анализы иммунопреципитации

Клетки лизировали PD-буфером с низким лизисом детергента (50 мМ Трис, pH 7.5, 150 мМ NaCl, 1 мМ NP-40, 0,25% (мас. / Об.) Дезоксихолат натрия, 1 мМ EGTA pH 8,0, 1 мМ NaF, ингибиторы протеаз) через 24–48 ч после трансфекции и осветлили центрифугированием. Иммунопреципитацию проводили с помощью конъюгированных с агарозой антител против НА (Santa Cruz, F-7, # sc-7392-AC). Анализы эндогенной иммунопреципитации выполняли путем инкубации 0,5 мкг / мл антитела p62 (GP62-G, Progen), антитела mTOR (7C10, Cell Signaling), антитела Raptor (24C12, Cell Signaling) или антитела Gαq (E-17, Santa Cruz ) или контрольный IgG (нормальный кроличий IgG sc-2027, Санта-Крус) с 5 мг клеточных лизатов в присутствии BSA (1 мг / мл) с последующей повторной инкубацией с рекомбинантным белком G-Sepharose ™ 4B (Invitrogen, 101243).

SDS-PAGE и иммуноблот-анализ

Буфер PD с добавлением ингибиторов протеаз и 1 мМ PMSF использовали для получения клеточных лизатов. Концентрацию белка измеряли с использованием реагентов DC Protein Assay Reagents A, B и S (Bio-Rad). Лизаты белков разделяли на 8–15% гелях SDS-PAGE, переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Bio-Rad) и блокировали в течение 1 ч в 5% BSA – TBS. После инкубации с первичными антителами (в течение ночи) и вторичными антителами (1 ч) мембраны были промыты и проанализированы с использованием ECL (усиленная хемиллюминесценция) от Amersham Pharmacia Biotech и пленок AGFA или системы инфракрасной визуализации LI-COR Odyssey.Полосы иммунореактивности количественно оценивали с помощью лазерной денситометрии с помощью сканера Biorad GS-900 и с использованием предоставленной компанией Bio-Rad Image Lab 5.2 или с помощью программного обеспечения, включенного в систему инфракрасной визуализации Odyssey. Вертикальные линии на вестерн-блотах указывают на соседние полосы, которые происходят из одного и того же геля, но не примыкают друг к другу. Первичные антитела, используемые при вестерн-блоттинге с разведениями, были следующими: AKT (Cell signaling # 9272; 1: 1000), p-AKT (S473) (Cell Signaling # 4060; 1: 1000), p-AKT (T308) (Cell Signaling). # 9275; 1: 1000), AMPKα (Cell Signaling # 2532; 1: 1000), p-AMPK (T172) (Cell signaling # 2535; 1: 1000), Tubulin (Santa Cruz # SC-53030; 1: 1000) , Erk1 (C-16, Santa Cruz # SC-16; 1: 1000), Erk2 (C-14, Santa Cruz # SC-154; 1: 1000), pERK1 / 2 (Thr202 / 204) (Cell Signaling # 9101 , 1: 1000), GAPDH (Abcam # ab8245; 1: 5000), GFP (Santa Cruz # SC-9996; 1: 1000), Gq / 11 (C19, Santa Cruz # SC-392; 1: 1000), Gq (E-17, Санта-Крус № SC-393; 1: 1000), GRK2 (c-15, Санта-Крус № SC-562; 1: 1000), HA (F-7, Санта-Крус № SC-7392; 1: 1000), LAMP1 (1D4B, банк гибридом; 1: 3000), LC3B (Cell Signaling # 2775; 1: 1000), LC3B (NB100-2220, Novus Biologicals) mTOR (7C10, Cell signaling # 2983; 1: 1000), p62 (Progen, GP62; 1: 1000), p62 (BML-PW9860, Enzo; 1: 1000) p70-S6K (Cell Signaling # 2708; 1: 1000), p-p70-S6K (Thr389) (Cell Signaling # 9205). ; 1: 1000), Раптор (2 4C12) (Cell signaling, # 2280; 1: 1000), рибосомный белок S6 (Cell Signaling # 2217; 1: 2000), рибосомный белок p-S6 (Ser240 / 244) (Cell Signaling # 2215; 1: 1000), убиквитин (Sigma-Aldrich # U5379; 1: 50), ULK1 (D8H5, Cell Signaling # 8054; 1: 1000), p-ULK1 (Ser-757) (Cell Signaling # 6888; 1: 1000).Вторичные антитела, связанные с HRP (Nordic Immunology): GAR / IgG (h + L) / PO (16461, 1: 50 000) и GAM / IgG (H + L) / PO (6513, 1: 50 000) и вторичные антитела, конъюгированные с инфракрасные красители (LI-COR): морская свинка 800 нм (926-32411, 1:15 000), кролик 800 нм (926-32211, 1: 15 000) или 680 нм (926-68021, 1: 15 000) и мышь 800 нм (926-32212, 1:15 000) или 680 нм (926-68022, 1:15 000).

Иммунофлуоресценция

Клетки, предварительно засеянные в покровные стекла, предварительно покрытые полилизином 1 × (Sigma), фиксировали в 4% параформальдегиде (15 мин).Гашение альдегида проводили путем добавления 10 мМ глицина в PBS в течение 5 минут и повышения проницаемости с помощью 0,5% Triton X-100 в PBS дважды (10 минут) с последующим блокированием 1% BSA в течение 1 часа при комнатной температуре. Клетки устанавливали с помощью Fluoromount-G-Dapi (Southern Biotech). Образцы изображений были получены с использованием конфокального лазерного микроскопа LSM710 (Zeiss) при увеличении × 63. Программное обеспечение Image J (NIH) использовалось для общего анализа изображений и манипуляций. Визуализацию репортера mCherry-GPF-LC3 проводили с использованием микроскопии высокого содержания.Клетки помещали в 96-луночный планшет со стеклянным дном и после инкубации в течение желаемого времени фиксировали 4% параформальдегидом и снимали изображения с помощью высокочувствительного микроскопа (система Operetta, Perkin Elmer). Количественный анализ выполняли с помощью программного обеспечения производителя. минимум в 2000 ячеек (~ 9 полей). Общее количество аутофагических вакуолей (АВ, аутофагосомы плюс аутолизосомы) оценивали по количеству mCherry-позитивных точек, тогда как точки, положительные по GFP и mCherry, оценивали как аутофагосомы (APG).Аутофагический поток рассчитывали как количество только флуоресцентных точек mCherry (аутолизосом, AL) на клетку.

Количественная оценка распределения лизосом

Многоканальные флуоресцентные изображения для ДНК (Dapi), крысиного антитела против Lamp1 (с использованием Alexa 555, козьего антитела против крысиного IgG, ThermoFisher в качестве вторичного антитела) и индикатора клеток (Alexa 488, козий антимышиный IgG1, ThermoFisher) получали в конфокальном микроскопе Zeiss LSM780, оборудованном объективом × 63 Oil (NA = 1,4) (MIP-IBMB). Клетки были отобраны вслепую с использованием зеленого канала, и для каждой был выполнен Z-стек с размером вокселя 50 × 50 × 500 нм.

Перед количественной оценкой была получена проекция максимальной интенсивности для каждого изображения клетки, а границы клетки и ядра были извлечены путем соответственно ручной и автоматической сегментации. На красном канале фон был вычтен с использованием алгоритма катящегося шарика (радиус = 30 пикселей), а затем было проанализировано распределение лизосом с использованием оригинального сценария ImageJ / Fiji, разработанного для этой цели, доступного на https://github.com/ Платформа MolecularImagingPlatformIBMB / ringIntensityDistribution. 63 Принимая в качестве эталона границу клетки, каждая клетка была разделена на четыре концентрических кольца эквивалентной площади, при этом каждое кольцо изометрически центрировано в центроиде ядра. Затем измеряли плотность интенсивности флуоресценции на кольцо и нормализовали по отношению к общей плотности интенсивности клетки (подробности см. В Приложении Рис. S4). Для каждого состояния было измерено не менее 30 клеток.

Измерения xCELLigence

Инструмент RTCA SP системы xCELLigence (Roche Applied Science) отслеживает изменения индекса клеток (показатель прикрепления клеток к планшету), который, как было показано, эффективно коррелирует с изменениями пролиферации, адгезии и жизнеспособности 64 .Для оценки пролиферации клетки высевали в 96-луночный сенсорный планшет с золотым электродом (E-планшеты 16) и контролировали каждые 15 мин в течение различного времени (50–100 ч) в 10% FBS. Значения клеточного индекса (CI) нормализовали через 7 ч после посева (чтобы исключить фазу адгезии). Рост клеток рассчитывали как наклон (часы-1) кривой индекса клеток в течение всего 50 часов. Ни в одном случае не было гибели клеток из-за чрезмерного слияния, что подтверждается осмотром планшета под микроскопом.

Связывание аннексина V / 7-AAD

Для количественного измерения апоптоза использовали набор для обнаружения апоптоза аннексина V PE (BD-Bioscience).MEF Gαq / 11 WT и Gαq / 11 KO при 90% конфлюэнтности голодали в течение 24 часов с 0,1% FBS, после чего клетки ресуспендировали в буфере для связывания аннексина V (0,1 M HEPES / NaOH (pH 7,4), 1,4 M NaCl , 25 мМ CaCl 2 ). Образцы анализировали методом проточной цитометрии на проточном цитометре BD FacsCalibur (BD-Bioscience). Чтобы определить стадию апоптоза различных популяций клеток, 7-AAD- и аннексин V-положительные клетки определяли с помощью программного обеспечения CellQuest Pro версии 4.0 (BD-Bioscience) и анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo (v7.6.5 и v10.0.8r1). Клетки, обработанные стауроспорином (2,5 мкМ, 2 часа) или ультрафиолетовым облучением (2 часа), считались апоптотическим (аннексин V-положительный) и некротическим (7-AAD-положительный) контролями соответственно.

Обнаружение аутофагии в живых клетках с помощью проточной цитометрии

Аутофагическую активность сыворотки, аминокислот или дефицитных по глюкозе клеток WT и Gαq / 11 KO MEF контролировали с помощью набора Cyto-ID Autophagy Detection Kit (Enzo Life Sciences) в соответствии с инструкции производителя. Обработка хлорохином (50 мкМ, Sigma-Aldrich) в течение последних 4 часов сывороточного голодания или в течение 4 часов перед удалением аминокислот или глюкозы позволила количественно оценить аутофагический поток.Образцы анализировали методом проточной цитометрии на проточном цитометре BD FacsCalibur (BD-Bioscience), а данные анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo.

Просвечивающая электронная микроскопия и морфометрический анализ

Для обычного ПЭМ, Gαq / 11 WT и Gαq / 11 KO MEF, выращенные на 10% FBS, фиксировали in situ в течение 2 часов при комнатной температуре смесью 4% PFA и 2% глутаральдегида. в 0,1 М фосфатном буфере Соренсена (pH 7,4). После нескольких промывок клетки соскабливали и собирали в том же буфере, центрифугировали и осадки клеток обрабатывали для заделки в эпоксидную смолу TAAB-812 (TAAB Laboratories) в соответствии со стандартными процедурами 65 .Ультратонкие срезы (70–80 нм) образцов клеток окрашивали 2% раствором уранилацетата в воде и цитрате Рейнольдса свинца и исследовали при 80 кВ в электронном микроскопе Jeol JEM-1010 (Токио, Япония). Снимки были сделаны цифровой камерой TemCam-F416 (4 K × 4 K) (TVIPS). Аутофагические вакуоли идентифицировали с использованием установленных критериев 59 . Аутофагические вакуоли (везикулы размером 0,5 мкм) были классифицированы как аутофагосомы, если они соответствовали двум или более из следующих критериев: двойные мембраны (полные или, по крайней мере, частично видимые), отсутствие рибосом, прикрепленных к цитозольной стороне мембраны, плотность просвета, подобная цитозоль и идентифицируемые органеллы или области органелл в их просвете.Везикулы аналогичного размера, но с одинарной мембраной (или <40% мембраны, видимой как двойная), плотность просвета ниже, чем окружающий цитозоль, или множественные одиночные ограниченные мембраной везикулы, содержащие легкий или плотный аморфный материал, были классифицированы как аутофаголизосомы. Полные вакуоли аутофагии состояли из суммы аутофагосом и аутолизосом. Созревание вакуолей аутофагии рассчитывали как процент аутолизосом и аутофагосом от общего числа вакуолей аутофагии.

Выделение субклеточных фракций

Аутофагические вакуоли выделяли из печени крысы с использованием прерывистого градиента плотности метризамида 66 . Вкратце, после гомогенизации печень подвергали последовательному дифференциальному центрифугированию для отделения фракции, обогащенной компартментами, связанными с аутофагией, и митохондриями. Эту фракцию помещали в нижнюю часть прерывистого (трехслойного) градиента метризамида, и после центрифугирования митохондрии оставались внизу, тогда как фракция, обогащенная аутофагосомами, восстанавливалась в верхней полосе и в автолизосомах во второй полосе сверху.Фракция, обогащенная лизосомами, также извлекается из третьей полосы градиента сверху. После обширной промывки 0,25 М сахарозой фракции систематически анализируют на маркеры белка и ферментативную активность лизосом 67 . Цитозольные фракции получали центрифугированием в течение 1 ч при 100000 × г супернатанта, полученного после отделения фракции, обогащенной митохондриями, лизосомами.

Количественная оценка и статистический анализ

Количественная оценка

Полосы иммунореактивности были количественно определены с помощью лазерной денситометрии на сканере Biorad GS-900 и с использованием de Bio-Rad, предоставленного Image Lab 5.2 (https://www.bio-rad.com) или программным обеспечением Application Software Version 3.0 LI-COR (Biosciences), включенным в систему инфракрасной визуализации Odyssey.

Данные проточной цитометрии анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo V7.6.5 и V10.0.8r1 (https://www.flowjo.com).

Программное обеспечение Image J v1.53j (NIH) использовалось для общего анализа изображений и манипуляций (https://imagej.nih.gov/ij/index.html).

Excel (v1905) использовался для количественной оценки анализа данных.

Статистика

Все данные представлены как средние значения ± SEM указанного числа независимых экспериментов, указанных в легенде к рисунку.Мы определили статистическую значимость в случаях одиночных сравнений с помощью двустороннего непарного теста Стьюдента t и в случаях множественных сравнений с помощью одностороннего дисперсионного анализа с последующим тестом Бонферрони, как указано в легенде каждого рисунка. Вся статистика была получена с помощью программы GraphPad Prism 8 (https://www.graphpad.com/). Различия считались значимыми, когда * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 и **** P <0.0001.

Сводка отчетов

Дополнительная информация о дизайне исследований доступна в Сводке отчетов по исследованиям природы, связанной с этой статьей.

Daikin AKZ ** 6 - Блок охлаждения масла

Описание AKZ106 AKZ206 AKZ306
Максимальная холодопроизводительность 3.8 / 4,2 кВт 5,9 / 6,2 кВт 8,7 / 9,5 кВт
Главная цепь источника питания (50/60 Гц) Трехфазный 200/200. 220 В Трехфазный 200/200. 220 В Трехфазный 200/200. 220 В
Цепь управления источником питания (50/60 Гц) Однофазный 200/200. 220 В Однофазный 200/200. 220 В Однофазный 200/200.220 В
Мощность блока питания (200/220 В) 2,3 / 2,6 кВА 4,7 / 5,0 кВА 9,7 / 10,3 кВА
Рабочий объем масляного насоса (50/60 Гц) 24/29 л / мин 34,5 / 41,5 л / мин 34,5 / 41,5 л / мин
Компрессор (герметичного роторного типа) 0,75 кВт, 2П 1.5 кВт, 2П 2,2 кВт, 2П
Испаритель Корпус и катушка типа Корпус и катушка типа Корпус и катушка типа

Конденсатор

Змеевик с поперечными ребрами типа Змеевик с поперечными ребрами типа Змеевик с поперечными ребрами типа
Вентилятор Пропеллерный вентилятор Пропеллерный вентилятор Пропеллерный вентилятор
Диапазон применения комнатной температуры 5-45 ° С 5-45 ° С 5-45 ° С
Диапазон применения температуры масла в баке 5-50 ° С 5-50 ° С 5-50 ° С
Вязкость масла 4 - 200 мм² / с 4 - 200 мм² / с 4 - 200 мм² / с
Внешние размеры (В x Ш x Г) 1020 × 360 × 450 мм 1220 × 430 × 500 мм 1200 × 560 × 620 мм
Масса 70 кг 105 кг 150 кг

Для этого продукта на данный момент нет обзоров

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

  • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки вашего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
  • Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
  • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
  • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
  • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в cookie-файлах может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Плейотропные эффекты для Паркина и LRRK2 при реакциях лепры 1 типа и болезни Паркинсона

% PDF-1.7 % 104 0 объект > эндобдж 105 0 объект > поток doi: 10.1073 / pnas.1

5116application / pdf

  • Плейотропные эффекты для Паркина и LRRK2 при реакциях лепры 1 типа и болезни Паркинсона
  • 10.1073 / pnas.1

    5116 http://dx.doi.org/10.1073/pnas.1

    51162019-07-18false10.1073/pnas.1

    5116

  • www.pnas.org
  • www.pnas.org
  • 10.1073 / pnas.1

    51162019-07-18false

  • www.pnas.org
  • 2021-09-13T13: 37: 52-07: 002021-09-13T13: 37: 52-07: 002019-07-18T03: 06: 39 + 05: 30Arbortext Advanced Print Publisher 9.1.510 / Вт UnicodeAcrobat Distiller 10.0.0 (Windows) uuid: eb8bea7b-1dd1-11b2-0a00-e40827bd7200uuid: eb8bea8d-1dd1-11b2-0a00-880000000000 конечный поток эндобдж 93 0 объект > эндобдж 35 0 объект > эндобдж 160 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / Properties> / Shading> / XObject >>> / Rotate 0 / Thumb 154 0 R / Type / Page >> эндобдж 74 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / XObject >>> / Rotate 0 / Thumb 75 0 R / Type / Page >> эндобдж 147 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / XObject >>> / Rotate 0 / Thumb 117 0 R / Type / Page >> эндобдж 161 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / XObject >>> / Rotate 0 / Thumb 165 0 R / Type / Page >> эндобдж 59 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / XObject >>> / Rotate 0 / Thumb 60 0 R / Type / Page >> эндобдж 135 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / XObject >>> / Rotate 0 / Thumb 136 0 R / Type / Page >> эндобдж 162 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / XObject >>> / Rotate 0 / Thumb 168 0 R / Type / Page >> эндобдж 30 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / XObject >>> / Rotate 0 / Thumb 31 0 R / Type / Page >> эндобдж 126 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / XObject >>> / Rotate 0 / Thumb 127 0 R / Type / Page >> эндобдж 211 0 объект > поток HWnH} WQ, $ ͹g $ `ƃCmN (RKRQ_UͦHI15ɾTW: u? G- ^ 6g> {~ sG (: ϞW ٳ 7 [cBY $ 4SD '\ l \ 8ZicXC $ qX ^ 08 | ݓ X, _чl] ~, vm {u + x :: 1ply + nyRk.

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *